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中山大学学报（医学科学版） 2013年第2期34卷 207-214页

作者：艾文佳李杰李雯刘池拽王深明吕伟明中山大学附属第一医院血管甲状腺外科广东广州510080 中山大学附属第一医院普通外科国家重点学科实验室广东广州510080

【目的】目前干细胞分化内皮细胞(EC)用于血管治疗受限于分化率,既往研究提示转化生长因子β1(TGFβ1)参与内皮分化的调控,其作用因受体途径及分化阶段而不同。本实验即研究TGFβ1主要Ⅰ型受体ALK5活化水平与间充质干细胞(MSC)的内皮细... 详细信息

【目的】目前干细胞分化内皮细胞(EC)用于血管治疗受限于分化率,既往研究提示转化生长因子β1(TGFβ1)参与内皮分化的调控,其作用因受体途径及分化阶段而不同。本实验即研究TGFβ1主要Ⅰ型受体ALK5活化水平与间充质干细胞(MSC)的内皮细胞分化效率间的关系及分化内皮细胞应用组织工程血管的研究。【方法】采用差速贴壁及流式分选获得大鼠骨髓CD31-MSC,以含VEGF、bFGF及EGM-2的培养基内皮诱导2周组作标准对照组,实验组为分阶段添加TGFβ1活化ALK5组、SB431542抑制ALK5组;免疫荧光检测分化中内皮细胞标志蛋白vWF、KDR动态表达;诱导14 d后通过流式细胞术分析各组CD31+百分率比较诱导效率,并检测诱导细胞体外血管形成功能,最后将分化的内皮细胞体外种植于脱细胞基质血管表面构建组织工程血管。【结果】基于KDR、vWF表达变化,间充质干细胞分化以第7天为界分为间充质干细胞分化血管祖细胞及血管祖细胞分化内皮细胞两期。早期活化ALK5(VFT组)、后期抑制ALK5组(VFS组)其CD31+百分率分别为(9.65±2.75)%、(2.28±0.20)%,较标准组提高7.7倍(P=0.006)、1.8倍(P=0.013),差异具有统计学意义;诱导细胞具有体外成血管功能并可应用组织工程血管内膜层重建。【结论】ALK5受体途径在骨髓间充质干细胞分化内皮细胞中呈阶段相关性:间充质干细胞分化血管祖细胞阶段活化ALK5促进内皮分化,血管祖细胞分化内皮细胞阶段则抑制ALK5促进内皮分化;提高内皮分化效率的细胞可应用组织工程血管内皮化。

关键词： ALK5受体间充质干细胞内皮分化组织工程血管

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骨髓来源细胞构建组织工程血管补片

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中华胸心血管外科杂志 2005年第6期21卷 359-361页

作者：龚立刘锦纷张海波吕德龙蒋祖明俞晓青邹文艳上海第二医科大学附属新华医院上海儿童医学中心心胸外科广东省人民医院广东省心血管病研究所心复苏室 510100 上海第二医科大学附属新华医院上海儿童医学中心心胸外科复旦大学高分子材料系

目的探讨组织工程方法构建血管补片的可行性。方法用壳聚糖和透明质酸多孔多聚体支架构建高分子复合材料支架,将犬的骨髓细胞种植其中,并植入自身犬的肺动脉上,观察材料上细胞外基质生成及表面内皮化的情况,分别在术后2周、4周、8周用... 详细信息

目的探讨组织工程方法构建血管补片的可行性。方法用壳聚糖和透明质酸多孔多聚体支架构建高分子复合材料支架,将犬的骨髓细胞种植其中,并植入自身犬的肺动脉上,观察材料上细胞外基质生成及表面内皮化的情况,分别在术后2周、4周、8周用电镜、组化等方法来进行评价。结果所有动物在实验期间均存活,组织学及免疫组织化学显示,术后补片形成类似血管壁样组织。结论此复合材料和骨髓细胞可用来构建组织工程血管补片,其结构与血管壁类似。

关键词：人工血管骨髓细胞组织工程生物相容性材料组织工程血管补片细胞构建高分子复合材料多聚体支架组织工程方法

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纳米仿生组织工程血管构建的实验研究

纳米仿生组织工程血管构建的实验研究

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作者：郑晓兵南京大学

学位级别：博士

全球每年至少500000例血管手术涉及血管置换。对于血管移植物的临床需求是迫切的。目前对大口径血管(直径大于6mm)诸如胸主动脉、腹主动脉、髂动脉、股总动脉等临床上移植替代物有较多的选择,包括自体血管移植物、异体血管移植物、人工... 详细信息

