检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：黄莉莉中国科学院研究生院

学位级别：博士

二苯甲酮衍生物和五环三萜化合物生物合成基因的克隆与功能分析\n 从元宝草(HypericumsampsoniiHance)中克隆了2个类型Ⅲ聚酮合酶基因——二苯甲酮合酶(HsBPS)基因和查尔酮合酶(HsCHS)基因，对它们的生物学功能、器官及组织表达特性... 详细信息

二苯甲酮衍生物和五环三萜化合物生物合成基因的克隆与功能分析\n 从元宝草(HypericumsampsoniiHance)中克隆了2个类型Ⅲ聚酮合酶基因——二苯甲酮合酶(HsBPS)基因和查尔酮合酶(HsCHS)基因，对它们的生物学功能、器官及组织表达特性进行了分析，主要结果如下:\n 1)元宝草中二苯甲酮合酶(HsBPS)基因和查尔酮合酶(HsCHS)基因的克隆与功能分析:利用同源克隆的方法从元宝草中克隆到二苯甲酮合酶(HsBPS)基因和查尔酮合酶(HsCHS)基因，通过原核表达对其功能进行了分析，结果表明，重组HsBPS的最适底物是苯甲酰辅酶A，在体外酶促反应中，该酶催化1分子的苯甲酰辅酶A和3分子的丙二酰辅酶A缩合生成2，4，6-三羟基二苯甲酮，同时产生少量副产物6-phenyl-4-hydroxy-2-pyrone;重组HsCHS的最适底物是p-香豆酰辅酶A，在体外酶促反应中，它催化1分子p-香豆酰辅酶A和3分子丙二酰辅酶A缩合生成柚皮素查尔酮，未检测到副产物。\n 2)HsBPS和HsCHS的器官特异性表达研究:分别采用定量PCR(QPCR)和蛋白免疫印迹杂交(westernblot)技术，从转录水平和翻译水平对不同生长时期（营养生长期和生殖生长期）元宝草植株中HsBPS和HsCHS的器官表达特性进行了研究。结果表明，这两个基因的表达特性具有较明显的差异。在营养生长期，HsBPS在根中的表达量是HsCHS的100多倍。在叶片中，HsBPS在相对较老的叶片中含量较高，而HsCHS在最嫩的叶片中表达量最高。在生殖生长期，HsBPS在根中的表达量与营养生长期相当，然而，HsCHS在该阶段的根中的表达量大幅度增加，与HsBPS的表达量达到同一水平。在花中，HsCHS的表达量最高，相当于HsBPS表达量的5倍。在果实中的情况则正好相反，HsBPS的表达量是HsCHS的10倍左右。\n 3)HsBPS和HsCHS的组织特异性表达研究:免疫组织化学研究结果表明，HsBPS主要在分布于元宝草根、茎、叶、花瓣和雄蕊的分泌囊和分泌道中表达，而HsCHS在元宝草的叶片和花的分泌细胞团中表达。说明分别由HsBPS和HsCHS参与催化的两条次生代谢途径在空间上是独立的。\n 从长春花(Catharanthusroseus(L.)***)中克隆了2个五环三萜合成途径中的关键酶基因——香树脂醇合酶(CrAS)基因和香树脂醇氧化酶(CrAO)基因，对它们的生物学功能、器官表达特性和相关产物的积累模式进行了分析，主要结果如下:\n 1)长春花中香树脂醇合酶(CrAS)基因的克隆与功能分析:从长春花表皮细胞EST文库中，克隆了一个香树脂醇合酶(CrAS)基因。通过酿酒酵母表达系统对其功能进行了分析，结果表明CrAS是一个多功能的氧化鲨烯环化酶(OSC)，能够同时生成α-amyrin和β-amyrin，两者的比例为2.5∶1。\n 2)长春花中香树脂醇氧化酶(CrAO)基因的克隆与功能分析:通过筛选长春花表皮细胞EST文库，从6个功能未知的EST序列（CrContig3，CrContig4，CrContig5，CrContig8，CrContig9和CrContig10）中克隆到3个香树脂醇氧化酶的候选基因（CYP716AL1，CYP71D1V1和CYP71D1V2）。通过酿酒酵母表达系统分别对其功能进行了功能分析，体外实验结果表明，CYP716AL1是一个多功能的香树脂醇C-28氧化酶(CrAO)，在体外酶促反应中能够分别以α-amyrin，β-amyrin和lupeol为底物，催化C-28位的连续三步氧化反应，最终分别生成熊果酸，齐墩果酸和白桦脂酸。酵母体内试验进一步表明:同时导入了CrAO和CrAS的酿酒酵母能够同时生成熊果酸和齐墩果酸，二者的比率为2.2∶1。而同时导入了CrAO和拟南芥中的AtLUP1的酿酒酵母能够生成白桦脂酸。\n 3)CrAS和CrAO是长春花中五环三萜合成途径中的两个关键酶:QPCR结果表明，CrAS和CrAO主要在长春花的地上部分表达，其中叶片中表达量最高，而地下部分基本没有表达，这与熊果酸和齐墩果酸在长春花中的积累情况基本一致（熊果酸和齐墩果酸主要在长春花的地上部分积累，其中叶片中含量最高，地下部分含量极低）。另一方面，共表达CrAS和CrAO的酿酒酵母中产生熊果酸和齐墩果酸的比例为2.2∶1，与长春花各部位中熊果酸和齐墩果酸的比值(3∶1)接近。因此，酶学特性和基因表达特性同时表明CrAS和CrAO参与了长春花中的五环三萜合成途径，是其中的两个关键酶基因。

