检索结果-内蒙古大学图书馆

中国组织工程研究与临床康复 2009年第24期13卷 4668-4672页

作者：丁浩李菊香洪葵万磊夏子荣颜素娟罗伟程晓曙吴清华苏海吴延庆南昌大学医学院第二附属医院心内科江西省南昌市330006

背景:利用RNAi技术引发细胞因子信号转导抑制因子1沉默可促进神经内分泌肿瘤细胞的凋亡,然而对于内皮细胞是否有类似的作用,目前尚不清楚。目的:实验拟验证内皮细胞中是否有细胞因子信号转导抑制因子1表达,并在所设计的siRNA中,筛选出1... 详细信息

背景:利用RNAi技术引发细胞因子信号转导抑制因子1沉默可促进神经内分泌肿瘤细胞的凋亡,然而对于内皮细胞是否有类似的作用,目前尚不清楚。目的:实验拟验证内皮细胞中是否有细胞因子信号转导抑制因子1表达,并在所设计的siRNA中,筛选出1对对细胞因子信号转导抑制因子1沉默效率最高的siRNA。设计、时间及地点:随机对照,体外细胞学实验,于2007-12/2008-06在南昌大学医学院第二附属医院所属的江西省分子医学重点实验室完成。材料:人脐静脉内皮细胞由南京凯基生物公司提供。方法:设计并化学合成4对靶向细胞因子信号转导抑制因子1的siRNA:siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4。培养人脐静脉内皮细胞,利用RT-PCR检测人脐静脉内皮细胞是否有细胞信号转导抑制因子1表达。将带有荧光标记的阴性对照siRNA配制成25,50,75,100nmol/L的4组,利用脂质体转染细胞,并在荧光倒置显微镜下观察转染效率,对比得出有最佳转染效率的浓度。然后,实验根据不同的处理因素分成8组:siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4和阳性对照组、阴性对照组、转染试剂组、空白对照组4个对照组。将均为有最佳转染效率浓度的各组siRNA转染细胞,48h后提取RNA。主要观察指标:利用RT-PCR测定细胞因子信号转导抑制因子1mRNA的相对表达水平。结果:人脐静脉内皮细胞高表达细胞因子信号转导抑制因子1。siRNA在50nmol/L时有较高的转染效率。4对siRNA干扰后,细胞因子信号转导抑制因子1mRNA的表达水平与阴性对照、转染试剂组和空白对照组相比明显下调(P<0.05),与阳性对照组相比显著下调(P<0.01),其中siRNA-3的沉默效率最高(P<0.05),阴性对照、转染试剂组和空白对照组与阳性对照组相比明显下调(P<0.05),阴性对照、转染试剂组和空白对照组之间差异无显著性意义(P>0.05)。结论:内皮细胞中存在细胞因子信号转导抑制因子1表达。RNAi抑制细胞因子信号转导抑制因子1在内皮细胞中的表达,实验筛选出1对沉默效率最高的siRNA。

关键词：细胞信号转导抑制因子1 内皮细胞 siRNA

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EML4-ALK阳性H2228细胞中SOCS1和SOCS3基因启动子区甲基化状态及其作用的研究

EML4-ALK阳性H2228细胞中SOCS1和SOCS3基因启动子区甲基化状态及...

引用

作者：刘春来天津医科大学

学位级别：硕士

背景和目的:人类棘皮动物微管相关蛋白样4和人类间变性淋巴瘤激酶融合基因EML4-ALK是新发现的非小细胞肺癌的驱动基因,具有独特的临床病理生理特征。ALK基因下游信号通路的异常持续激活是其重要的下游信号通路,而导致其下游基因持续激... 详细信息