全球每年至少500000例血管手术涉及血管置换。对于血管移植物的临床需求是迫切的。目前对大口径血管(直径大于6mm)诸如胸主动脉、腹主动脉、髂动脉、股总动脉等临床上移植替代物有较多的选择,包括自体血管移植物、异体血管移植物、人工血管移植物(Dacron、EPTFE等),其中异体血管移植物因其强烈的免疫源性临床上早已淘汰,其他各种替代物则有较好的临床效果。而对于直径小于6mm的动脉,人工血管存在移植血管急性血栓形成、吻合口内膜增生、动脉瘤形成、移植物感染、动脉粥样硬化等缺点,临床上至今未找到除自体血管移植物外的其他良好的血管替代物。不幸的是自体血管库的有限性(自体血管病变、血管毁损、自体血管已被取用等原因)进一步限制了临床上小口径血管移植术的成功开展。 　　上世纪80年代随着材料学、工程学和生命科学的发展,提出了血管组织工程学的概念,同时随着90年代纳米技术的出现和发展,组织工程进一步得到发展,人们开始利用纳米技术构建仿生组织工程组织器官。本研究利用静电纺丝能进行纳米级操控的优势,将兔子自体血管来源的种子细胞(血管内皮细胞、血管平滑肌细胞)以及血管细胞外基质成分进行电纺,于体外构建成与天然血管有相似纳米微观构造的组织工程血管,然后再将体外成功构建的纳米仿生组织工程血管移植回提供种子细胞的兔子,尝试了一种全新的组织工程血管。全文分四部分。 　　第一部分、兔动脉血管平滑肌细胞、血管内皮细胞培养及鉴定 　　目的:为构建组织工程血管提供种子细胞。 　　方法:兔麻醉后取下双侧兔耳廓动脉,分别采用酶消化法和组织块贴壁法培养血管内皮细胞和平滑肌细胞并传代,倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜观察和免疫组化鉴定。 　　结果:成功的培养出血管内皮细胞和平滑肌细胞并传代。倒置显微镜下血管内皮细胞呈“鹅卵石”形态,平滑肌细胞呈典型的“峰一谷”状,透射电镜见内皮细胞特征性w-p小体,平滑肌细胞大量肌丝,免疫组化内皮细胞Ⅷ因子(＋),平滑肌细胞肌动蛋白抗体(＋)。 　　结论:所培养的血管内皮细胞和平滑肌细胞为组织工程血管的研究提供了细胞来源。 　　第二部分、电纺高压静电场对兔动脉平滑肌细胞增殖的影响 　　目的:了解静电纺丝对平滑肌细胞活性和增殖力的影响。 　　方法:原代兔耳廓动脉平滑肌细胞获取后体外培养并传代,取第4～5代平滑肌细胞分成实验组和对照组。实验组平滑肌细胞通过18kV的电纺后,将收集到的平滑肌细胞重新配成细胞悬液并计数,再将细胞悬液分配到24孔培养板置入含5％CO2、37℃的恒温孵育箱孵育,当平滑肌细胞的生长密度达到75％左右时,加入BrdU,细胞培养1h,然后移去培养液,依次PBS清洗4次。4％多聚甲醛固定10min,结合有FITC的抗BrdU抗体室温反应2小时,加入荧光素TOTO3和结合有荧光素Rodamin的抗α-Smactin反应45min。PBS清洗后封片,用Leica共聚集显微镜观察并摄片。实验数据用均数±标准差表示,两组间比较用t检验,统计学分析用SPSS统计软件完成。 　　结果:实验组平滑肌细胞增长率为25.7±1.01％,对照组平滑肌细胞增长率为26.3±0.92％,差别无显著统计学意义(P＞0.05,n=24)。电纺高压静电场对平滑肌细胞增殖无明显影响。 　　结论:经高压静电纺丝后的平滑肌细胞仍然有良好的生长增殖能力。为下一阶段运用高压静电纺丝技术同步构建纳米仿生组织工程血管提供了理论基础。 　　第三部分、纳米仿生组织工程血管体外构建的实验研究 　　目的:利用静电纺丝(electrospinning,ELSP)技术构建具有纳米结构的纳米仿生组织工程血管(nano-biomimetic tissue engineered blood Vessel,NBTEBV)。 　　方法:制各兔血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)体外培养育种管型模具;采用多排喷头ELSP混纺兔平滑肌细胞(vascular smoothmuscle cell,VSMC)悬液及仿细胞外基质(mimic extracellular matrix,MECM)溶液构建NBTEBV。NBTEBV用生物反应器体外培养,MTT检测静置24h和动态培养7d后NBTEBV上VEC/VSMC的成活和增殖能力,行HE染色、扫描电镜观察及最大抗张力检测。 　　结果:动态培养第7天的NBTEBV长

关键词：纳米仿生组织工程血管血管移植术内皮细胞平滑肌细胞免疫组化鉴定

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骨髓源内皮祖细胞复合肝素固化脱细胞支架构建组织工程血管的实验研究

骨髓源内皮祖细胞复合肝素固化脱细胞支架构建组织工程血管的实验...

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作者：周敏南京大学

学位级别：博士

目前血管移植术在临床上已广泛应用于各种心血管疾病的外科治疗。在血管移植中,大隐静脉是冠状动脉搭桥及周围血管手术常用的移植材料,而动脉移植多用于动脉感染时,其长期通畅率比静脉移植要高。自体新鲜血管是理想的移植材料,但是来源... 详细信息