关键词：二苯甲酮合酶查尔酮合酶元宝草香树脂醇合酶生物学功能组织表达特性

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云斑天牛触角特异表达BhorOBPs与配基结合特性及机制分析

云斑天牛触角特异表达BhorOBPs与配基结合特性及机制分析

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作者：吴娟华中农业大学

学位级别：硕士

昆虫利用高度灵敏的嗅觉感受系统识别自然环境中的信息化学物质。气味结合蛋白（Odorant-Binding Proteins,OBPs）参与运输信息化学物质穿过昆虫嗅觉感器淋巴液,是昆虫嗅觉识别过程中的重要功能蛋白。云斑天牛Batocera horsfieldi（Hop... 详细信息

昆虫利用高度灵敏的嗅觉感受系统识别自然环境中的信息化学物质。气味结合蛋白（Odorant-Binding Proteins,OBPs）参与运输信息化学物质穿过昆虫嗅觉感器淋巴液,是昆虫嗅觉识别过程中的重要功能蛋白。云斑天牛Batocera horsfieldi（Hope）是我国重要蛀干害虫,由于其具有生活隐蔽和分布广泛以及生活周期长等为害特点,常规化学防治手段难达到理想防治效果,研发行为调控剂、建立基于行为调控的天牛种群监测及防控技术,从而实现云斑天牛绿色可持续治理是当前重要任务之一。课题组前期通过转录组测序共鉴定36个BhorOBPs基因,研究发现触角中特异表达的BhorOBP8、BhorOBP22和BhorOBP28与多种寄主植物挥发物有较好的结合能力,推测其可能参与了云斑天牛的嗅觉识别过程。然而,对其他BhorOBPs基因的组织表达特性,以及是否还有其它BhorOBPs基因参与云斑天牛的嗅觉识别过程目前并不清晰。为此,本研究拟在明确云斑天牛BhorOBPs组织表达特性的基础上,探究触角特异表达基因体外重组蛋白BhorOBP6、BhorOBP25和BhorOBP29与气味物质的结合特性,分析云斑天牛对与BhorOBPs具有结合能力气味物质的电生理活性,解析BhorOBP29与气味物质的结合机制。以期为进一步探明BhorOBPs在云斑天牛嗅觉感受过程中的生物学功能奠定理论基础。主要研究结果如下: 1.探明了云斑天牛BhorOBPs基因的组织表达特性通过荧光定量PCR技术,测定了云斑天牛BhorOBPs组织表达情况。结果表明,BhorOBP6、BhorOBP8、BhorOBP22、BhorOBP25、BhorOBP26、BhorOBP28和BhorOBP29在雌雄成虫的触角中特异性表达。BhorOBP1、BhorOBP3、BhorOBP15、BhorOBP16、BhorOBP21、BhorOBP27和BhorOBP33在雌雄成虫的下唇须和下颚须中显著性高表达。BhorOBP2在雄成虫足中极显著高表达。在嗅觉相关器官中高表达的BhorOBPs可能参与了云斑天牛的嗅觉识别过程。 2.明确了云斑天牛触角特异表达BhorOBPs与配体的结合特性以嗅觉相关器官中特异表达的BhorOBPs基因为研究对象,成功构建重组表达载体p ET-21b-BhorOBP6、p ET-21b-BhorOBP25和p ET-20b-BhorOBP29,原核表达并纯化3个重组纯蛋白。通过荧光竞争性结合实验,测定了重组BhorOBP6、BhorOBP25和BhorOBP29与27种云斑天牛寄主植物挥发物的结合力。结果表明,在p H 7.4条件下,重组BhorOBP6与2-Methylbutyraldehyde有结合能力（Ki<50μM）;重组BhorOBP25与D-Limonene、β-Pinene、（E）-β-Ocimene和（+）-Longifolene有结合能力（Ki<50μM）;重组BhorOBP29与Hexana、β-Pinene、（-）-Limonene、（E）-β-Ocimene、Camphor、β-Caryophyllene、Dodecane、Ethyl acetate、Hexane和2-Methylbutyraldehyd等10种化合物有结合能力（Ki<50μM）。通过荧光淬灭实验,分析了重组BhorOBPs与具有结合能力气味物质的淬灭类型及结合作用力。结果表明,重组BhorOBP6与2-Methylbutyraldehyde发生静态淬灭,结合的主要作用力为疏水作用力;重组BhorOBP25与D-Limonene、β-Pinene和（E）-β-Ocimene发生静态淬灭,结合的主要作用力为疏水作用力、氢键与范德华力;重组BhorOBP29与Hexana、（-）-Limonene、（E）-β-Ocimene、Camphor、β-Caryophyllene、Hexane和2-Methylbutyraldehyd等7种化合物发生静态淬灭,结合的主要作用力为疏水作用力、氢键与范德华力。表明重组蛋白可以与气味物质形成稳定的复合物。 3.明确了云斑天牛对有结合能力气味物质的电生理活性利用触角电位（Electroantennogram,EAG）技术,测定了云斑天牛对与BhorOBPs具有结合能力且发生静态淬灭的9种气味物质的电生理活性。结果表明,云斑天牛成虫仅对Hexanal,（-）-Limonene和2-Methylbutyraldehyde有明显的EAG反应,且对同种化合物的EAG反应随着化合物浓度的增加而增强;其中对Hexanal的反应最强烈,对（-）-Limonene的反应最弱。云斑天牛产生EAG反应的3种化合物与Bhor

