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中华神经医学杂志 2019年第1期18卷 33-38页

作者：赵彦芬赵峰刘鹏森毛轲河南省中医院河南中医药大学第二附属医院麻醉科郑州450002

目的研究泛素特异性蛋白酶49(USP49)和FK506结合蛋白51(FKBP51)在糖尿病神经病理性痛(DNP)大鼠脊髓背角中的表达及作用。方法 SD雄性大鼠通过高糖高脂饮食饲养和腹腔注射1%链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型并按照随机数字表法分为DNP... 详细信息

目的研究泛素特异性蛋白酶49(USP49)和FK506结合蛋白51(FKBP51)在糖尿病神经病理性痛(DNP)大鼠脊髓背角中的表达及作用。方法 SD雄性大鼠通过高糖高脂饮食饲养和腹腔注射1%链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型并按照随机数字表法分为DNP组、对照短发夹RNA(shRNA)组和USP49沉默组,每组10只。3组大鼠分别鞘内注射生理盐水、Ad-scrambled shRNA(3×10^8 PFU/mL)、Ad-USP49-shRNA(3×10^8 PFU/mL)。另取10只正常大鼠作为对照组,不做任何处理。分别于造模前1 d、造模后1 d、7 d、鞘内注射后1、3、7 d测定大鼠热缩足潜伏期(TWL)和机械缩足反应阈(MWT),并检测背角神经元USP49、FKBP51、糖皮质激素受体α(GRα)mRNA和蛋白的表达水平。结果 (1)造模前1 d,4组大鼠TWL差异无统计学意义(P>0.05)。鞘内注射后3 d、7 d,USP49沉默组TWL明显长于DNP组,短于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)造模前1 d,4组大鼠MWT差异无统计学意义(P>0.05)。鞘内注射3 d、7 d后,USP49沉默组MWT明显高于DNP组,低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)与DNP组比较,USP49沉默组USP49 mRNA、FKBP51 mRNA表达显著下降,GRα mRNA表达显著上升,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)与DNP组比较,USP49沉默组USP49蛋白、FKBP51蛋白表达明显降低,GRα蛋白明显上升,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论特异性沉默脊髓背角神经元USP49表达可改善DNP大鼠热痛敏反应和机械痛敏反应,其机制可能与USP49介导的FKBP51蛋白去泛素化有关。

关键词：糖尿病神经病理性痛机械缩足反应阈热缩足潜伏期泛索特异性蛋白酶49 FK506结合蛋白51 糖皮质激素受体α

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糖尿病神经病理性痛大鼠脊髓背角结构可塑性及二甲双胍对其影响的体视学研究

糖尿病神经病理性痛大鼠脊髓背角结构可塑性及二甲双胍对其影响的...

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作者：何壹娜川北医学院

学位级别：硕士

目的:观察糖尿病神经病理性痛（Painful diabetic neuropathy,PDN）大鼠脊髓背角结构可塑性变化及二甲双胍（Metformin,Met）对其的影响。方法:用链脲佐菌素联合高脂饮食建立2型糖尿病大鼠模型,筛选出现痛阈过敏的大鼠建立PDN模型,成模... 详细信息

目的:观察糖尿病神经病理性痛（Painful diabetic neuropathy,PDN）大鼠脊髓背角结构可塑性变化及二甲双胍（Metformin,Met）对其的影响。方法:用链脲佐菌素联合高脂饮食建立2型糖尿病大鼠模型,筛选出现痛阈过敏的大鼠建立PDN模型,成模后随机分为2组:模型组（PDN组）,治疗组（Met组）。同时设置正常对照组（C组）。Met组用***-1.d-1干预4周,4周后灌注固定切取脊髓组织。按等距随机抽样原则分别得到整段和L5脊髓节段组织块,每个组织块取3-5张切片用于染色显示神经元、突触素前终末、星形胶质细胞（Astrocyte,AS）。采用光学体视框估计整段脊髓和L5节段脊髓背角内上述粒子的数量。结果:1,在整段脊髓背角,各组间突触数无显著性差异;2,在L5节段脊髓背角,与C组相比,PDN组突触数增加,Met组无显著性差异;PDN组及Met组AS数增加。与PDN组相比,Met组突触数减少,Met组AS数无显著性差异。结论:Met缓解PDN大鼠痛觉过敏,可能与Met抑制L5节段脊髓背角内突触数量增加有关。

关键词：糖尿病神经病理性痛中枢敏化突触可塑性脊髓背角体视学星形胶质细胞

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Notch信号通路介导小胶质细胞激活在米诺环素对糖尿病神经病理性痛的保护作用机制研究

Notch信号通路介导小胶质细胞激活在米诺环素对糖尿病神经病理性...