目前血管移植术在临床上已广泛应用于各种心血管疾病的外科治疗。在血管移植中,大隐静脉是冠状动脉搭桥及周围血管手术常用的移植材料,而动脉移植多用于动脉感染时,其长期通畅率比静脉移植要高。自体新鲜血管是理想的移植材料,但是来源有限。目前临床上常用的人造血管有Dacron,ePTFE等,但是由于人造血管内表面没有内皮细胞覆盖,所以容易形成血栓,长期通畅率低下,而且人造血管植入机体后没有生物活性,无法被机体降解。 　　 20世纪90年代后期,进一步提出血管组织工程的新概念,体现了组织工程的发展方向。在血管组织工程研究中,重建内皮细胞功能成为主要研究方向。内皮细胞(EC)具有抗凝、调节血管张力、识别各种理化信号、调控细胞增殖等重要功能,现在可以通过多种途径获得EC,如血管、网膜组织、皮下脂肪等。获取细胞常用胶原酶和(或)胰蛋白酶进行酶解,获得活细胞的数目同酶浓度和酶解时间相关。血管来源包括颈静脉、大隐静脉、前臂静脉及不影响组织血供的外周动脉。由于传统的组织工程是以成体细胞体外扩增作为种子细胞,但实际应用中内皮细胞体外培养生长缓慢,且传代5～8代后迅速发生衰老,直接影响细胞种植后功能体现。同时由于培养时间较短(1d～1w),可能难以建立正确的细胞连接和信号传递途径,无法充分体现内皮细胞的调节功能。随着近年来对干细胞的研究进展,将干细胞作为种子细胞为组织工程的发展提供了新机遇,干细胞来源的血管内皮细胞作为种子细胞在组织工程中的应用成为热点研究课题。本研究将犬骨髓源内皮祖细胞在体外增殖培养后,作为种子细胞种植到经肝素固化后的脱细胞犬颈动脉血管支架上,从而构建组织工程血管,进而再移植到提取干细胞的犬体内,尝试一种全新的血管代用品。 　　全文分为五个部分: 　　第一部分、犬颈动脉脱细胞血管支架的制备 　　目的:探讨组织工程血管脱细胞血管支架的制备及其免疫原性的检测方法。 　　方法:取普通杂种犬的颈动脉,剪成5.0cm长的血管段,随机分为3组(每组5段):对照组1、对照组2、脱细胞组。对照组1:TBS冲洗后直接用Bouin液固定12h,石蜡包埋。对照组2:TBS4℃浸2h,1％TritonX-1004℃持续震荡12h。脱细胞组:TBS4℃浸2h,1％TritonX-1004℃持续震荡12h,0.125％胰酶37℃消化12h,按1:1比例用0.5mg/ml DNA酶和0.5mg/ml RNA酶37℃消化12h,TBS洗3次。行HE、Masson、VG染色,光镜及扫描、透射电镜观察血管内皮细胞、平滑肌细胞的脱落情况,以及血管弹力纤维、胶原纤维连续性是否完好,有无中断、消失,胶原纤维横纹是否消失,有无细胞结构或细胞碎片残留。免疫组化方法检测血管脱细胞处理前后主要组织相容性复合体I(MHCI)的变化情况,并将检测结果作图像分析。 　　结果:犬颈动脉脱细胞血管支架较新鲜动脉更为白色,半透明,质地柔软,顺应性良好。对照组1光镜及扫描、透射电镜见动脉结构完整,各层细胞结构清晰,Masson、VG染色见弹力纤维、胶原纤维连续性完好,纤维结构间被细胞占据,无空白区。对照组2见残留多量细胞及其碎片成分,纤维结构完整,无中断、消失。脱细胞组未见细胞及其碎片成分,各层结构清晰可辨,纤维网架结构保持完整,弹力纤维卷曲呈波浪状,排列整齐、致密,无断裂,胶原纤维连续性好,横纹存在,原来内皮细胞、平滑肌细胞占据的地方变成纤维间的空白区。免疫组化实验发现对照组1血管内皮细胞及平滑肌细胞高度表达MHCI,阳性反应见于血管内膜和中膜,呈细胞形态分布;对照组2内皮细胞层已无细胞,未见免疫组化阳性反应,中膜虽已无平滑肌细胞,但仍有浅淡免疫组化染色,不呈细胞形态,呈小碎片散在分布,且阳性染色面积较对照组1明显减少;脱细胞组的阳性反应更少,只在中膜胶原纤维间有很少量免疫组化染色。图像分析得出阳性颗粒面积与视场面积比:对照组1为(24.09±6.09)％,对照组2为(6.71±2.18)％,脱细胞组为(1.62±0.76)％,经方差分析各组间比较均有显著差异(P＜0.01)。 　　结论:通过TritonX-100、胰酶以及DNA酶、RNA酶可以在体外制备脱细胞血管支架。MHCI免疫组化染色能很好地反映血管脱细胞处理前后免疫原性强弱变化,可作为检测血管脱细胞支架免疫原性的实验方法之一。 　　第二部分、脱细胞支架的表面肝素固化 　　目的:通过对脱细胞血管支架的表面进行肝素固化,制备一种具有抗凝功能的组织工程血管支架。 　　方法:将肝素分子通过共价键结合至犬颈

关键词：组织工程血管骨髓源内皮祖细胞脱细胞支架血管移植免疫组织化学生物相容性

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“全生物化”组织工程血管构建的实验研究

“全生物化”组织工程血管构建的实验研究

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作者：马良龙上海交通大学

学位级别：博士

目的:建立分离骨髓内皮祖细胞的方法。探讨应用骨髓内皮祖细胞作种子细胞、以血管脱细胞基质为支架构建“全生物化”组织工程血管的可能性。\n 方法:梯度密度离心法分离人和猪骨髓单核细胞,应用内皮细胞专用培养液EGG-2体外培养。应... 详细信息