关键词：云斑天牛气味结合蛋白组织表达特性结合特性结合机制

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两种海洋双壳贝类多不饱和脂肪酸合成相关基因的克隆与功能鉴定

两种海洋双壳贝类多不饱和脂肪酸合成相关基因的克隆与功能鉴定

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作者：王亚骏汕头大学

学位级别：硕士

多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids, PUFA）指双键数>2且碳原子数>18的直链脂肪酸，而双键数>3且碳原子数>20的PUFA则称为高度不饱和脂肪酸（Highly unsaturated fatty acid, HUFA）。其中具有... 详细信息

多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids, PUFA）指双键数>2且碳原子数>18的直链脂肪酸，而双键数>3且碳原子数>20的PUFA则称为高度不饱和脂肪酸（Highly unsaturated fatty acid, HUFA）。其中具有重要生理功能的PUFA主要有花生四烯酸（AA）、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），它们是生物体正常生长发育的必需脂肪酸。研究表明，海产贝类富含PUFA，但是不具有或具有非常微弱的PUFA合成能力。近年来，陆续从章鱼（Octopus vulgaris）、鲍（Haliotis discus hannai Ino）中克隆得到脂肪酸去饱和酶（Fatty acid desaturase, FAD）和脂肪酸碳链延长酶（Elongtion of very long chain fatty acid protein, ELOVL），填补了软体动物PUFA合成途径中关键酶基因研究的空白。本文对两种华南地区重要海水养殖品种：华贵栉孔扇贝（Chlamys nobilis）和葡萄牙牡蛎（Crassostrea angulata）的FAD和ELOVL基因进行克隆和功能鉴定，并对其组织表达特性进行研究，另外研究了华贵栉孔扇贝FAD基因在胚胎发育过程中的表达量变化。主要结果如下：\n 1、采用RT-PCR和RACE-PCR方法，从华贵栉孔扇贝和葡萄牙牡蛎中分别克隆得到一个FAD基因和一个ELOVL基因。扇贝FAD基因cDNA全长为1714bp（不含polyA），1287bp的开放阅读框编码了428个氨基酸，理论等电点为8.80，预计蛋白质分子量大小为50.5 KDa。牡蛎FAD基因cDNA全长1551bp，1311bp的开放阅读框编码437个氨基酸，理论等电点为8.37，预计蛋白质分子量大小为51.0 KDa。氨基酸序列与哺乳动物去饱和酶基因FADS1(Δ5)和FADS2(Δ6)拥有48%-53%相似性，与多种硬骨鱼的FAD的相似度为48%-51%。具有典型的FAD的结构特性。经功能鉴定，扇贝FAD基因的表达产物具有Δ5 FAD去饱和酶活性，牡蛎FAD基因的表达产物无明显功能。\n 2、扇贝Elovl基因cDNA全长为1291bp,924bp的开放阅读框编码307个氨基酸，理论等电点为9.46，预计蛋白质分子量为36.1 KDa。牡蛎Elovl基因cDNA全长1433bp，930bp的开放阅读框编码310个氨基酸，理论等电点为9.52，预计蛋白质分子量大小为36.0 KDa。氨基酸序列与其他物种延长酶的序列相似度为42%-45%。具有典型的碳链延长酶的结构特性，经功能鉴定，该两个基因的表达产物具有碳链延长活性，功能和进化上与脊椎动物Elovl5较接近。\n 3、采用Real-Time PCR检测上述四个基因的组织表达特性。华贵栉孔扇贝Δ5 FAD基因在所有组织中都有表达，在性腺和肝胰腺中表达量最高，其次分别是外套膜、血液、鳃、肾脏和肠道，在闭壳肌中表达量最低。扇贝Elovl基因在所有检测的组织中也都有表达，但是在血液中表达量最高，其次分别是性腺、外套膜、肝胰腺、肠道和鳃，在肾脏和闭壳肌中表达量最低。葡萄牙牡蛎Δ5 FAD基因在检测的所有组织中都有表达，在外套膜和鳃中的表达量最高，其次是性腺，在闭壳肌中的表达量最低。牡蛎Elovl在鳃和外套膜中表达量最高，在性腺中的表达量最低。\n 4、采用RT-PCR研究华贵栉孔扇贝胚胎发育过程中Δ5 FAD基因表达量的变化。结果显示Δ5 FAD在华贵栉孔扇贝的整个胚胎发育过程中都有表达，在卵中的表达量最高，从原肠胚时期开始减少，到3月大的稚贝期又开始增加。\n 本文首次从两种海洋双壳贝类中获得PUFA合成途径关键基因，同时研究了这些基因的组织表达特性，初步探索了华贵栉孔扇贝Δ5 FAD基因在扇贝早期发育过程中的表达量变化情况。为今后进一步探索这两种贝类PUFA合成途径的调控打下了基础，丰富了软体动物PUFA合成途径关键酶的研究。

关键词：海洋双壳贝类多不饱和脂肪酸基因克隆功能鉴定组织表达特性

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牛A-FABP多克隆抗血清制备及组织表达分析

牛A-FABP多克隆抗血清制备及组织表达分析

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作者：季舒涵西北农林科技大学

学位级别：硕士

本试验根据Genbank提供的序列设计特异性引物,以牛脂肪组织为材料提取总RNA,采用RT-PCR方法对牛脂肪型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)基因进行扩增,构建该基因的原核表达载体,诱导表达此蛋白,免疫家兔制备多克隆抗血清。采用Elisa法测定所制得... 详细信息

