目的本课题从髓海不足、痰瘀互结的角度探讨阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)病机,阐明加减薯蓣丸治疗AD的理论依据;并结合行为学检测、免疫荧光染色、蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR、透射电镜扫描等方法,从线粒体动力学、线粒体自噬、线粒体生物合成的角度,探讨加减薯蓣丸对APP/PS1双转基因小鼠神经元氧化应激水平的影响,明确加减薯蓣丸改善APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力的作用机制。方法1.理论探讨:从病位、病机、致病因素等方面探讨中医对AD的认识;从加减薯蓣丸的组方分析、前期研究、单药现代药理作用三个部分明确了加减薯蓣丸治疗AD的理论基础。2.实验研究:将APP/PS1双转基因小鼠30只随机分为模型组、多奈哌齐组、加减薯蓣丸组,每组10只,另设10只C57BL/6J小鼠作为正常组。其中多奈哌齐组按0.45mg·kg·d剂量的盐酸多奈哌齐溶液给药,加减薯蓣丸组予以加减薯蓣丸煎剂10 g·kg·d剂量灌胃,正常组与模型组则每日予以生理盐水10 m L·kg·d灌胃,日一次,共35d。药物干预结束后,用Morris水迷宫实验和新物体识别实验检测小鼠学习记忆能力。行为学检测结束后,灌注取脑切片用于原位末端标记检测(TUNEL)观察海马神经元凋亡情况;新鲜海马组织用于生化检测、JC-1染色、戊二醛固定后透射电镜观察、Western Blot及实时荧光定量PCR检测。生化检测海马神经元ROS、SOD、ATP水平;JC-1染色检测海马线粒体膜电位水平;透射电镜观察海马CA1区线粒体超微结构;Western Blot检测海马线粒体PINK1、Parkin、p62、LC3II蛋白表达水平;实时荧光定量PCR检测海马线粒体SIRT1、PGC-1α、MFN-1、MFN-2、OPA-1、FIS-1、DRP-1、FOXO1、PINK1、Parkin m RNA表达水平。结果***水迷宫实验:在定位航行实验中,每组小鼠逃避潜伏期随训练天数缩短。与正常组比较,模型组小鼠逃避潜伏期明显增长(P<0.05);经加减薯蓣丸与多奈哌齐干预后,与模型组比较,APP/PS1小鼠逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)。在空间探索实验中,与正常组比较,模型组小鼠穿越平台次数及目标象限滞留时间占比显著减少(P<0.05);与模型组比较,加减薯蓣丸组、多奈哌齐组小鼠穿越平台次数及目标象限滞留时间占比明显增多(P<0.05),同时结果显示,加减薯蓣丸组较多奈哌齐组改善作用明显,但差异无统计学意义。2.新物体识别实验:在识别阶段,与正常组比较,模型组小鼠相对分辨指数明显降低,识别新物体能力减弱(P<0.05);与模型组比较,加减薯蓣丸组、多奈哌齐组能显著升高小鼠相对分辨指数,提升识别新物体能力(P<0.05)。***染色:各组小鼠海马神经元凋亡细胞呈红色荧光,细胞核呈蓝色荧光。与正常组比较,模型组小鼠海马CA1区神经元凋亡细胞明显增多(P<0.05);与模型组比较,给予加减薯蓣丸干预后,加减薯蓣丸组凋亡细胞显著减少(P<0.05)。4.生化检测:与正常组比较,模型组、各干预组小鼠海马神经元中ROS水平显著升高(P<0.01),SOD、ATP水平显著降低(P<0.01);与模型组比较,各干预组小鼠ROS水平显著降低(P<0.01),SOD、ATP水平显著升高(P<0.05);与多奈哌齐组比较,加减薯蓣丸组小鼠SOD、ATP水平升高显著(P<0.05)。***-1染色:以H1-UR/H1-LR比值显示,与正常组比较,模型组、多奈哌齐组、加减薯蓣丸组小鼠线粒体膜电位明显降低(P<0.01);与模型组比较,加减薯蓣丸组小鼠线粒体膜电位有显著提升(P<0.01)。6.透射电镜扫描:与正常组比较,模型组小鼠海马线粒体形态严重改变,呈扭曲长条状或外形肿大,嵴排列絮乱、扭曲、稀疏、甚至消失,基质混浊、不均匀,给予加减薯蓣丸与多奈哌齐干预后,线粒体形态及各结构改善明显,其中加减薯蓣丸组线粒体改善程度最佳。*** Blot检测:与正常组比较,模型组及各干预组小鼠海马PINK1蛋白表达均增多(P<0.05),模型组、多奈哌齐组小鼠海马Parkin蛋白表达减少(P<0.05),p62、LC3II蛋白表达增多(P<0.01);与模型组比较,经多奈哌齐、加减薯蓣丸干预后小鼠PINK1、Parkin蛋白表达显著增多(P<0.01),p62、LC3II蛋白表达显著减少(P<0.05,P<0.01);多奈哌齐组与加减薯蓣丸组之间差异无统计学意义。8.实时荧光定量PCR检测:与正常组比较,模型组小鼠海马FIS-1、DRP-1、OPA-1、MFN-1、MFN-2、SIRT1、PGC-1α、FOXO1、PINK1、Parkin m RNA表达均减少(P<0.05)