目的:建立分离骨髓内皮祖细胞的方法。探讨应用骨髓内皮祖细胞作种子细胞、以血管脱细胞基质为支架构建“全生物化”组织工程血管的可能性。\n 方法:梯度密度离心法分离人和猪骨髓单核细胞,应用内皮细胞专用培养液EGG-2体外培养。应用免疫学技术鉴定内皮细胞标志:CD34、CD31、FLK-1、ve-Cadherin、vWF及前体细胞标志CD133。然后应用含20no/ml血小板衍生生长因子BB的EGG一2培养液继续培养4天、10天后鉴定a-SMA和Calponin。同期应用胰酶、SDS处理和反复冻融的多步骤法制备犬动脉脱细胞基质。电镜、病理及力学检测脱细胞效果,检测基质力学特性。最后以培养的内皮祖细胞作种子细胞静态种植于脱细胞基质,构建组织工程血管并移植到骨髓供体猪颈动脉或左肺动脉。术后行导管检查,观测管道通畅情况。3个半月后处死动物,观测组织工程血管形态、病理、力学特性。\n 结果:1、应用内皮细胞专用培养液培养梯度密度离心分离的骨髓单核细胞,最终分离出骨髓内皮祖细胞,表达祖细胞标志CD133和内皮细胞标志CD31、VE-Cadherin、vWF。培养至第4周,细胞总数达到108,可以满足血管组织工程对种子细胞的数量要求。2、内皮祖细胞经过PDGF-BB的诱导可以分化出平滑肌细胞。诱导第十天a-SMA阳性细胞达到64％。未经诱导细胞最终分化成内皮细胞。3、应用胰酶消化和SDS漂洗及反复冻融处理,犬动脉仅留下比较完整的管形支架,所有细胞成分被完全清除。其抗撕断能力、拉伸特性保持良好。4、种植内皮祖细胞于基质后在其表面形成一层完整的内皮细胞层,与正常血管近似。移植到颈动脉的血管20天后明显狭窄。移植到肺动脉的血管保持通畅,3个半月后管道与正常血管相比最大负载相似,但弹性弱于正常血管。血管内表面形成一层连续完整的内皮细胞,中层有平滑肌细胞,细胞排列近似正常血管。\n 结论:1、人和猪骨髓中均存在内皮祖细胞,应用密度梯度离心法结合EGM-2培养液的选择可以分离出骨髓内皮祖细胞。2、PDGF-BB可以诱导内皮祖细胞定向分化平滑肌细胞。3、胰酶消化、SDS洗涤并反复冻融结合制备血管脱细胞基质,能够完全去除细胞成分,基本保存血管支架结构。4、以骨髓内皮祖细胞作种子细胞、血管脱细胞基质为支架可以构建“全生物化”组织工程血管,用于替代肺动脉效果良好。

关键词：内皮祖细胞脱细胞基质组织工程血管

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利用干细胞和基因技术的组织工程血管研究

利用干细胞和基因技术的组织工程血管研究

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作者：张钧南开大学

学位级别：博士

研究目的：本论文制备电纺丝材料作为血管支架，采用骨髓间充质干细胞作为种子细胞，并用eNOS基因对细胞进行修饰。进行组织工程血管的体外构建和体内移植的实验研究，探索血管组织工程的可行性途径。研究方法：1．用Ficoll密度梯... 详细信息

研究目的：本论文制备电纺丝材料作为血管支架，采用骨髓间充质干细胞作为种子细胞，并用eNOS基因对细胞进行修饰。进行组织工程血管的体外构建和体内移植的实验研究，探索血管组织工程的可行性途径。研究方法：1．用Ficoll密度梯度离心试剂分离培养大鼠和兔子骨髓间充质干细胞，并进行免疫鉴定。用磷酸钙方法转染293T包装细胞，制备eNOS逆转录病毒，应用eNOS基因修饰大鼠和兔子骨髓干细胞，种植到电纺丝加工的PPC血管支架，构建直径为卜3mm的小口径血管。用RT—PCR和NO分析测定eNOS基因在人工血管上的表达情况和NO的分泌情况。2．将人工血管移植到同源兔子的颈动脉，观察血管在动物体内的畅通情况。四周后，取出移植物，用HE染色、免疫染色等组织分析方法检测血管的通畅程度和移植细胞的分化情况。3．研究了负载DNA的电纺丝组织工程支架，将高分子基因载体PEI复合到聚合物PCL中，一起电纺丝形成膜材料和管材料。通过荧光分光光度计检测DNA在材料上的固定和释放，DNA—PEI复合物颗粒的大小用光散射法测定，通过培养293细胞检测材料的转基因效率和细胞相容性，转基因效率采用荧光显微镜和流式细胞分析法测定。采取超低温冻融的方法制备兔颈动脉脱细胞血管支架。研究结果：掌握了骨髓间充质干细胞的分离培养技术，掌握了逆转录病毒的制备技术，浓缩eNOS病毒对间充质干细胞的感染效率可达83.4％，并且转基因的间充质干细胞可以表达eNOS的RNA和蛋白。细胞接种到PPC血管支架上可继续生长，不仅黏附于血管材料的内腔表面，也均匀的生长到纤维间隙中，并且可以在血管支架上表达eNOS蛋白。构建的这种eNOS基因修饰的血管产生的NO随时间增加，并且接近正常血管。移植后的血管在兔子颈部两周时检测保持畅通，四周后在支架材料的里面和外面均形成一层组织，管腔有一定程度的狭窄，种植细胞的血管材料比没有种植细胞的血管材料有更好的通畅性。植入4周后形成了较为完整的血管内皮，并有血管平滑肌的生成，其中部分内皮细胞和平滑肌细胞是由植入的间充质干细胞分化而来。 PEI/PCL电纺丝膜纤维直径0.5～1μm。固定在膜上的DNA在开始1～2小时释放出40％，在随后三天里持续稳定的随时间释放。MTT的结果表明PEI与PCL比例为1：5和1：10的膜和单纯PCL膜相比在5天内的细胞增长数量没有明显差别，表明在PCL中加入PEI没有明显影响材料的细胞相容性。而在PEI／PCL为1：2的膜细胞数量略低。但是在所有条件下，细胞数量都是随时间增长。从膜上释放出的DNA—PEI复合物有较均一的粒径，而常规方法在溶液中形成的DNA—PEI复合物，粒径分布较为分散。流式细胞分析和荧光显微镜观察结果表明293细胞在PEI/PCL膜上的基因转染效率达到90％以上。兔颈动脉通过反复冻融所制备的脱细胞基质，获得了疏松多孔的结构，这种微米尺寸的孔隙结构，与细胞大小相仿，有利于细胞的粘附、向支架内部生长和营养物质的交换。结论： 1．用eNOS基因修饰的骨髓间充质干细胞构建组织工程血管，在血管中高水平表达功能蛋白eNOS，表明这种基因修饰种子细胞的方法，可以将基因治疗与组织工程相结合。兔子体内实验表明，自体骨髓间充质细胞作为种子细胞，在体内条件下可分化成内皮细胞和平滑肌细胞，参与血管的重建。2．通过PEI和PCL混合电纺丝将高分子基因载体PEI结合到支架材料中，因此，使得电纺丝材料可以携载质粒DNA，成为载基因组织工程支架材料。这种载基因材料的基因释放受PEI的溶出速率控制，转基因效率高，而且在时间和空间上可控。用作支架材料，可以将基因治疗与组织工程研究很好的结合起来。3．建立了一种天然血管脱细胞地有效方法，反复冻融方法不仅能够彻底去除细胞成分，而且有利于产生疏松、孔径大而且连通的细胞外基质材料。