本试验根据Genbank提供的序列设计特异性引物,以牛脂肪组织为材料提取总RNA,采用RT-PCR方法对牛脂肪型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)基因进行扩增,构建该基因的原核表达载体,诱导表达此蛋白,免疫家兔制备多克隆抗血清。采用Elisa法测定所制得抗血清的效价,分别在mRNA水平和蛋白水平上对牛A-FABP的组织表达特性进行分析。使用DNAMAN、NCBI等一系列在线软件及工具对该基因序列进行生物学功能及其编码蛋白质的结构和特性等生物信息学分析。本研究为在蛋白水平上研究牛A-FABP基因的功能和深入研究此基因与肉质性状的关系奠定了基础。研究结果如下: 1、牛A-FABP基因多克隆抗血清的制备采用RT-PCR方法扩增了牛A-FABP基因的cDNA序列,构建了牛A-FABP基因的原核表达载体。诱导表达并纯化A-FABP蛋白,免疫家兔,制备了高效价(1∶3200)的牛A-FABP多克隆抗血清。 2、牛A-FABP基因的组织表达特性分析 mRNA水平上的组织表达分析使用Real-Time PCR技术完成检测。选取心脏、肝脏、脾脏、肺、脂肪、肾脏、小肠、肌肉8种组织提取总RNA,反转录得到cDNA作为模板进行Real-Time PCR检测,分析后得知,牛A-FABP仅在脂肪组织中有高量表达。蛋白水平上的组织表达分析采用Western Blot方法完成检测。选取心脏、肝脏、脾脏、肺、脂肪、肾脏、小肠、肌肉8种组织提取总蛋白,进行Western Blot检测分析后得知,牛A-FABP仅在脂肪组织中表达,其他组织都不表达。 3、牛A-FABP基因的生物信息学分析分析牛A-FABP序列,得知此序列的A、C、G、T四种碱基组成百分比为32%、17%、22%、29%,含有15个酶切位点,编码的蛋白质分子质量为14.7KDa,二级结构主要以α–螺旋、不规则盘绕和延伸链为结构元件,含132个氨基酸,其中强碱性氨基酸18个,强酸性氨基酸19个,疏水氨基酸45个,不带电荷的极性氨基酸32个;含有6个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个肉豆蔻酰基化位点,1个FABP结合域;含有4个Ser、6个Thr、1个Tyres,这11个氨基酸可能成为蛋白激酶磷酸化位点;具有脂钙蛋白结合域,没有信号肽;无明显跨膜区,不含有二硫键。牛A-FABP基因氨基酸序列与人、鸡、小鼠、大鼠、野猪的氨基酸同源性分别为84.09%, 85.61%,71.97%, 88.33%, 81.82%,表明在进化关系上A-FABP氨基酸序列有较好的保守性。

关键词：牛 A-FABP 组织表达特性生物信息学

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鸡BRDs蛋白家族的亚细胞定位及其在鸡不同组织发育中的表达分析

鸡BRDs蛋白家族的亚细胞定位及其在鸡不同组织发育中的表达分析

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作者：韩一帆贵州大学

学位级别：硕士

溴结构域最早是由研究人员对果蝇Brahma蛋白的氨基酸序列比较分析的过程中发现。含溴结构域蛋白(Bromodomain-containing protein,BRD)除可以调控基因转录外,还与生长发育、疾病发生等有关。在体内广泛表达的BRDs蛋白主要包括BRD1、BRD2... 详细信息

溴结构域最早是由研究人员对果蝇Brahma蛋白的氨基酸序列比较分析的过程中发现。含溴结构域蛋白(Bromodomain-containing protein,BRD)除可以调控基因转录外,还与生长发育、疾病发生等有关。在体内广泛表达的BRDs蛋白主要包括BRD1、BRD2、BRD3、BRD4、BRD7、BRD8、BRD9共7个成员,虽然BRDs蛋白在人类和小鼠的研究中已较为广泛,但鸡BRDs蛋白的亚细胞定位、在鸡胚不同发育阶段各组织以及鸡卵巢各组织中的表达情况尚不明确。本研究对鸡BRDs蛋白基因进行克隆和序列分析,并对鸡BRDs蛋白进行亚细胞定位研究,同时利用实时荧光定量PCR技术检测BRDs基因在鸡胚发育过程中不同组织和在产蛋高峰期不同品种母鸡生殖系统中的表达特性。主要研究结果如下:1.成功扩增鸡BRDs基因CDS区,并分别构建了鸡BRDs基因的重组真核表达载体。生物信息学分析结果表明,鸡BRD1、BRD2、BRD3、BRD4、BRD7、BRD8和BRD9基因的CDS区分别为3561bp、2340bp、2169bp、4137bp、1956bp、2811bp、1953bp,编码1186、779、722、1378、651、936、650个氨基酸;鸡BRDs蛋白含有丰富的二级结构,但主要以无规则卷曲和α-螺旋为主;鸡与人和哺乳动物BRDs蛋白的同源性为76.1%～91.4%,其中BD结构域的同源性84.5%～100.0%。荧光观察结果显示,鸡BRDs蛋白均定位在细胞核。2.分别采集贵州黄鸡鸡胚期14d(E14 d)、1日龄(1 d)、7日龄(7 d)、14日龄(14 d)的眼球、脑组织、心脏、肝脏、肺脏、肌胃、胸肌和腿肌8个组织,提取组织总RNA并反转录合成cDNA。利用实时荧光定量PCR方法检测BRDs基因在贵州黄鸡鸡胚发育不同阶段不同组织中的表达情况。结果表明,鸡BRDs基因在鸡各组织中均有表达。基因表达变化规律分析发现,BRDs基因在眼球内均从E14d至1d内的表达稳定或略有上升,在1d到7d内出现大幅度上升,在7d至14d时又出现下降,在其他组织中呈现不同趋势。以上研究表明,BRDs基因在鸡胚生长发育的不同阶段不同组织中均有表达,且表达水平和表达模式不相同,这为后续揭示BRDs基因调控鸡相关组织发育的作用机制打下基础。3.选取贵州黄鸡和长顺绿壳蛋鸡产蛋高峰期母鸡(约200日龄)各3只,分别采集卵巢、输卵管伞、输卵管蛋白分泌部、输卵管峡部、输卵管子宫部、输卵管阴道部6个组织,提取各组织总RNA并反转录合成cDNA,以鸡GAPDH基因为内参基因,利用实时荧光定量PCR方法检测鸡BRDs基因在不同鸡种产蛋高峰生殖系统各组织中的表达量。结果表明,鸡BRDs基因在贵州黄鸡和长顺绿壳蛋鸡的各生殖系统组织中均有表达,其中在贵州黄鸡卵巢中BRD1、BRD2、BRD3、BRD4、BRD7和BRD8基因的表达量最高,而BRD9基因在输卵管峡部的表达量最高;在长顺绿壳蛋鸡卵巢中BRD1、BRD3、BRD7、BRD8和BRD9基因的表达量最高,而BRD2基因和BRD4基因分别在输卵管子宫部和输卵管阴道部表达量最高。另外,在卵巢组织中,除了BRD3基因以外,贵州黄鸡其它BRDs基因的表达量均要显著高于长顺绿壳蛋鸡。以上结果为开展鸡BRDs基因与鸡产蛋量的相关性研究奠定了基础。