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作者：杨程天津医科大学

学位级别：博士

背景:糖尿病神经病理性痛（DNP）是糖尿病患者最常见的一种并发症,通常表现为麻木、烧灼感、刺痛、触痛、自发痛、痛觉过敏等,多发生于肢体远端尤其呈对称性。据统计,大约有50%以上的糖尿病患者最终发展为DNP,在各种神经性痛占10%左右... 详细信息

背景:糖尿病神经病理性痛（DNP）是糖尿病患者最常见的一种并发症,通常表现为麻木、烧灼感、刺痛、触痛、自发痛、痛觉过敏等,多发生于肢体远端尤其呈对称性。据统计,大约有50%以上的糖尿病患者最终发展为DNP,在各种神经性痛占10%左右。由于疼痛和感觉异常常导致患者感到不适、痛苦和焦虑,部分患者伴有抑郁和自杀倾向,同时糖尿病足截肢也成为非创伤性截肢的主要原因,因此DNP严重影响患者生活质量,加重家庭和社会负担,成为最亟待解决的并发症。目前DNP发病机制尚不清楚,临床通常行对症支持治疗但对疼痛缓解有限且不能阻止病情进展。近年来对DNP的研究主要涉及高血糖应激、物质代谢紊乱、氧化应激、炎症反应等机制,尚未取得突破性研究成果。本课题组前期研究发现小胶质细胞活化、细胞凋亡等因素可能参与了DNP的发生和发展,同时对广谱抗菌药物米诺环素研究发现其除抗菌作用以外还具有神经保护作用,可能成为治疗DNP潜在新型药物。第一部分:观察米诺环素对糖尿病大鼠神经病理性痛的影响。方法:通过腹腔注射STZ 65mg·kg-1建立糖尿病模型,在STZ诱导后腹腔注射米诺环素40mg·kg-1和80mg·kg-1,观察STZ诱导前（T1）、诱导后2w（T2）、4w（T3）、8w（T4）各组大鼠一般情况和血糖变化并测定行为学指标热痛阈（TFL、TWL）和机械痛阈（MWT）、神经功能指标（NCV）,第8周后处死大鼠行脊髓组织病理切片采用免疫荧光染色观察小胶质细胞标记物Iba-1的阳性细胞分布。结果:通过单次腹腔注射STZ成功建立糖尿病大鼠模型,且糖尿病组在诱导2w后TFL、TWL、MWT、NCV明显较正常组低（P<0.01）,痛敏症状明显并持续至第8w;小胶质细胞标记物Iba-1呈高表达,经米诺环素治疗后（Con+Mino40组和Con+Mino80组）可明显增高TFL、TWL、MWT、NCV和降低脊髓背角小胶质细胞Iba-1表达水平（P<0.05）。结论:米诺环素可减轻DNP大鼠疼痛行为学变化、改善周围神经传导速度和抑制小胶质细胞活化,且米诺环素治疗DNP的剂量40mg·kg-1优于80mg·kg-1。第二部分:米诺环素通过抗炎、抗氧化、抗凋亡机制减轻糖尿病神经痛。方法:将Con组、DM组、Con+Mino组、DM+Mino组大鼠饲养8周后处死取脊髓腰膨大采用比色法测定氧化应激和脂质过氧化反应指标SOD、MDA和亚硝酸盐浓度,ELISA法测定炎症因子TNFα、IL-1水平,免疫组化法观察脊髓背角神经元凋亡水平。结果:与正常对照组相比DNP大鼠脊髓组织SOD表达明显减低,MDA、亚硝酸盐、TNF-α和IL-1明显增高且脊髓背角神经元出现大量凋亡阳性细胞（P<0.01）;经米诺环素治疗的DM+Mino组大鼠较DM组出现SOD表达增加,MDA、亚硝酸盐、TNF-α和IL-1减低,并且脊髓背角神经元凋亡减少。结论:氧化应激、炎症反应和细胞凋亡参与了DNP发生和发展,米诺环素可在抑制小胶质细胞活化的基础上抑制氧化应激反应、减轻炎症反应、减低细胞凋亡,对DNP有神经保护作用。第三部分:Notch信号通路在米诺环素改善糖尿病神经痛中的作用。方法:给予DNP模型大鼠小胶质细胞抑制剂米诺环素和（或）Notch信号通路抑制剂DAPT后观察各组大鼠行为学变化（TFL、TWL、MWT）;采用western blot法和免疫荧光法测定各组大鼠Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1表达量。结果:DAPT组和Mino组大鼠TFL、TWL、MWT均较DM组大鼠好转（P<0.05）,而且DAPT+Mino组行为学改善最为明显（P<0.01）,western blot结果进一步证实给予小胶质细胞抑制剂米诺环素和Notch信号通路抑制剂DAPT后蛋白表达明显减少（P<0.01）。结论:米诺环素可在抑制Notch信号通路活化基础上对糖尿病神经病理性痛发挥治疗作用。综上所述,米诺环素可针对糖尿病神经病理性痛的氧化应激、脂质过氧化反应、炎症反应以及神经元凋亡等损害机制发挥改善神经病理性痛作用,提高神经痛阈值和改善周围神经传导速度作用,其作用机制可能是通过抑制小胶质细胞活化而现的。Notch信号通路介导了脊髓小胶质细胞的激活,因此米诺环素可能是通过抑制小胶质细胞的Notch信号通路发挥对糖尿病神经病理性痛的保护作用。