关键词：电纺丝材料组织工程血管人工血管血管支架骨髓间充质干细胞逆转录病毒

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复合生物材料构建小口径纳米组织工程血管的实验研究

复合生物材料构建小口径纳米组织工程血管的实验研究

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作者：方征东复旦大学

学位级别：博士

第一部分P(LLA-CL)静电纺丝工艺初步研究目的以聚左旋乳酸-己内酯共聚物[P(LLA-CL)]为原料,采用静电纺丝方法制备纤维膜,考察静电纺丝过程参数对纤维膜结构及纤维直径的影响规律。方法以六氟异丙醇为溶剂,通过调整P(LLA-CL)浓度、纺丝... 详细信息

第一部分P(LLA-CL)静电纺丝工艺初步研究目的以聚左旋乳酸-己内酯共聚物[P(LLA-CL)]为原料,采用静电纺丝方法制备纤维膜,考察静电纺丝过程参数对纤维膜结构及纤维直径的影响规律。方法以六氟异丙醇为溶剂,通过调整P(LLA-CL)浓度、纺丝电压、电纺距离及溶液流速,分别制备了不同条件下的纺丝膜,通过扫描电镜(SEM)来观察纺丝膜的纤维形貌以考察这些参数对电纺膜形貌的影响。结果 (1) P(LLA-CL)浓度为4%时,电纺纤维膜中有很多纺锤形的珠滴,而当浓度上升为6%时,P(LLA-CL)溶液的可纺性明显改善,电纺纤维直径由浓度6%时的357±127nm上升到浓度12%时的904±98nm(P<0.05),而聚合物浓度达到一定水平(14%)时,则难以在喷丝头形成喷丝细流,电纺不可行：(2)随着纺丝电压由1kV/cm增高到2kV/cm时,纤维平均直径由520±64nm减小至305±58nm(P<0.05)；(3)电纺距离为由15cm减至10cm时,对电纺纤维膜形貌无明显影响(P>0.05)；(4)在溶液流速为2ml/h时,可形成完好的纳米纤维形貌,但当溶液流速为4ml/h时,纤维发生明显的粘结。结论聚合物液的浓度是纺丝过程中重要影响因素,在可纺范围内,纤维直径随溶液浓度提高而增加,随着纺丝电压的增大而减小,电纺距离对纤维形貌影响不大,但电纺距离的缩小及过快的溶液流速均不利于纳米纤维膜的形成。第二部分P(LLA-CL)/纤维蛋白原纳米复合膜的制备与表征目的以合成高分子材料P(LLA-CL)与天然生物材料纤维蛋白原为原料,利用静电纺丝技术构建具有良好细胞亲和性与合适机械性能的纳米复合膜。方法 (1) P(LLA-CL)溶解于六氟异丙醇中得到浓度为8%的溶液,纤维蛋白原溶解于六氟异丙醇和10×DMEM混合溶液中(体积比9：1)得到100mg/ml的溶液。把P(LLA-CL)溶液与纤维蛋白原溶液分别按4：1、2：1、1：1、1：2、1：4体积比进行混合,利用静电纺丝技术构建纳米复合膜；(2)采用SEM检测膜片的表面纤维形态,称重法计算孔隙率；(3)傅里叶全反射红外光谱(FITR)进行膜片表面基团分析；(4)X射线光电子能谱(XPS)对膜片表面元素组成进行表征；(5)水接触角测定膜片的亲水性；(6)拉伸试验检测复合膜片的力学性能；(7)以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)种植在复合膜片上,WST-8试剂盒检测膜片对细胞对的粘附、增殖的影响,并以细胞活力实验检测细胞在膜片上生长情况,SEM观察HUVECs形态变化。结果 (1) P(LLA-CL)/纤维蛋白原复合膜纤维平均直径约240纳米到450纳米,随着混纺液中纤维蛋白原浓度的增加,纤维直径逐渐减小,孔隙率增大,亲水性增加(P<0.05); (2) FITR及XPS证实复合膜片表面有纤维蛋白原氨基酸的存在；(3)拉伸试验表明在P(LLA-CL)中加入纤维蛋白原后,能降低断裂伸长率,增加杨氏模量(P<0.05),但拉伸强度表现不同,在体积比4：1复合膜片组增高(P<0.05),体积比2：1复合膜片组改变无差异(P>0.05),但当纤维蛋白原浓度增大到一定程度(1：1)则降低；(4)细胞粘附、增殖实验表明,疏水性的P(LLA-CL)支架有更好的细胞粘附能力(P<0.05),但含有纤维蛋白原的膜片有更好的细胞增殖能力(P<0.05)。其中,体积比2/1的膜片细胞增殖率最高。细胞活力实验及扫描电镜也证实在P(LLA-CL)/纤维蛋白原复合膜表面,HUVECs生长良好,近乎铺满支架表面。结论以P(LLA-CL)与纤维蛋白原共混后行静电纺丝,能构建具有良好力学性能及生物活性的纳米复合膜片。高分子合成材料P(LLA-CL)能够作为膜片的骨架提供良好的力学性能,天然材料纤维蛋白原增加了膜片的生物活性,作为组织工程支架有潜在的应用前途。第三部分小口径P(LLA-CL)／纤维蛋白原管形支架构建及生物学性能评价目的制备小口径P(LLA-CL)/纤维蛋白原管形支架,并评价支架的生物相容性和生物力学性能。方法 (1)以P(LLA-CL).纤维蛋白原为原料,按体积比2：1混合后构建小口径管形支架,观察制备的小口径血管支架的大体形态并用扫描电镜观测其三维结构；(2)利用溶血试验、细胞毒性试验、皮下植入试验评价支架材料的生物相容性；(3)检测支架的爆破强度、最大缝持张力、顺应性以评价小口支架的生物力学性能。结果 (1)管形支架长度在5～8cm,内径5mm左右,管壁厚度为0.4-0.5mm,支