关键词：鸡溴结构域含溴结构域蛋白亚细胞定位组织表达特性

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鸡ANP32家族蛋白的亚细胞定位、组织表达及在新城疫病毒复制中的作用研究

鸡ANP32家族蛋白的亚细胞定位、组织表达及在新城疫病毒复制中的...

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作者：邢静如贵州大学

学位级别：硕士

酸性亮氨酸磷酸核蛋白(acidic leucine nuclear phosphoprotein 32,ANP32)是一类进化高度保守的小分子蛋白家族,其成员包括ANP32A、ANP32B和ANP32E。ANP32家族蛋白成员之间具有相似的结构特征,其中N端为富含亮氨酸的重复区域(leucine-ri... 详细信息

酸性亮氨酸磷酸核蛋白(acidic leucine nuclear phosphoprotein 32,ANP32)是一类进化高度保守的小分子蛋白家族,其成员包括ANP32A、ANP32B和ANP32E。ANP32家族蛋白成员之间具有相似的结构特征,其中N端为富含亮氨酸的重复区域(leucine-rich repeats,LRRs),为蛋白的相互作用提供了框架;C端为低复杂性酸性区域(low complexity acidic region,LCAR),便于与细胞核内的碱性蛋白结合。有研究报道鸡ANP32B蛋白与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)M蛋白相互作用,促进M蛋白细胞核聚集,但是其它ANP32蛋白是否参与了NDV的复制过程尚不清楚。另外,有关鸡ANP32家族蛋白的亚细胞定位、在免疫器官(脾脏、胸腺、法氏囊)中的表达特征也尚未明晰。因此,本研究首先开展鸡ANP32家族蛋白的亚细胞定位和介导其细胞核定位关键氨基酸位点的分析与鉴定,并利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)方法检测ANP32家族蛋白基因在不同月龄鸡免疫器官(脾脏、胸腺、法氏囊)和鸡感染NDV后的免疫器官中的表达水平,同时对ANP32家族蛋白与NDV复制的关系进行探讨。相关研究结果如下:1通过生物信息学软件对鸡ANP32家族蛋白二级结构、三级结构、氨基酸同源性、结构域保守性和核定位信号NLS(nuclear localization signal,NLS)保守性进行分析;同时,构建表达鸡ANP32家族蛋白NLS及其碱性氨基酸位点突变体的重组真核表达载体并转染细胞,通过观察分析其亚细胞定位来鉴定其NLS中的关键碱性氨基酸位点。结果显示:鸡ANP32家族蛋白二级结构和三级结构均以α-螺旋和无规则卷曲为主,其与鸭ANP32家族蛋白的氨基酸同源性最高,且两者的LRRs和LCAR结构域完全保守。另外,鸡ANP32家族蛋白核定位信号在不同物种间高度保守,均为KRKR。亚细胞定位分析发现,标签蛋白EGFP定位在细胞核和细胞质,而融合蛋白EGFP-ANP32A、EGFP-ANP32B和EGFPANP32E主要定位在细胞核,表明鸡ANP32家族蛋白均主要定位在细胞核。NLS点突变结果显示,NLS中的第一个K、第一个R和第二个K突变均使NLS融合蛋白由细胞核定位变为细胞核和细胞质定位,表明这三个位点是介导鸡ANP32家族蛋白细胞核定位的关键碱性氨基酸位点。2采用RT-qPCR方法检测ANP32家族蛋白基因在1～6月龄鸡免疫器官(脾脏、胸腺、法氏囊)中的表达水平。结果显示:ANP32家族蛋白基因在1～6月龄鸡免疫器官(脾脏、胸腺、法氏囊)中均有表达。其中,ANP32A和ANP32E基因在1～6月龄鸡免疫器官中呈先上升后下降的表达趋势,在2月龄免疫器官中的相对表达量达到峰值,在脾脏、胸腺、法氏囊中的ANP32A基因相对表达量比其它月龄分别高1.6～10.9倍、1.6～18.8倍和3.4～14.5倍;2月龄脾脏、法氏囊中的ANP32E基因相对表达量比其它月龄分别高3.4～61.9倍、1.7～132.4倍。ANP32B基因的表达则呈下降趋势,以1月龄鸡免疫器官中的相对表达量最高,在脾脏、胸腺、法氏囊中的ANP32B基因相对表达量比其它月龄分别高1.7～16.8倍、2.2～31.3倍和2.8～20.1倍。3采用RT-qPCR方法检测NDV感染SPF鸡后第3～5 d免疫器官(脾脏、胸腺、法氏囊)中的表达水平。结果显示:ANP32家族蛋白基因在鸡感染NDV后第3～5 d免疫器官(脾脏、胸腺、法氏囊)中均有表达,ANP32A基因呈一直上升的趋势,ANP32B和ANP32E基因均呈先上升后下降的趋势。另外,ANP32A基因在NDV感染后第3 d和第4 d均在法氏囊中的表达量最高,分别为其他组织的1.0～2.1倍和1.1～1.4倍,ANP32A基因在NDV感染后第5 d在脾脏中的表达量最高,为其他组织的1.5～2.6倍;ANP32B基因在NDV感染后第3 d法氏囊中的表达量最高,为其他组织的3.2～4.2倍,ANP32B基因在NDV感染后第4 d和第5 d均在脾脏中的表达量最高,分别为其他组织的1.3～1.6倍和2.9～4.4倍;ANP32E基因在NDV感染后第3 d法氏囊中的表达量最高,为其他组织的2.2～2.6倍,ANP32E基因在NDV感染后第4 d和第5 d均在脾脏中的表达量最高,分别为其他组织的3.3～3.4倍和2.1～3.2倍。4利用RT-qPCR方法检测鸡ANP32家族基因在NDV感染细胞后不同时间点的表达情况,结果发现NDV感染鸡胚成纤维细胞(DF-1)后的6、12和24 h均能引起鸡ANP32家