关键词：糖尿病神经病理性痛米诺环素小胶质细胞 Notch信号通路细胞凋亡炎症反应氧化应激

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钩吻素子盐酸盐抗糖尿病神经病理性痛的基底外侧杏仁核星形胶质细胞作用机制

钩吻素子盐酸盐抗糖尿病神经病理性痛的基底外侧杏仁核星形胶质细...

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作者：卢靖珊福建医科大学

学位级别：博士

糖尿病神经病理性痛(diabetic neuropathic pain,DNP)是糖尿病常见的慢性并发症,其特点是持续疼痛,难以治疗。目前DNP的主要治疗策略是对症治疗。但是,大多数镇痛药仅能部分缓解疼痛且伴有多种副作用,提示亟待研发高效低毒的新型镇痛药... 详细信息

糖尿病神经病理性痛(diabetic neuropathic pain,DNP)是糖尿病常见的慢性并发症,其特点是持续疼痛,难以治疗。目前DNP的主要治疗策略是对症治疗。但是,大多数镇痛药仅能部分缓解疼痛且伴有多种副作用,提示亟待研发高效低毒的新型镇痛药物。钩吻素子生物碱为钩吻植物中所提取的高效低毒的有效成分,我们前期研究显示钩吻素子盐酸盐具有抗DNP作用,但其作用机制有待于阐释。近年来,星形胶质细胞在神经病理性痛中的作用备受关注。新的证据显示,星形胶质细胞参与神经病理性痛的形成和发展。神经损伤后,星形胶质细胞活化,进而释放大量的炎症介质,不仅导致其本身进一步激活,并促进神经元的敏化,造成疼痛慢性迁移,经久不愈。因此,星形胶质细胞可能成为开发治疗神经病理性痛(包括DNP)药物的新靶标。杏仁核(amygdala)属于边缘系统中重要的组成部分,由多个大小不等的亚核群构成,中央杏仁核(central nucleus,Ce A)与基底外侧杏仁核(basolateral amygdala,BLA)是其较为重要的核团。目前已知BLA在认知、记忆、注意力控制中具有重要作用,近年来有研究进一步发现BLA是调控疼痛的高级中枢,参与痛情绪的调制。此外,BLA不仅能够被动地接受皮层下多种信息的传入,同时还能通过与其他核团相互投射,介导伤害性信息的传递。因此,推断BLA在痛觉调制与情绪行为的调节中起到重要作用。但对于BLA如何对疼痛进行调节却知之甚少,BLA星形胶质细胞活化与DNP发病机制之间是否存在因果关系仍有待确定。鉴此,本文以DNP大鼠为研究对象,综合利用药理学、神经形态、细胞与分子生物学、化学遗传学(design receptors exclusively activated by design drugs,DREADDs)等多学科技术手段,以BLA为观测点、星形胶质细胞活化为切入点,从神经炎症角度,深入系统探索钩吻素子抗DNP效应的靶向BLA星形胶质细胞作用机制,为发展原创候选新药钩吻素子奠定理论和实验基础,也为防治DNP新药研发提供新的药物作用靶标与作用途径。主要研究内容如下:1钩吻素子对DNP模型大鼠机械痛阈及痛情绪的作用建立链脲佐菌素(streptozocin,STZ)致DNP模型大鼠,实验动物随机分为对照组、模型组及其钩吻素子盐酸盐(koumine hydrochloride,KM)处理组(0.28mg/kg、1.4 mg/kg和7.0 mg/kg)和加巴喷丁阳性药对照组(100 mg/kg)。STZ注射后第22 d起,灌胃给予相应药物或溶媒干预,一天一次,连续7天。以大鼠的机械刺激痛阈值及其在旷场和高架十字迷宫中的行为学变化为指标,观察KM对DNP模型大鼠机械痛敏及痛情绪的治疗作用。结果显示,KM具有显著的抗DNP效应,作用呈剂量依赖性。2钩吻素子抗DNP效应与其调节BLA星形胶质细胞活化的关系在DNP模型大鼠上,对DNP发生发展过程中BLA胶质细胞的动态变化进行分析。实验动物分别于STZ注射前及STZ注射后3 d、7 d、14 d、21和28 d测机械痛阈,随后灌注取脑组织,切片后行免疫荧光组织化学染色。结果表明,在DNP发生发展过程中,BLA星形胶质细胞呈动态活化,且与DNP大鼠机械痛阈变化呈高度负相关,Pearson相关系数为-0.693(P<0.001),提示DNP的发生发展与BLA星形胶质细胞的活化密切相关。为观察KM对DNP大鼠BLA星形胶质细胞活化的影响,进行星形胶质细胞标记物GFAP的免疫组织化学染色。结果显示,KM可显著抑制BLA星形胶质细胞的活化,且该作用与KM对DNP大鼠机械痛敏的缓解作用呈高度负相关,相关系数为-0.782(P<0.001),提示抑制BLA星形胶质细胞的活化可能是KM发挥抗DNP效应的作用机制之一。3化学遗传学调控BLA星形胶质细胞对大鼠机械痛及痛情绪的作用为探讨BLA星形胶质细胞在DNP中的调控作用,采用DREADDs特异调控DNP大鼠或正常大鼠的BLA星形胶质细胞。结果表明,抑制BLA星形胶质细胞的活化可显著改善DNP模型大鼠的机械痛敏,有效缓解慢性疼痛导致的焦虑样行为;而激活BLA星形胶质细胞可诱发正常大鼠的机械痛敏现象。本文首次发现了BLA星形胶质细胞对DNP具有调节作用,可能为治疗DNP的重要靶标之一。为研究BLA星形胶质细胞是否影响BLA局部神经元的活性,采用免疫组织化学法检测各组大鼠神经元活化标记物c-Fos的表达。结果表明,DNP大鼠BLA区c-Fos大量表达,调节BLA星形胶质细胞的活性可影响c-Fos的表达。免疫荧光双重染色结果显示,绝大多数表达c-Fos的神经元与兴奋性神经元标记物Ca MKII共标,只有少数与抑制性神经元标记物GAD67共标,表明BLA星形胶质细胞的活