关键词：静电纺丝聚左旋乳酸-己内酯扫描电镜组织工程静电纺丝合成生物材料天然生物材料静电纺丝管形支架聚左旋乳酸-己内酯纤维蛋白原生物相容性生物力学性能内皮化组织工程血管聚左旋乳酸-己内酯纤维蛋白原

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调控干细胞能量代谢在体构建小口径组织工程血管

调控干细胞能量代谢在体构建小口径组织工程血管

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作者：吴杨霄第三军医大学

学位级别：博士

在过去三十年中,心脑血管疾病始终是我国城乡居民的首位死因。尽管近些年来由于药物的使用以及介入技术的发展,部分心脑血管事件的死亡率得到了控制。但是,最终越来越多的病人仍然需要进行血管置换手术或心脏搭桥手术,这些手术都需要血... 详细信息

在过去三十年中,心脑血管疾病始终是我国城乡居民的首位死因。尽管近些年来由于药物的使用以及介入技术的发展,部分心脑血管事件的死亡率得到了控制。但是,最终越来越多的病人仍然需要进行血管置换手术或心脏搭桥手术,这些手术都需要血管替代物。此外,血管替代物在肿瘤、外伤、炎症引起的血管病变、动脉瘤、动脉夹层以及血液透析等方面也有着巨大的临床需求。临床上,血管替代物主要来源于自体血管或人工血管。使用自体血管移植存在以下问题:1.自体血管数量有限,疾病状态下的自体血管质量不高;2.在取供体血管时会造成局部创伤,增加了手术时间以及病人的负担。而现阶段应用于临床的人工血管主要为涤纶或不可降解的高聚合物,这类人工血管不仅需要长期的抗凝药物支持,而且作为异物不能被机体吸收,弹性较差。它们仅可应用于大口径血管的替换。而针对小口径(直径<6mm)的血管替换,还没有可应用于临床的血管移植物产品。因此,研发新型的小口径人工血管迫在眉睫。现有实验研究表明,小于6mm的人工血管长期通畅率很低。影响小口径人工血管通畅率的主要因素为1.急性血栓;2.内膜增生导致的管腔狭窄。血管移植物移植后直接接触血液,作为异物很容易与血液相互作用形成血栓。因此,避免急性血栓形成是维持血管移植物早期通畅的关键。而内膜增生是由各种原因引起的血管移植物内的平滑肌异常增殖以及细胞外基质的沉积而导致的血管内膜层增厚。内膜增生是致使血管晚期堵塞的重要原因。在正常血管的表面覆盖有内皮层,其对防止血栓形成和维持血管的稳态有着重要作用。对于人工血管来说,在其血管内腔内皮化越早,血小板聚集、血栓形成的风险就会越小。人工血管的内皮化同样会对后期内膜异常增生起到抑制作用。因此促进内皮化是人工血管维持通畅的关键。目前的研究发现,人工血管的内皮化主要涉及以下机制,吻合口附近内皮细胞越过吻合口向组织工程血管爬行,以及循环内皮祖细胞迁移归巢至血管表面形成内皮层。由于吻合口两端的内皮细胞爬行的距离很有限,因此血管移植物中段的内皮化主要由内皮祖细胞的迁移、归巢、分化完成。在正常人体内,内皮祖细胞主要参与血管内衰老细胞的更换,归巢并修复损伤部位,维持血管稳态。内皮祖细胞不仅能直接分化成为内皮细胞,还可以分泌生长因子促进附近内皮细胞生长以及血管再生。内皮祖细胞的归巢对于血管移植物的内皮化具有重要的意义。因此,如何让内皮祖细胞更快的归巢到组织工程血管表面,更快更好的发挥其功能是本研究的重点。近些年来,关于干细胞能量代谢的研究与日俱增。研究发现,增加干细胞的有氧代谢水平可以有效的促进干细胞功能的发挥。因此我们猜测,是否增强内皮祖细胞的代谢状态会改善其功能,并进一步促进组织工程血管的内皮化。一磷酸腺苷激活的蛋白激酶(adenosinemonophosphateactivatedproteinkinase,ampk)是能够感知细胞内能量代谢状况的蛋白激酶。当其感受到细胞处于能量需求状态时会激活,从而激发其下游的信号通路,促进分解代谢,抑制合成代谢,增加细胞内atp的产生。5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide1-β-d-ribofuranoside,aicar)是一种常用的的ampk的激动剂,并已经是一种被批准应用于临床的药物。在此,我们使用aicar来改善干细胞的代谢状态,来评价其对内皮祖细胞功能的影响,并构建搭载aicar纳米微球的组织工程血管,建立大鼠颈动脉移植模型,观察其对内皮化以及通畅率的影响。此外,糖尿病在全球有着极高的发病率,而糖尿病血管病变是糖尿病并发症中普遍存在并且严重的并发症之一。其血管移植术后,病理状态下参与血管移植物内皮化的细胞的功能会减弱,血管移植物更容易发生病变以及堵塞。因此,应用于糖尿病病人的血管移植物需要更好的生物相容性并拥有抵抗体内病理条件的功能。而针对参与血管移植物再生的干细胞功能,在病理情况下会发生怎样改变的研究也较少。我们的组织工程血管在糖尿病模型中效果如何,尚不清楚。因此,通过在高糖情况下使用aicar刺激内皮祖细胞,改变其代谢功能,并观察对内皮祖细胞功能的影响,以及对内皮祖细胞促组织再生功能的影响。再将aicar修饰的组织工程血管应用于糖尿病模型,进一步验证我们的假说。我们认为基于促进干细胞代谢的组织工程血管的研究可以为未来血管移植物的构建提供新的思路。我们对如下几个方面进行研究1aicar对组织工程血管种子细胞的功能影响首先,我们通过罗丹明123,线粒体染色以及细胞内atp的检测发现aicar可以明显促进内皮祖细胞代谢状态。通过平板流动腔实验模拟体内血流状态发现代谢功能增强的内皮祖细胞可以更多的归巢到血管表面。而通过transwell和elisa吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,elisa)实