背景和目的:人类棘皮动物微管相关蛋白样4和人类间变性淋巴瘤激酶融合基因EML4-ALK是新发现的非小细胞肺癌的驱动基因,具有独特的临床病理生理特征。ALK基因下游信号通路的异常持续激活是其重要的下游信号通路,而导致其下游基因持续激活的原因不明。细胞因子信号转导抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)是一类在细胞信号转导过程中起重要作用的负调控因子,主要通过抑制JAK蛋白酪氨酸激酶(janus protein tyrosine kinase,JAK激酶)信号传导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)即JAK-STAT等信号通路来调控细胞的增殖、分化和凋亡。肿瘤中常存在SOCS基因的甲基化异常导致的失活,从而导致JAK2-STAT等信号通路持续异常活化。本研究的目的在于探讨SOCS1和SOCS3对EML4-ALK融合基因阳性肺癌细胞的影响及其SOCS1和SOCS3启动子区的甲基化情况。方法:甲基化特异性PCR检测EML4-ALK阳性H2228肺癌细胞及肺癌组织中SOCS1和SOCS3启动子区的甲基化状态,并通过测序进行验证。DNA甲基转移酶抑制剂5’-Aza-d C处理H2228细胞,并通过real-time PCR和Western blot检测SOCS1和SOCS3的表达水平变化。ALK抑制剂TAE684、ALK-Si RNA处理H2228细胞,抑制ALK表达,Western blot检测p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6、SOCS1和SOCS3的表达水平变化。在EML4-ALK阴性表达的HEK293细胞中过表达ALK后,Western blot检测JAK-STAT信号通路的活化情况及SOCS1和SOCS3的表达水平变化。用p EGFp-SOCS1和p EGFp-SOCS3质粒转染H2228细胞,通过RT-PCR和Western blot检测SOCS1和SOCS3的表达水平变化,检验转染效果,并用EDU、CCK8和流式细胞计数检测细胞的增殖能力和细胞周期的变化情况。结果:对7例EML4-ALK阳性肺癌患者肿瘤组织和EML4-ALK阳性细胞H2228进行甲基化特异性PCR反应,结果表明H2228细胞和所有的7例EML4-ALK阳性肺癌组织中都存在SOCS1启动子区的部分甲基化,H2228细胞和7例组织中的3例存在SOCS3基因启动子区的部分甲基化。Real-time RCR和Western-Blot结果也证明DNA甲基转移酶抑制剂5'-Aza-d C去甲基化处理H2228细胞后SOCS1和SOCS3表达上调。HEK-293细胞过表达ALK 48h后,JAK-STAT信号通路被激活,ALK和p-ALK蛋白水平的表达明显增高,伴随着ALK和p-ALK的表达增强p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6的表达也随之增加。分别用ALK-Si-RNA和ALK抑制剂TAE-684处理H2228细胞后,ALK和p-ALK蛋白水平的表达明显降低,并且p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6的表达也都降低,JAK-STAT信号通路受到抑制。对H2228细胞进行p EGFp-SOCS1、p EGFp-SOCS3转染处理后,H2228细胞中SOCS1和SOCS3的表达在转录水平上较对照组相比分别增高了10.3倍和93.4倍。Western-Blot结果示转染SOCS1的H2228细胞中SOCS1的表达明显增高,而转染SOCS3的H2228细胞SOCS3表达也明显增高,亦表明转染是成功的。随着SOCS1和SOCS3的表达明显增加,我们发现两组细胞中p-ALK、p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6的表达均有所降低,说明JAK-STAT信号通路受到抑制。EDU的实验结果表明H2228细胞在转染SOCS1和SOCS3后,其细胞增殖能力都要明显低于转染空载体的H2228细胞。统计学结果显示对照组细胞活力56.25%,p EGFp-SOCS1组细胞活力36.45%(P<0.05),p EGFp-SOCS3组细胞活力38.72%(P<0.05)。CCK-8结果与EDU结果一致,H2228细胞过表达SOCS1和SOCS3后与对照组相比,细胞代谢活性抑制率分别为48.49%(P<0.05)和58.33%(P<0.05)。FCM进行细胞周期分析,对照组与实验组G1期和S期细胞数量基本没有差异,但是两个实验组G2期细胞的数量均明显高于对照组,统计学结果显示两个实验组P值均小于0.05。结论:EML4-ALK(+)的H2228细胞及部分肺癌组织中存在SOCS1和SOCS3启动子区的异常甲基化;HEK293细胞中过表达ALK

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