关键词：钩吻素子糖尿病神经病理性痛基底外侧杏仁核星形胶质细胞活化炎症介质化学遗传学技术

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miR-145下调Nav 1.8对糖尿病神经病理性痛大鼠痛阈的影响

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临床麻醉学杂志 2018年第3期34卷 291-295页

作者：颜洁沈洁韩翠翠汤永峰沈晓凤南京医科大学附属妇产医院麻醉科 210004 南京医科大学附属妇产医院病理科 210004

目的观察微小RNA-145(miR-145)对糖尿病神经病理性痛大鼠痛阈的影响,并探讨其可能机制。方法取正常大鼠12只作为对照组(N组),糖尿病神经痛模型制备成功的SD大鼠36只,随机分为三组:糖尿病神经痛组(D组)、糖尿病神经痛-空载组(DN组)和糖... 详细信息

目的观察微小RNA-145(miR-145)对糖尿病神经病理性痛大鼠痛阈的影响,并探讨其可能机制。方法取正常大鼠12只作为对照组(N组),糖尿病神经痛模型制备成功的SD大鼠36只,随机分为三组:糖尿病神经痛组(D组)、糖尿病神经痛-空载组(DN组)和糖尿病神经痛-miR-145过表达组(agomiR-145组),每组12只。N组和D组大鼠鞘内分别注射等剂量生理盐水10μl,DN组大鼠鞘内注射阴性对照病毒(10μl,1×106TU/ml),agomiR-145组大鼠鞘内注射agomiR-145(10μl,1×106TU/ml)。于鞘内注药前1 d和注药后1、3、7、14 d测定四组大鼠机械缩足痛阈(MWT)和热缩足反射潜伏期(TWL)。然后采用RT-PCR法检测大鼠背根神经节(DRG)中miR-145mRNA相对表达量,免疫荧光检测大鼠背根神经节Nav1.8阳性细胞荧光相对强度。荧光素酶报告实验验证miR-145的靶基因。结果注药前1 d D组、DN组和agomiR-145组MWT明显低于、TWL明显短于N组(P<0.05);注药后3、7、14 d agomiR-145组MWT明显高于D组和DN组(P<0.05);注药后7、14 d agomiR-145组大鼠TWL明显长于D组和DN组(P<0.05)。D组和DN组DRG中miR-145 mRNA相对表达量明显低于N组和agomiR-145组,电压门控钠离子通道1.8(Nav1.8)阳性细胞明显多于N组和agomiR-145组(P<0.05)。荧光素酶报告实验验证miR-145作用于Nav 1.8 3'-非翻译区并调控Nav1.8的表达。结论 miR-145通过下调背根神经节Nav 1.8表达缓解糖尿病大鼠机械痛敏和热痛敏。