关键词： AICAR 内皮祖细胞组织工程血管内皮化能量代谢糖尿病

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以脱细胞犬动脉为基质的新型组织工程血管支架的制备和体外再细胞化研究

以脱细胞犬动脉为基质的新型组织工程血管支架的制备和体外再细胞...

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作者：涂秋芬四川大学

学位级别：博士

研究背景随着生活水平的提高和饮食结构的变化，人们患有心血管疾病的风险越来越大。许多情况下，病人需要通过血管的置换手术来提高生活质量甚至是挽救生命。患者自身其它部位的血管被认为是置换手术中的最好的材料，但大多数患者并不... 详细信息

研究背景随着生活水平的提高和饮食结构的变化，人们患有心血管疾病的风险越来越大。许多情况下，病人需要通过血管的置换手术来提高生活质量甚至是挽救生命。患者自身其它部位的血管被认为是置换手术中的最好的材料，但大多数患者并不具备合适的可移植血管，尤其是实施多次手术的患者；另外这个手术的实施极易对患者会造成新的创伤。于是人们便开始寻找新型的血管替代材料，组织工程概念的提出为构建组织工程血管提供了理论依据和实验方法。制备脱细胞的异种血管支架是目前组织工程血管研究领域的一个热点。同其它类型的组织工程血管相比，脱细胞异种血管支架具备更多优点。与合成材料为基质的组织工程血管相比，脱细胞异种血管支架具备更好的力学特征和生物相容性；与由胞外基质蛋白（胶原蛋白或弹性蛋白）交联而成的支架相比，它具备更好的三维结构，更高的力学强度；同细胞自组装的组织工程血管相比，它的制备更加简单，同时制备的周期更短。脱细胞血管支架比起其它类型的组织工程血管具备很多优点，而且在许多动物试验中也得到证实。但有很多实验结果表明，动物的在体细胞募集能力比人类强很多，即使是生物相容性较差的合成材料植入动物体内也能获得较好的细胞化，因此，脱细胞支架在人体内能否取得同样的效果还需要更多的临床实验结果来证明。事实上，脱细胞异种血管（或瓣膜）在人体内的实验结果却并不理想，主要原因是炎症反应、钙化以及支架材料的降解引起的并发症。因此，脱细胞异种血管支架在人体内的得到广泛应用之前，还有许多问题需要得到解决。首先，如何控制脱细胞血管支架在体内的降解速度?通过对血管支架的胶原纤维进行交联处理，不仅可以减缓材料的降解过程，为组织的重建提供更充裕的时间，还可以有效降低免疫原性和钙化的发生。其次，如何实现脱细胞异种血管的体外再细胞化?有充分的证据表明，血管内皮细胞（EC）能够有效防止血栓形成以及血管再狭窄所引起的血管阻塞，进而提高组织工程血管移植的成功率。但作为血管的另一个重要细胞成分平滑肌细胞（SMC）的体外再细胞化研究却很少，而两种细胞成分在组织工程血管上的联合细胞化的研究更是屈指可数。SMC和EC之间的相互作用达到某种平衡被认为是维持血管正常功能所必须的，用于研究SMC和EC之间相互关系的研究模型，不论是两种细胞在PET膜两侧的共培养，或者在培养瓶中直接将EC种植于SMC细胞层上，都能证明SMC和EC之间能够相互影响，这种影响不仅可以发生在形态学水平，还发生在分子生物学水平。因此，对脱细胞异种血管支架进行SMC和EC的联合种植，将有利于使两种细胞的增殖、分化和功能更接近于在体环境，提高组织工程血管移植的成功率。本研究中，我们对犬主动脉进行一系列脱细胞处理，并对制备出的脱细胞血管支架进行综合评价，最后将在体外实现脱细胞血管支架的再细胞化，包括SMC和EC在支架材料上的单独种植，以及EC在SMC上的联合种植，拟制备出结构和功能更加完整的组织工程血管支架。具体方法如下：研究方法 1．犬动脉的脱细胞处理我们实验室的前期研究结果表明，应用多聚环氧化合物EX-810来处理主动脉，除了能够有效地交联支架的胶原纤维外，还能部分去除支架内的细胞成分，同时保持胞外基质的结构的完整，而且表现出极小的细胞毒性。但是，EX-810的主要作用是引起细胞的破裂，而残留的细胞碎片可能会导致钙化的发生。因此我们加入了低盐渗透和超声的方法，加速细胞的破碎，同时更有效去除细胞残片。试验中应用HE染色，DAPI染色技术来检测脱细胞的效果。 2．脱细胞犬动脉力学性能的评价除了上述对脱细胞犬动脉进行脱细胞效果检测外，支架的力学性能评价也是判断一种组织工程血管优劣所必须的。力学性能的检测应用INSTRON8874生物力学测试系统（Instron Co．，USA）行单轴拉伸试验，测定脱细胞犬动脉支架的各种力学指标，包括血管的最大荷载、最大荷载时的能量，最大荷载的伸长长度，以及最大荷载时的应变率。 3．脱细胞犬动脉的生物相容性检测及体外再细胞化研究通过不同密度的SMC和EC在脱细胞犬动脉支架表面的种植，以及EC在不同密度的SMC表面的种植。一方面对支架材料的细胞相容性进行评价，另一方面确定在材料表面实现快速细胞化所需要的细胞种植密度，以及如何实现EC和SMC在组织工程血管支架表面的直接联合培养。用于主要的研究方法有扫描电镜（SEM）、噻唑蓝（MTT）和免疫组化染色。应用Image-Pro Plus图像处理软件对SEM图片进行分析，计算细胞覆盖率。 4．体外再细胞化的脱细胞犬动脉抵抗流体切应力的研究由于以合成材料为基质的大口径血管支架

