检索结果-内蒙古大学图书馆

应用四聚体酶联免疫斑点法和细胞内细胞因子染色法检测HIV-1感染者体内特异性细胞毒性T淋巴细胞的研究

中国艾滋病性病 2007年第1期13卷 7-10,41页

作者：褚福亮徐东平金磊高福王福生中国科学院微生物研究所分子免疫中心中国科学院研究生院北京100049

目的应用四聚体(tetramer)、酶联免疫斑点法(ELISPOT)和细胞内细胞因子染色(ICCS)方法研究HIV-1感染者细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的数量和功能。方法应用三种tetramer检测14例HLA-A2阳性的HIV-1感染者外周血中特异性CTLs的频率,同时采用SL... 详细信息

目的应用四聚体(tetramer)、酶联免疫斑点法(ELISPOT)和细胞内细胞因子染色(ICCS)方法研究HIV-1感染者细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的数量和功能。方法应用三种tetramer检测14例HLA-A2阳性的HIV-1感染者外周血中特异性CTLs的频率,同时采用SL9(SLYNTVATL)体外冲击HIV-1感染者的外周血单核细胞(PBMCs)。通过ELISPOT和ICCS方法检测产生γ-干扰素(IFN-γ)的CTLs,初步分析特异性CTLs在HIV-1感染中的作用。结果Tetramer SL9、IV9和YI9检测出的特异性CTLs占CD8+T细胞的百分比范围分别为0.06%-3.27%,0.05%-0.57%和0.09%-0.66%;其检出阳性率分别为11/14、10/14和5/7。ELISPOT和ICCS检测的产生IFN-γ的细胞近似,但远低于tetramer检测出的病毒特异性CTLs的数量。结论Tetramer可以敏感地检测出特异性CTLs。ELISPOT和ICCS则是研究CTLs功能的重要手段。联合使用三种方法可以更准确地评价HIV-1感染者体内CTLs的特征及其临床意义。

关键词：艾滋病病毒细胞毒性T淋巴细胞四聚体酶联免疫斑点法细胞内细胞因子染色

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抗马干扰素-γ单克隆抗体的异硫氰酸荧光素标记及应用

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中国生物制品学杂志 2009年第2期22卷 188-191页

作者：白宇张维军童铁钢王群徐树兰孙庆歌杨涛吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

目的用异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗马干扰素-γ(IFN-γ)单克隆抗体,为建立马IFN-γ细胞内细胞因子染色方法提供实验材料。方法利用FITC标记纯化的抗马IFN-γ单克隆抗体(SB10),荧光抗体经系列稀释后,对马外周血单核细胞(PBMC)进行细胞内... 详细信息

目的用异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗马干扰素-γ(IFN-γ)单克隆抗体,为建立马IFN-γ细胞内细胞因子染色方法提供实验材料。方法利用FITC标记纯化的抗马IFN-γ单克隆抗体(SB10),荧光抗体经系列稀释后,对马外周血单核细胞(PBMC)进行细胞内细胞因子IFN-γ单染色的流式细胞术检测,同时与商品化FITC标记的抗牛IFN-γ单克隆抗体(CC302)进行流式细胞术检测对比试验。结果FITC-CC302染色马PBMC,1μl荧光抗体染色106个细胞时,分泌IFN-γ的细胞频率为9.35%,而FITC-SB10经系列稀释染色,在用0.25μl荧光抗体染色106个细胞时,分泌IFN-γ的细胞频率为9.90%。结论所制备的FITC标记的抗马IFN-γ单克隆抗体,可为建立马细胞免疫学研究方法奠定物质基础,进而为建立监测马机体免疫状态和研究机体免疫机制提供技术平台。

关键词：马干扰素-γ 单克隆抗体异疏氰酸荧光素细胞内细胞因子染色

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人类巨细胞病毒特异性CD8^+T细胞IFN-γ和穿孔素水平的检测

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免疫学杂志 2006年第4期22卷 440-443页

作者：查庆兵徐丽慧迟晓云何贤辉肇静娴暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫研究中心暨南大学生命科学技术学院生物工程研究所广州510632