关键词：糖尿病神经病理性痛微小RNA-145 电压门控钠离子通道1.8 背根神经节

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前额叶皮质星形胶质细胞对糖尿病神经病理性痛的调控作用

前额叶皮质星形胶质细胞对糖尿病神经病理性痛的调控作用

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作者：艾丽婧福建医科大学

学位级别：硕士

目的:课题组前期研究发现,链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱导的糖尿病神经病理性痛(diabetic neuropathic pain,DNP)模型大鼠前额叶皮质(prefrontal cortex,PFC)星形胶质细胞显著活化,促炎细胞因子TNF-α、IL-1β水平显著上调。但由于... 详细信息

目的:课题组前期研究发现,链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱导的糖尿病神经病理性痛(diabetic neuropathic pain,DNP)模型大鼠前额叶皮质(prefrontal cortex,PFC)星形胶质细胞显著活化,促炎细胞因子TNF-α、IL-1β水平显著上调。但由于传统药理学方法无法实现星形胶质细胞特异性调控,其与DNP发病机制之间的因果关系依旧不清楚。本实验在STZ诱导的DNP模型大鼠及野生型大鼠上,采用化学遗传学技术特异性调控PFC星形胶质细胞及神经元活性,分析调控星形胶质细胞活性对促炎细胞因子及其神经元活性的影响,明确PFC星形胶质细胞在DNP中的作用及其调控机制。方法:本实验在STZ诱导的DNP模型大鼠上,借助脑立体定位注射技术,通过腺相关病毒分别将载有星形胶质细胞GFAP启动子或神经元CaMKⅡ启动子的抑制性受体hM4Di表达在大鼠双侧PFC上。在野生型大鼠上,借助脑立体定位注射技术,通过腺相关病毒分别将载有星形胶质细胞GFAP启动子或神经元CaMKⅡ启动子的兴奋性受体hM3Dq表达在大鼠双侧PFC上。3 w后,病毒表达稳定,腹腔注射外源性配体氯氮平-N-氧化物(Clozapine N-oxide,CNO),测定机械痛阈,观察特异性调控星形胶质细胞或神经元活性对机械痛的作用。行为学实验结束后,脑组织冰冻切片,荧光显微镜下确认病毒感染部位。采用荧光免疫组织化学法检测大鼠前额叶皮质GFAP荧光强度及Fos蛋白表达情况,酶联免疫吸附法测定大鼠PFC促炎细胞因子TNF-α及IL-1β的水平。结果:(1)化学遗传学技术特异性抑制DNP大鼠PFC星形胶质细胞活性后,行为学结果显示,STZ诱导的机械痛敏显著改善;荧光免疫组织化学结果显示,与对照组相比,模型组大鼠PFC星形胶质细胞呈活化状态,GFAP荧光强度增强,并且Fos蛋白表达显著上调;抑制PFC星形胶质细胞活性后,其细胞形态趋向静息状态,GFAP荧光强度减弱,Fos蛋白表达显著下降;ELISA结果显示,与对照组相比,模型组组大鼠PFC促炎细胞因子TNF-α与IL-1β水平均显著升高;抑制PFC星形胶质细胞活性后TNF-α与IL-1β水平显著下降;(2)化学遗传学技术特异性抑制DNP大鼠PFC神经元活性后,行为学结果显示,STZ诱导的机械痛敏显著缓解;荧光免疫组织化学结果显示,与对照组相比,模型组大鼠PFC区域Fos蛋白表达显著上调,星形胶质细胞呈活化状态,GFAP荧光强度增强;抑制PFC神经元活性后Fos蛋白表达显著下调,并且GFAP荧光强度减弱、细胞形态趋向静息状态;(3)化学遗传学技术激活野生型大鼠PFC星形胶质细胞后,行为学结果显示,大鼠出现机械性触发痛;荧光免疫组织化学结果显示,对照组大鼠PFC星形胶质细胞形态趋向静息状态,GFAP荧光强度较低,Fos蛋白极少表达,激活大鼠PFC星形胶质细胞后,细胞呈活化状态,GFAP荧光强度增强,并且Fos蛋白表达显著上调;ELISA结果显示,对照组促炎细胞因子TNF-α与IL-1β水平较低,激活大鼠PFC星形胶质细胞后TNF-α与IL-1β水平显著升高;(4)化学遗传学技术激活野生型大鼠PFC神经元活性,行为学结果显示,大鼠出现机械性触发痛;荧光免疫组织化学结果显示,对照组大鼠PFC极少表达Fos蛋白,星形胶质细胞形态趋向静息状态,GFAP表达较低,激活PFC神经元后大鼠Fos蛋白表达显著上调,并且GFAP荧光强度增强,星形胶质细胞呈活化状态。结论:***星形胶质细胞活化诱导糖尿病大鼠产生糖尿病神经病理性痛;***星形胶质细胞活化后可能通过上调促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的表达,促进神经元活化,从而起到对DNP的调控作用。