关键词：鸡 ANP32家族蛋白新城疫病毒亚细胞定位核定位信号组织表达特性

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桑树韧皮部汁液mul-miR482和mul-miR58的生物学功能研究

桑树韧皮部汁液mul-miR482和mul-miR58的生物学功能研究

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作者：郭方月山东农业大学

学位级别：硕士

植物在长期的进化过程中形成了特有的信息交流网络,韧皮部作为信号分子长距离传递的主要通道,具有感应环境信号、传导系统信号的功能。韧皮部汁液中具有丰富的mi RNA,汁液中的mi RNAs作为一种重要的调控因子,在调控基因表达方面有非常... 详细信息

植物在长期的进化过程中形成了特有的信息交流网络,韧皮部作为信号分子长距离传递的主要通道,具有感应环境信号、传导系统信号的功能。韧皮部汁液中具有丰富的mi RNA,汁液中的mi RNAs作为一种重要的调控因子,在调控基因表达方面有非常广泛的生物学功能。本研究根据已有的桑树转录组信息,克隆得到桑树韧皮部汁液mul-mi R482和mul-mi R58的基因,采用定量PCR技术分析了其组织表达特性,并利用转基因技术研究了mul-mi R482和mul-mi R58的生物学功能;利用Tail-PCR技术扩增得到mul-mi R482基因的启动子,通过GUS组织化学染色分析了其表达活性;采用拟南芥微嫁接技术对mul-mi R482的可运输性进行了分析。研究结果为揭示桑树mul-mi R482和mul-mi R58的生物功能以及韧皮部介导的mi RNA长距离传导的分子调控机制奠定了基础,同时为桑树功能基因组学研究提供了参考。本文的主要研究结果如下:(1)桑树韧皮部汁液mul-mi R482的生物学功能分析根据已有的桑树转录组序列信息,利用PCR技术克隆得到桑树mul-mi R482的基因,命名为Mul MIR482,构建了其植物表达载体,并成功转化了拟南芥。通过Northern-blot和荧光定量PCR分析发现Mul MIR482基因能在转基因拟南芥植株中高效表达并加工形成成熟体。Mul-mi R482在拟南芥中表达使植株表型发生明显变化,降低了转基因植株的耐盐能力,提高了植株对丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae *** DC3000,Pst DC3000)的敏感性。因此,mul-mi R482对植物的生长发育具有一定的调节作用,并在植物对盐分胁迫的响应和抗病反应过程中起着负调控作用。(2)桑树韧皮部汁液中mul-mi R482的组织表达特性分析利用Tail-PCR方法克隆得到Mul MIR482的侧翼序列共1937bp,分析发现该序列中包含23个顺式作用元件,其中包含CAAT-BOX和TATA-BOX启动子核心元件及其它多种转录因子结合位点和基因转录调控元件。构建该启动子启动GUS基因的植物表达载体,转化拟南芥,对转基因植株进行GUS组织化学分析,结果显示pmi R482-GUS在植株的茎和花中表达量高,在根中表达量很低,而在叶片和果荚中则不表达,表明Mul MIR482基因表达有组织特异性;利用荧光定量PCR对mul-mi R482成熟体的组织表达特性分析发现,mul-mi R482成熟体在桑树根、果实、树皮和叶片中均有表达,表明mul-mi R482成熟体的积累没有组织特异性,但其在不同组织和器官中的丰度具有明显差异,在根组织中的丰度最高,而在叶片中的丰度最低。(3)桑树韧皮部汁液mul-mi R482的运输性分析分别以转基因幼苗和野生型幼苗做砧木(或接穗)和接穗(或砧木)进行嫁接,利用荧光定量PCR分析砧木与接穗部分中mul-mi R482表达丰度。分析结果表明,mul-mi R482在植物体内可以上下双向运输,但由上往下运输量大于由下往上的运输量或者主要是由上往下进行运输。(4)桑树韧皮部汁液mul-mi R58的生物学功能分析利用PCR技术克隆得到桑树mul-mi R58的基因,命名为Mul MIR58,荧光定量PCR分析发现mul-mi R58在桑树根、果实、树皮均有很高的表达量,而在叶片中的表达量极低。将Mul MIR58转入拟南芥获得了转基因植株,通过Northern-blot和荧光定量PCR分析发现Mul MIR58基因能在转基因拟南芥植株中高效表达并加工形成成熟体,与野生型相比转基因植株的耐盐能力降低,对Pst DC3000侵染的敏感性增强。因此,mul-mi R58可能在植物对盐分胁迫的响应和抗病反应过程中起着负调控作用。