目的研究人巨细胞病毒(hCMV)结构蛋白pp65衍生抗原肽(pp65495503,NLV)特异性CD8+T细胞的功能特性。方法将HLAA2NLV四聚体染色与细胞内细胞因子或穿孔素染色相结合,以流式细胞仪直接分析NLV特异性CD8+T细胞内穿孔素的表达水平,或者在NLV... 详细信息

目的研究人巨细胞病毒(hCMV)结构蛋白pp65衍生抗原肽(pp65495503,NLV)特异性CD8+T细胞的功能特性。方法将HLAA2NLV四聚体染色与细胞内细胞因子或穿孔素染色相结合,以流式细胞仪直接分析NLV特异性CD8+T细胞内穿孔素的表达水平,或者在NLV抗原肽刺激6h后分析γ干扰素(IFNγ)的表达水平。结果NLV抗原肽能诱导hCMV特异性CD8+T细胞分泌IFNγ,不同供者特异性CD8+T细胞产生IFNγ的比率存在较大差异(55.69±17.64)%,当NLV抗原肽质量浓度为10μgmL时IFNγ阳性细胞百分率最高;未经刺激的特异性CD8+T细胞内表达较高水平的穿孔素(53.90±16.41)%。结论识别单一表位的hCMV特异性CD8+T细胞合成IFNγ和穿孔素的能力存在多样性。

关键词：巨细胞病毒 CD8^+T细胞四聚体细胞内细胞因子染色流式细胞术

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NCPP对小鼠巨噬细胞的免疫调节作用

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药物分析杂志 2010年第7期30卷 1205-1208页

作者：曲守方黄杰刘春梅朱法良高尚先中国药品生物制品检定所体外诊断试剂与培养基室北京100050 山东大学医学院免疫学研究所济南250012

目的:探讨无细胞短小棒状杆菌纳米级制剂(NCPP)对小鼠巨噬细胞的影响。方法:采用纳米技术制备NCPP。将NCPP与短小棒状杆菌分别注射小鼠腹腔,10 d后,处死小鼠,收集腹腔液体,分离培养巨噬细胞。采用流式细胞术和ELISA法,检测巨噬细胞分泌... 详细信息

目的:探讨无细胞短小棒状杆菌纳米级制剂(NCPP)对小鼠巨噬细胞的影响。方法:采用纳米技术制备NCPP。将NCPP与短小棒状杆菌分别注射小鼠腹腔,10 d后,处死小鼠,收集腹腔液体,分离培养巨噬细胞。采用流式细胞术和ELISA法,检测巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子(TNF-α)和干扰素(IFN-γ)。结果:流式结果显示,NCPP组小鼠腹腔巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子(TNF-α)明显低于短小棒状杆菌组(P<0.05)。ELISA结果显示,NCPP组小鼠腹腔巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子(TNF-α)明显低于短小棒状杆菌组(P<0.01),分泌的干扰素(IFN-γ)水平明显高于短小棒状杆菌组(P<0.01)。结论:NCPP对巨噬细胞具有免疫调节作用。NCPP可以刺激巨噬细胞产生TNF-α和IFN-γ。TNF-α水平比较低,可能是NCPP副作用较少的原因之一。

关键词：短小棒状杆菌纳米技术巨噬细胞免疫调节细胞内细胞因子染色

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马γ-干扰素单克隆抗体的制备及细胞免疫评价方法的研究

马γ-干扰素单克隆抗体的制备及细胞免疫评价方法的研究

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作者：白宇中国农业科学院

学位级别：博士

γ-干扰素（IFN-γ）是机体内一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的重要细胞因子。研究表明,内源性IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映机体的细胞免疫状态,因此对样本中的IFN-γ进行定量分析对免疫机制研究、免疫功能分析、疫苗... 详细信息