关键词：化学遗传学技术糖尿病神经病理性痛星形胶质细胞神经元前额叶皮质 TNF-α IL-1β

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钩吻素子通过抑制基底外侧杏仁核小胶质细胞调控糖尿病神经病理性痛的机制研究

钩吻素子通过抑制基底外侧杏仁核小胶质细胞调控糖尿病神经病理性...

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作者：熊芳芳福建医科大学

学位级别：硕士

目的:糖尿病神经病理性痛(Diabetic Neuropathic Pain,DNP)是糖尿病的常见慢性并发症,它的发病机制复杂,治疗极其困难。目前大多在脊髓水平对DNP的发病机理进行研究,对于脊髓以上水平的发病机理研究少有报道。课题组前期研究发现,杏仁... 详细信息

目的:糖尿病神经病理性痛(Diabetic Neuropathic Pain,DNP)是糖尿病的常见慢性并发症,它的发病机制复杂,治疗极其困难。目前大多在脊髓水平对DNP的发病机理进行研究,对于脊髓以上水平的发病机理研究少有报道。课题组前期研究发现,杏仁核参与了DNP的调控,并有研究表明基底外侧杏仁核(basolateral amygdala,BLA)在慢性疼痛引起的痛感觉和痛情绪中发挥重要作用。然而,BLA小胶质细胞在DNP中的作用,尚未可知。钩吻素子(koumine,KM)是一种高效低毒的有效成分,具有多种药理作用。我们前期研究发现KM具有显著的抗DNP效应,且其抗DNP的镇痛效应可能与抑制大鼠脊髓背角小胶质细胞活化有关。然而,钩吻素子抗DNP效应与调节BLA小胶质细胞活性之间的相关性尚不明确。综上,本研究采用化学遗传学(design receptors exclusively activated by design drugs,DREADDs)和药理学等研究手段,探究BLA小胶质细胞活化在DNP发生发展中的作用,探讨钩吻素子抗DNP效应与BLA小胶质细胞活化的相关性,以期深化理解DNP的发病机制,有助于阐释钩吻素子治疗DNP的神经生物学机制,为防治DNP新药研发提供新的药物作用靶标与途径。方法:(1)通过STZ诱导大鼠DNP模型,检测分析在DNP发生发展中BLA胶质细胞活化、大鼠机械痛阈和痛情绪的动态变化规律。(2)采用DREADDs方法,在大鼠双侧BLA注入特异激活或抑制小胶质细胞活性的病毒,观察调控BLA小胶质细胞活性对机械痛阈、痛情绪及炎症介质的影响。(3)DNP大鼠灌胃给予钩吻素子,通过行为学观察钩吻素子的镇痛效应及其缓解痛情绪的作用;行为学实验结束后,采用免疫组织化学法及ELISA法,观察钩吻素子对小胶质细胞及其生成释放炎症介质表达的影响。结果:(1)在DNP的发展进程中,DNP大鼠在成模7天痛阈值即显著低于对照组,并逐渐降低至21后转入持续稳定的机械痛敏状态;慢性疼痛会导致DNP大鼠出现焦虑样行为,具体表现为模型组大鼠在旷场中心区域的活动路程百分比显著下降、在高架十字迷宫开放臂中的运动路程以及进入频次百分比显著下降及在明暗箱中白箱的活动时间及进入次数显著减少;免疫组织化学结果显示,造模后第3天,小胶质细胞数量和绿色荧光强度即显著上调,在第7天活化最为显著,并持续活化至28天,小胶质细胞在DNP的发展进程中经历了从“静息”表型到“激活”表型的变化。(2)大鼠小胶质细胞的化学遗传学方法研究结果显示,r AAV 6mCX3CR1-CRE-WPRE-h GH p A与r AAV 9-Ef1α-DIO-m Cherry-WPRE-h GH p A病毒以1:2的比例混合后,病毒所携带的m Cherry标签能够在BLA区大量表达,并与小胶质细胞标志物Iba-1产生大量共标,且能够最大程度诱导大鼠产生痛敏状态并诱导小胶质细胞大量活化,病毒特异性表达于BLA区小胶质细胞,具有高度特异性。