关键词：桑树 mul-mi R482 mul-miR58 生物学功能组织表达特性运输性

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鸡Prox1基因的亚细胞定位及其在不同组织发育中的表达分析

鸡Prox1基因的亚细胞定位及其在不同组织发育中的表达分析

引用

作者：袁超贵州大学

学位级别：硕士

Prox1（Prospero-related homeobox protein 1,Prox1）蛋白是homeo-box转录因子家族中的一个重要成员,在脊椎动物胚胎时期的神经、肝脏、心脏、眼睛和淋巴系统等组织器官发生发育过程中发挥了重要作用,并且其表达和功能的改变还与多种... 详细信息

Prox1（Prospero-related homeobox protein 1,Prox1）蛋白是homeo-box转录因子家族中的一个重要成员,在脊椎动物胚胎时期的神经、肝脏、心脏、眼睛和淋巴系统等组织器官发生发育过程中发挥了重要作用,并且其表达和功能的改变还与多种人类癌症相关。Prox1蛋白含有homeo-prospero结构域和prospero结构域,并且homeo-prospero与prospero结构域形成的同源结构域能特异性结合DNA,调节其它基因的转录。目前,Prox1基因的研究主要集中在人和小鼠,对果蝇、蝾螈、爪蟾、金鱼和斑马鱼也有一些研究。人、小鼠、爪蟾、金鱼和斑马鱼的Prox1基因c DNAs已得到了克隆、序列分析和功能研究,但是鸡Prox1基因的克隆、亚细胞定位以及在鸡组织发育过程中的表达情况尚不清楚。本研究首先对鸡Prox1基因的完整CDS区进行克隆和生物信息学分析,研究鸡Prox1蛋白的亚细胞定位并鉴定介导其细胞核定位的核定位信号,同时采用荧光定量PCR技术检测Prox1基因在鸡胚胎期14天（E14 d）、0日龄（0 d）、7日龄（7 d）和14日龄（14 d）不同组织中的表达情况,分析其在鸡胚组织发育过程中的表达规律。1.鸡Prox1基因的克隆和生物信息学分析根据Gen Bank已发表的鸡Prox1基因序列（NM＿001005616.1）设计合成引物,以鸡眼睛提取的总RNA反转录产物为模板,通过PCR扩增Prox1基因CDS区,利用生物信息学软件,对Prox1蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、亚细胞定位、互作蛋白、蛋白结构域和系统进化树进行分析。结果表明:从鸡眼睛提取的总RNA反转录产物中成功扩增出鸡Prox1基因CDS区,其长度为2211 bp,共编码736个氨基酸,理论p I为6.62,相对分子质量约为82.86 ku,分子式为C3601H5671N1049O1136S32。序列分析表明,鸡Prox1蛋白二级结构主要是由无规则卷曲（占53.67%）和α螺旋组成（占39.40%）。亚细胞定位和互作蛋白预测结果显示:鸡Prox1蛋白主要定位在细胞核,与其互作的细胞蛋白主要有LYVE1、PAX6、KDR、VEGFC和FLT4。核苷酸同源性及遗传进化分析发现,鸡与鹌鹑Prox1基因核苷酸同源性最高（为97.8%）,并且与鹌鹑的亲缘关系最近。以上研究为下一步开展鸡Prox1蛋白细胞核定位信号的鉴定和组织表达特性提供基础。2.鸡Prox1蛋白细胞核定位信号的预测和鉴定以构建的鸡Prox1基因重组克隆质粒p CR2.1-Prox1为基础,构建鸡Prox1基因的重组真核表达载体p EGFP-Prox1,将其转染HEK-293T细胞,通过Western blotting方法检测重组蛋白的表达,同时利用倒置荧光显微镜观察和分析重组蛋白的亚细胞定位。另外,运用在线软件预测鸡Prox1蛋白中假定存在的NLS（putative NLS,p NLS）,构建鸡Prox1蛋白p NLS缺失体重组真核表达载体,转染细胞后通过观察缺失体重组蛋白的亚细胞定位来确定NLS。同时,将鉴定的鸡Prox1蛋白NLS进行保守性分析,并检测其对外源蛋白的核输入能力。另外,将NLS中的碱性氨基酸位点进行突变,鉴定鸡Prox1蛋白NLS中的关键碱性氨基酸位点。结果表明,成功构建了鸡Prox1基因的重组真核表达载体p EGFP-Prox1,转染细胞后重组蛋白EGFP-Prox1正确表达;荧光观察和亚细胞定位分析结果显示EGFP-Prox1重组蛋白主要定位在细胞核。对鸡Prox1蛋白NLS预测结果显示,鸡Prox1蛋白中共存在6个p NLS。进一步对p NLS缺失体重组蛋白的亚细胞定位分析发现,p NLS1(15KRRR18)和p NLS2(163RAKRAR168)共同决定了鸡Prox1蛋白的细胞核定位。另外,鸡Prox1蛋白NLS1和NLS2基序在其它禽类、人和不同哺乳动物间均保守,并且与SV40大T抗原NLS具有相同的核输入能力。此外,碱性氨基酸点突变试验结果证实,K15、R16和R18,K165、R166和R168分别是鸡Prox1蛋白NLS1和NLS2中的关键碱性氨基酸位点。以上研究结果表明,两个高度保守的NLS1(15KRRR18)和NLS2(163RAKRAR168)共同决定了鸡Prox1蛋白的细胞核定位。3.鸡Prox1基因在鸡胚不同发育阶段不同组织中的表达特性分析分别采集鸡胚胎期14天（E14 d）、0日龄（0 d）、7日龄（7 d）和14日龄（14 d）4个时间点的眼、脑、心、肝、肺、胃、胸肌和腿肌的样品。提取总RNA并反转录成c DNA,设计荧光定量PCR引物,通过荧光定量PCR方法检测Prox1基因在鸡肝、肾、脑、眼睛、肌