O-GlcNAc糖基化被认为是一种“营养和应激传感器”,其广泛参与细胞中的信号传导、转录、翻译、细胞分裂、新陈代谢和应激敏感性的生物学进程。本团队的前期研究结果表明,O-GlcNAc糖基化修饰在冷应激过程中作为“营养和应激感受器”对骨骼肌葡萄糖代谢、胰岛素敏感性和细胞凋亡具有调控作用。并且,O-GlcNAc糖基化信号缺失将直接干预葡萄糖代谢和线粒体质量控制。然而,O-GlcNAc糖基化对线粒体质量控制的调节机制尚不明确。本研究以SIRT1为靶点,对O-GlcNAc糖基化在骨骼肌线粒体质量控制过程中的机制进行探究。阐明O-GlcNAc糖基化在骨骼肌线粒体质量调控过程中的作用。明确O-GlcNAc糖基化对骨骼肌线粒体质量调控过程中的影响并鉴定其作用靶点。研究并揭示O-GlcNAc糖基化通过靶蛋白调控骨骼肌线粒体质量控制的机制。本研究对野生型（wild type,WT）小鼠和骨骼肌特异性敲除Ogt（skeletal muscle specific knockout Ogt,Ogt m KO）小鼠骨骼肌组织进行电镜观察和组织学染色。结果显示,与WT小鼠相比,Ogt m KO小鼠骨骼肌出现骨骼肌形态结构异常和线粒体结构异常等现象。同时,与WT小鼠相比,Ogt m KO小鼠骨骼肌中SIRT1的表达水平显著下调。为了进一步探究SIRT1在Ogt m KO小鼠骨骼肌线粒体调控过程中的作用机制,本研究通过给予小鼠冷刺激处理,使小鼠处于能量动员状态。实验结果显示,小鼠骨骼肌缺失O-GlcNAc糖基化信号,造成骨骼肌形态结构异常,线粒体脊断裂,自噬相关蛋白、线粒体自噬相关蛋白、线粒体分裂/融合蛋白的表达水平显著上调,线粒体功能异常等线粒体质量调控异常的现象,并且冷刺激加速了O-GlcNAc糖基化缺失诱导的线粒体质量调控异常现象。同时SIRT1的表达受到抑制,然而O-GlcNAc糖基化是否直接作用于SIRT1来参与上述过程尚不清楚。接下来,本研究在体外实验中以C2C12细胞为实验对象,给予C2C12细胞32℃亚低温处理,使其处于能量动员状态,对上述机制进行探究。实验结果显示亚低温造成C2C12细胞自噬和线粒体自噬相关蛋白表达水平显著上调,以及线粒体结构和功能异常,然而抑制O-GlcNAc糖基化信号则加重了C2C12细胞的线粒体质量调控异常现象,增强O-GlcNAc糖基化信号后,上述线粒体质量调控异常现象得到明显的缓解和改善。然而,在亚低温条件下,O-GlcNAc糖基化修饰的下游靶蛋白尚不明确。本研究对亚低温条件下C2C12细胞SIRT1的表达水平进行检测,并对SIRT1的O-GlcNAc糖基化修饰进行检测。结果显示,与对照组相比,亚低温组C2C12细胞NAD+含量、SIRT1酶活、Sirt 1 m RNA、SIRT1的蛋白表达水平均显著下调;O-GlcNAc糖基化被抑制后上述指标进一步下调,而增强O-GlcNAc糖基化信号上述指标显著上调。免疫共沉淀法、代谢标记法和s WGA法检测结果均显示,C2C12细胞内源性的SIRT1与OGT存在相互作用。将SIRT1-His重组蛋白和OGT-GST重组蛋白共孵育结果显示,外源性的SIRT1与OGT亦存在相互作用。Yin OYang 1.2系统预测结果显示,SIRT1在160（Thr）和161（Ser）位点可发生O-GlcNAc糖基化修饰。本研究构建了SIRT1野生型质粒和SIRT1修饰位点的突变体质粒,分别转染至C2C12细胞中,以评估SIRT1在低温环境下对骨骼肌细胞的调控机制。结果显示,亚低温条件下过表达SIRT1后C2C12细胞的线粒体功能异常现象、氧化应激水平得到明显的缓解,自噬相关蛋白、线粒体自噬激相关蛋白、线粒体分裂/融合相关蛋白的表达水平显著下调;转染SIRT1-E2mut-AA质粒并没有缓解亚低温造成C2C12细胞的上述异常现象。本研究将体内实验与体外实验相结合,以SIRT1为靶点,对O-GlcNAc糖基化修饰在小鼠骨骼肌线粒体质量控制过程中的调控机制进行探究。体内实验结果表明,小鼠骨骼肌敲除Ogt基因介导的O-GlcNAc糖基化信号缺失,通过抑制SIRT1的表达,造成骨骼肌纤维化和衰老程度增加,糖原累积减少,线粒体功能显著下降,自噬和线粒体自噬增加,氧化应激水平增加;Ogt m KO小鼠骨骼肌的上述现象在冷刺激条件下表现的更为严重。体外实验结果表明,亚低温条件下,C2C12细胞线粒体结构和功能异常,自噬、线粒体自噬和氧化应激水平显著上调;然而抑制O-GlcNAc糖基化信号,加速了亚低温诱导的C2C12细胞的线粒体结构和功能异常,增强O-GlcNAc糖基化信号改善了C2C12细胞线粒体结构和功能异常现象。亚低温条件下,Sirt 1 m RNA表达水平、SIRT1蛋白表达水平和SIRT1的去乙酰
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