该方法能够特异调控BLA小胶质细胞的活性,表明大鼠小胶质细胞化学遗传学方法成功建立。(3)化学遗传学特异性抑制DNP大鼠BLA小胶质细胞后显著缓解了DNP大鼠的痛敏状态,并有效改善大鼠的焦虑样行为;免疫组织化学结果显示,抑制BLA小胶质细胞活性显著下调了其细胞数量及荧光强度,同时也显著下调了炎症介质TNF-α、IL-6和CX3CL1的表达。这些结果提示,化学遗传学特异抑制DNP大鼠BLA小胶质细胞的活化可产生镇痛和抗焦虑作用。(4)化学遗传学特异激活正常大鼠BLA小胶质细胞后诱发大鼠产生了机械痛敏现象;免疫组织化学结果显示,激活BLA小胶质细胞活性显著上调了其细胞数量及荧光强度,同时显著上调了炎症因子TNF-α的表达。化学遗传学特异性激活正常大鼠BLA小胶质细胞的活化可诱导大鼠产生机械痛敏状态,从另一角度直接论证BLA小胶质细胞活化参与了DNP的发生发展。(5)钩吻素子能够有效缓解DNP大鼠机械痛敏状态,其治疗作用具有剂量和时间依赖性;此外,钩吻素子能够有效改善慢性疼痛诱导的焦虑样行为;免疫组织化学结果显示,与模型组相比,钩吻素子各剂量组小胶质细胞的荧光强度和数量均显著减少;ELISA结果显示,与模型组相比,钩吻素子治疗显著下调了炎症介质TNF-α、IL-6和CX3CL1的表达。结果提示,钩吻素子具有显著的抗DNP作用,其抗DNP效应可能与其抑制BLA小胶质细胞活化有关。结论:(1)成功建立化学遗传学技术在体调控BLA小胶质细胞活性的方法;(2)BLA小胶质细胞活化可能参与DNP发生发展的调控,可能是防治DNP潜在的靶标之一;(3)KM抗DNP的效应可能与其抑制BLA小胶质细胞活化相关。

关键词：钩吻素子糖尿病神经病理性痛基底外侧杏仁核小胶质细胞炎症介质化学遗传学技术

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星形胶质细胞在糖皮质激素诱发糖尿病神经病理性痛中的作用

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解剖科学进展 2015年第4期21卷 358-360页

作者：葛晓光左中夫辽宁医学院人体解剖学教研室辽宁锦州121001

目的探讨星形胶质细胞在糖皮质激素诱发糖尿病神经病理性痛中的作用及可能的机制。方法利用链脲佐菌素诱导SD大鼠糖尿病模型,鞘内置管。实验分3组,对照组,糖尿病组(不给予RU486,糖皮质激素受体阻断剂),RU486组(糖尿病大鼠鞘内注射RU486)... 详细信息

目的探讨星形胶质细胞在糖皮质激素诱发糖尿病神经病理性痛中的作用及可能的机制。方法利用链脲佐菌素诱导SD大鼠糖尿病模型,鞘内置管。实验分3组,对照组,糖尿病组(不给予RU486,糖皮质激素受体阻断剂),RU486组(糖尿病大鼠鞘内注射RU486)。4周后检测大鼠血糖及痛阈变化,免疫组化检测脊髓背角星形胶质细胞形态学变化,Western blot检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP,星形胶质细胞活性标志物)及磷酸化Jun氨基末端激酶(p-JNK)表达变化。结果与对照组相比,糖尿病组及RU486组大鼠血糖显著升高(<0.01)P,糖尿病组脊髓背角星形胶质细胞胞体增大、突起延长,明显活化,而RU486组变化不明显。与对照组相比,糖尿病组痛阈降低,GFAP及p-JNK在脊髓表达减少(均<0.01),RU48P6组接近对照组(P>0.05)。结论 P糖皮质激素通过血糖非依赖机制活化星形胶质细胞,激活JNK信号通路参与DNP的发生。