关键词：鸡 Prox1蛋白亚细胞定位核定位信号组织表达特性

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紫苏二酰甘油酰基转移酶基因(PfDGAT1)鉴定及表达分析

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山西农业科学 2019年第5期47卷 701-705页

作者：周雅莉任文燕郝月茹安茜段露露李润植王计平山西农业大学农学院山西太谷030801 山西农业大学分子农业与生物能源研究所山西太谷030801

二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是TAG合成过程中的限速酶。以晋紫苏1号为材料,采用电子克隆技术获得DGAT1基因(PfDGAT1,AF298815.1),并对PfDGAT1基因序列进行生物信息学及表达特性分析。结果表明,PfDGAT1基因序列全长为1 964 bp,开放阅读框... 详细信息

二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是TAG合成过程中的限速酶。以晋紫苏1号为材料,采用电子克隆技术获得DGAT1基因(PfDGAT1,AF298815.1),并对PfDGAT1基因序列进行生物信息学及表达特性分析。结果表明,PfDGAT1基因序列全长为1 964 bp,开放阅读框长度为1 605 bp,共编码534个氨基酸残基;多序列比对和系统进化树分析表明,紫苏Pf DGAT1蛋白与芝麻、油橄榄的DGAT1蛋白的亲缘关系较近,序列同源性分别为89%和83%;利用实时荧光定量PCR技术分析PfDGAT1基因在紫苏不同组织中的表达特性,结果显示,PfDGAT1基因在紫苏不同组织中均有表达,但在种子中表达量最高,且随种子发育表达量呈先升高后降低的变化趋势,在开花后20 d表达量达到最高。

关键词：紫苏二酰甘油酰基转移酶(DGAT) 基因克隆组织表达特性

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鸡BMP15基因组织表达研究

鸡BMP15基因组织表达研究

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中国畜牧兽医学会家禽学分会第十七次全国家禽学术研讨会

作者：周艳雷秋霞韩海霞李福伟高金波刘玮逯岩曹顶国山东省农业科学院家禽研究所济南250023 山东省家禽育种工程技术研究中心济南250023

分析BMP15基因组织表达特性,探讨其与莱芜黑鸡繁殖性状相关的生物学功能.19W、23W、40W各随机选取莱芜黑鸡5只,取肝脏、输卵管、卵巢组织以及40W各级卵泡,利用荧光定量PCR技术检测BMP15基因的组织表达特性.荧光定量检测结果表明,BMP15... 详细信息

分析BMP15基因组织表达特性,探讨其与莱芜黑鸡繁殖性状相关的生物学功能.19W、23W、40W各随机选取莱芜黑鸡5只,取肝脏、输卵管、卵巢组织以及40W各级卵泡,利用荧光定量PCR技术检测BMP15基因的组织表达特性.荧光定量检测结果表明,BMP15基因在直径4mm的白卵泡中相对表达量最高,与其它各级卵泡间差异极显著(P＜0.01).在卵巢组织中,BMP15基因在开产前(19W)表达量最高,开产后显著下调(P＜0.05),而后上调.在肝脏组织中,随着日龄的增加表达量逐步上调,但差异不显著(P＞0.05).同一时期BMP15基因的表达量趋势均为卵巢＞输卵管＞肝脏,在卵巢组织中的表达量极显著高于肝脏和输卵管组织(P＜0.01).研究表明BMP15基因存在组织表达差异,在卵巢组织中表达量最高.而且在4mm白卵泡中的表达量极显著高于其他等级卵泡,表明BMP15基因在卵巢卵泡发育尤其是初级卵泡发育过程中发挥重要作用.

关键词：鸡 BMP15基因繁殖性状组织表达特性

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