关键词：组织工程血管脱细胞再细胞化联合培养细胞毒性生物相容性

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碳化二亚胺交联并肝素化的血管脱细胞基质为支架构建组织工程血管的实验研究

碳化二亚胺交联并肝素化的血管脱细胞基质为支架构建组织工程血管...

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作者：郝晨光哈尔滨医科大学

学位级别：博士

目的：近年来随着血管系统疾病的发生率逐年上升，临床治疗上对血管移植替代物的需求大大增加。组织工程的原理与方法在血管外科的应用使构建组织工程血管成为可能．在前期工作中，我们采用同种异体的犬颈总动脉脱细胞基质为支架，复合... 详细信息

目的：近年来随着血管系统疾病的发生率逐年上升，临床治疗上对血管移植替代物的需求大大增加。组织工程的原理与方法在血管外科的应用使构建组织工程血管成为可能．在前期工作中，我们采用同种异体的犬颈总动脉脱细胞基质为支架，复合自体内皮细胞，构建出组织工程血管，由于同种异体脱细胞基质回植体内后，不可避免受到自身组织酶的降解，导致血管的生物力学强度下降，为此我们采用碳化二亚胺对脱细胞基质进行交联，以期改善血管的力学强度：并且利用碳化二亚胺的双功能交联的特性，将肝素共价结合于脱细胞基质中，发挥其抗凝效果。并以碳化二亚胺交联并肝素化的同种异体血管脱细胞基质为支架构建组织工程血管，并进行桥接血管的实验研究。材料与方法：利用酶一化学除垢剂法对异体犬颈总动脉作用进行脱细胞处理，应用碳化二亚胺对脱细胞基质进行交联并肝素化，首先对碳化二亚胺交联并肝素化的脱细胞基质的体内体外组织相容性进行检测，然后利用体外培养的自体静脉内皮细胞与交联并肝素化的脱细胞基质进行体外种植构建组织工程化血管桥接犬颈总动脉，三个月取材进行组织学和生物力学检测。结果：碳化二亚胺交联并肝素化的脱细胞基质的体外降解率低于单纯的脱细胞基质，细胞毒性MTT实验显示交联的脱细胞基质无明显的细胞毒性作用，同时肝素化可以促进间质细胞向支架内的再分布。采用交联并肝素化的脱细胞基质为支架的TEVG桥接犬颈总动脉三个月取材结果显示，．与单纯脱细胞基质为支架构建的组织工程血管相比，二者的通畅率无差异，但生物力学测试结果显示，交联并肝素化可以显著提高血管移植物的爆破压力和破坏负荷，应力应变曲线的斜率与正常血管近似。组织学检测可见交联并肝素化血管移植物的内皮细胞层形成较好，细胞排列规则，内弹力膜连续，中膜层内间质细胞排列规则，细胞外基质成分形成充分，排列规则，与正常血管近似。结论：碳化二亚胺交联并肝素化的脱细胞基质，提高了支架的生物力学性能，增强其稳定型，提高支架抗组织酶降解的能力，为组织工程血管移植提供了较好的早期生物力学强度；肝素化促进了内皮细胞的粘附与分化，促进了间质细胞的再分布过程，从而有利于动脉中膜的重建；各个方面的综合作用提高了组织工程血管的整体表现。

关键词：碳化二亚胺交联肝素化组织工程血管血管移植支架材料

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