关键词：糖尿病神经病理性痛星形胶质细胞糖皮质激素 p-JNK SD大鼠

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脑内星形胶质细胞在糖尿病神经病理性痛中的作用及钩吻素子作用靶标

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中国药理学与毒理学杂志 2023年第7期37卷 536页

作者：俞昌喜卢靖珊杨澜熊伯军陈坚凌倩福建医科大学药学院

传统观点认为神经病理性痛（NP）在脊髓及脊髓以上水平的调制主要与神经元的中枢敏化有关。然而，目前临床糖尿病神经病理性痛（DNP）治疗药物以神经元为作用靶标，只能暂时阻断神经痛觉信息传递而短时缓解疼痛，疗效不佳。DNP发生机制... 详细信息

传统观点认为神经病理性痛（NP）在脊髓及脊髓以上水平的调制主要与神经元的中枢敏化有关。然而，目前临床糖尿病神经病理性痛（DNP）治疗药物以神经元为作用靶标，只能暂时阻断神经痛觉信息传递而短时缓解疼痛，疗效不佳。DNP发生机制及其药物治疗靶标亟待探索，诱发中枢敏化的上游因素，特别是星形胶质细胞的异常活化日益受到关注。钩吻素子（KM）具有显著的抗DNP作用，但其脑内作用靶标有待研究。本课题组优先采用化学遗传学技术在体特异性调控脑内痛相关核团星形胶质细胞活性。结果表明，激活基底外侧杏仁核（BLA）、中脑导水管周围灰质腹外侧部（vlPAG）及丘脑腹后外侧核（VPL）星形胶质细胞可诱导NP样痛敏症状；抑制上述核团星形胶质细胞活性可缓解DNP痛敏。KM可拮抗化学遗传学技术诱导的BLA,vlPAG和VPL星形胶质细胞活化并缓解NP样痛敏症状；可协同增强化学遗传学调节产生的BLA,vlPAG和VPL星形胶质细胞活性抑制及DNP痛敏的改善。上述提示，脑内痛相关核团内星形胶质细胞活化可导致DNP的发生发展，星形胶质细胞可能是KM抗DNP作用的重要靶标。

关键词：星形胶质细胞钩吻素子糖尿病神经病理性痛脑内痛相关核团化学遗传学

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加巴喷丁对糖尿病神经病理痛大鼠背根神经节Nrf2表达的影响

引用

中华内分泌代谢杂志 2018年第11期34卷 951-954页

作者：樊宽鲁苗蓓徐州医科大学第二附属医院内分泌科 221006 徐州医科大学附属医院消化科

目的研究糖尿病神经病理痛大鼠背根神经节(DRG)Nrf2表达的变化,探讨加巴喷丁(gabapentin,GBP)减轻大鼠糖尿病神经病理痛的机制。方法雄性SD大鼠60只,随机分为4组:对照组(C组)、模型组(DNP组)、生理盐水+DNP组(SC+DNP组)和加巴喷丁+DNP组... 详细信息

目的研究糖尿病神经病理痛大鼠背根神经节(DRG)Nrf2表达的变化,探讨加巴喷丁(gabapentin,GBP)减轻大鼠糖尿病神经病理痛的机制。方法雄性SD大鼠60只,随机分为4组:对照组(C组)、模型组(DNP组)、生理盐水+DNP组(SC+DNP组)和加巴喷丁+DNP组(GBP+DNP组,n=15)。观察STZ注射前1d及注射后3、7、10、14、21、28d测定缩足反射机械刺激阈值(PWMT)和缩足反射热辐射潜伏期(PWTL),SC+DNP组和GBP+DNP组于STZ注射15d起分别腹腔注射生理盐水或加巴喷丁50mg/kg,1次/d,连续7d,并于21、28d测定缩足反射机械刺激阈值和缩足反射热辐射潜伏期。行为学测试完成后选择21d大鼠用免疫荧光和Western印迹方法检测大鼠DRG中Nrf2的表达。结果与C组比较,DNP组和SC+DNP组出现PWMT降低,PWTL缩短,DRG中Nrf2的表达减少(P<0.05);与DNP组比较,GBP+DNP组PWMT升高,PWTL延长,DRG中Nrf2的表达明显增加(P<0.05),SC+DNP组差异无统计学意义(P>0.05)。结论加巴喷丁可能通过上调DNP大鼠DRG中Nrf2表达,从而减轻大鼠DNP。

关键词：加巴喷丁糖尿病神经病理性痛背根神经节 Nrf2

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