目的:自体脂肪移植(Autologous fat grafting,AFG)的体积保留率较低,往往需要多次抽脂,多次移植。脂肪组织的冻存保护可以减少抽脂次数,提高治疗效率,实现“一次抽脂,多次移植”的可能。然而,目前缺乏合适的脂肪组织冻存保护剂(Cryoprotective agent,CPA)。本研究联合海藻糖(Trehalose,Tre)、甘油(Glycerol,Gly)和二甲双胍(Metformin,Met)组成新型冻存液(即TGM冻存液),探究其对脂肪组织的冻存保护效果。方法:(1)探究Met的抗氧化能力、细胞毒性作用及其适宜的冻存浓度:从获取的人体脂肪组织体外分离培养得到P3代脂肪来源干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs),用含不同浓度(0/1/2/4/8 m M)Met的培养液在低氧条件下培养2h,通过活性氧(Reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒评估ROS水平;通过细胞增殖和划痕实验评估不同浓度Met对ADSCs的毒性作用;用不同浓度Met冻存脂肪组织,2周后检测脂肪组织的血管基质组分(Stromal vascular fraction,SVF)细胞凋亡率。(2)探究TGM冻存液对脂肪组织的体外冻存效果:分别用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline,PBS)、1 M Tre+20%Gly(简称TG冻存液)、1 M Tre+20%Gly+2 m M Met(简称TGM冻存液)、10%二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)+90%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)(简称DF冻存液)作为冻存液冻存脂肪组织,2周后复温解冻,通过脂肪组织的大体外观、扫描电镜和SVF细胞凋亡率评估TGM冻存液的效果。(3)探究经TGM冻存液冻存后的脂肪组织的移植治疗价值:将经PBS、TG、TGM、DF冻存2周后的脂肪组织分别移植到裸鼠背部两侧皮下,移植1个月后取材,称量移植物的体积和重量,计算移植物保留率;通过HE和免疫荧光染色评估移植物病理组织结构;CD31免疫组织化学染色评估移植物血管化程度。(4)本研究所有实验数据经过正态性检验后,采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)比较组间差异,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:(1)ROS水平检测结果显示:与其他组相比,2m M组的ADSCs细胞ROS水平(29.20±1.73)最低,P<0.05;细胞增殖和划痕实验结果显示:从24h开始,2 m M组的细胞增殖能力明显高于其他组,但与1 m M组相比没有统计学差异,在24h时,8 m M组明显抑制了ADSCs迁移,P<0.05;SVF细胞凋亡率结果显示:2 m M组的SVF细胞凋亡率(34.77±2.31%)更低,4 m M组(52.50±0.44%)和8 m M组(51.83±3.21%)的SVF细胞凋亡率显著高于0 m M组(45.83±1.59%),P<0.05。(2)冻存后脂肪组织大体图片结果显示:TGM组脂肪组织结构更致密,液化油滴较少,在大体外观上更接近新鲜脂肪组织;扫描电镜结果显示:TGM组结缔组织仍附着较多脂肪细胞,且脂肪细胞较为饱满均一,与新鲜脂肪组织的电镜下结构更接近;SVF细胞凋亡率结果显示:TGM组的SVF细胞凋亡率(31.60±1.21%)更低,但和DF组(33.2±1.08%)之间没有统计学差异,P<0.05。(3)移植物大体图片和保留率结果显示:TGM组和DF组未见明显油囊,且与其他组相比,PBS组脂肪移植物体积明显降低,TGM组的脂肪移植物体积保留率(73.45±4.84%)和重量保留率(64.8±1.62%)均高于其他组,但TGM组的重量保留率与TG组(60.87±3.95%)、DF组(59.80±4.31%)之间没有统计学差异,P<0.05;HE结果显示:TGM组移植物组织结构和完整性更好;免疫荧光染色结果显示:TGM组移植物的活性脂肪细胞数量最多,结构保存完好,近似圆形,膜膜连续;CD31免疫组织化学染色结果显示:TGM组移植物的新生血管形成数量(19.80±1.92)最多,P<0.05。结论:(1)2 m M Met具有较强的抗氧化能力,对细胞毒性作用较小,能明显降低冻存后脂肪组织的SVF细胞凋亡率,是适宜的冻存液浓度;(2)TGM冻存液可以有效保护脂肪组织结构的完整性,降低细胞凋亡率,冻存后的脂肪组织仍具有较高的移植物保留率,有望作为CPA用于临床脂肪组织的冻存。
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