γ-干扰素（IFN-γ）是机体内一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的重要细胞因子。研究表明,内源性IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映机体的细胞免疫状态,因此对样本中的IFN-γ进行定量分析对免疫机制研究、免疫功能分析、疫苗免疫效果评估、器官移植、过敏反应以及多种胞内病原感染的诊断等方面都具有极其重要的理论意义和应用价值。然而,迄今没有应用于检测马IFN-γ的单克隆抗体,用以建立相应的检测方法。本研究旨在建立检测马IFN-γ（Equine interferon-γ, EIFN-γ）抗原捕获ELISA、细胞内细胞因子染色（ICS）和酶联免疫斑点试验（ELISPOT）)等方法,从而为监测马机体免疫状态、研究机体感染或免疫过程中的免疫效应及探讨相关免疫机制等提供技术平台。为此,本研究在克隆表达EIFN-γ之后将其免疫小鼠制备了马IFN-γ单克隆抗体,然后分别对其进行生物素和荧光素（FITC）标记制备了生物素标记的马IFN-γ单克隆抗体和FITC标记的马IFN-γ单克隆抗体,在此基础上成功建立了检测EIFN-γ的相关免疫学方法。首先,从ConA刺激的马外周血单核细胞（PBMC）中采用RT-PCR扩增获得含信号肽的马IFN-γ的编码序列,将其克隆至载体pCR2.1-TOPO中。然后以从重组质粒pCR-EIFN-γ为模版扩增获得编码马IFN-γ成熟蛋白（mature EIFN-γ, mEIFN-γ）的基因,并将其亚克隆至原核表达载体pET-28a（+）。经PCR、酶切及序列测定后所获得的重组子转化至大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）,经IPTG诱导,将其产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组水泡性口炎病毒（VSV*GFP）作为指示病毒对所表达的EIFN-γ进行抗病毒活性测定。结果表明,mEIFN-γ开放阅读框全长为441bp,编码146个氨基酸;其在大肠杆菌表达系统的表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在,重组蛋白相对分子量约为18 ku,且具有免疫反应活性。采用Ni+亲和层析对大肠杆菌表达系统所表达的mEIFN-γ在非变性和变性条件下分别进行纯化,均获得了高纯度的重组马IFN-γ,且该重组蛋白具有抗病毒活性,其活性单位为1×103 AU/mL。将原核表达的重组EIFN-γ免疫BALB/c小鼠（Mus musculus）,经4次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以昆虫杆状病毒表达系统获得的重组马IFN-γ作为检测抗原进行间接ELISA检测筛选,最终获得12株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株。利用间接免疫荧光（IFA）实验对12株单克隆抗体进行鉴定,结果表明,所获得的12株细胞分泌的抗体均为针对EIFN-γ的特异性抗体。单克隆抗体亚型鉴定结果显示,其中4株为IgG1、2株为IgG2a、3株为IgG2b和其余3株为IgM,而且所有12株单克隆抗体的轻链均为κ链。将此12株单克隆抗体分别与两个截短表达的重组马IFN-γ蛋白（GST-mEIFN-γ（1-84）和GST-mEIFN-γ（80-146））进行特异性ELISA检测,结果表明,其中有7株单克隆抗体识别GST-mEIFN-γ（1-84）,而另5株单克隆抗体与GST-mEIFN-γ（80-146）发生反应,说明所获得的12株单克隆抗体至少针对两个或两个以上不同的抗原表位。而且,其中一株单抗（SB10）具有抑制重组EIFN-γ抗病毒活性作用。将两株识别不同表位的抗马IFN-γ单克隆抗体腹水（A5和SB10）纯化后,对其中一株纯化后的单抗（SB10）进行生物素标记,通过对重组EIFN-γ进行ELISA检测来建立马γ-干扰素双抗体夹心ELISA。经过方阵滴定实验确定捕获抗体的最佳浓度为1μg/mL,检测抗体的工作效价为1: 1000。利用建立的方法对不同稀释度的重组马IFN-γ和丝裂原刺激的马外周血单核细胞培养上清进行检测。结果表明,此方法检测敏感度达到1ng/mL,特异性良好。利用荧光素FITC对纯化后的抗马IFN-γ单克隆抗体（SB10）进行标记,制备FITC标记的抗EIFN-γ单克隆抗体,然后采用该抗体对马外周血单核细胞进行胞内EIFN-γ单染色,之后进行流式细胞术检测,并且与商品化的FITC标记的抗牛IFN-γ单克隆抗体（CC302）进行对比试验。结果表明,FITC标记的抗EIFN-γ单抗能够有效地应用于刺激后的马外周血单核细胞的胞内染色检测。分别将识别EIFN-γ不同表位的配对单抗作为捕获抗体和检测抗体,对经刺激的马PBMC所分泌的IFN-γ进行ELISPOT检测,从而建立检测马γ-干扰素ELISPOT方法。经过方阵滴定实验确定捕获抗体的包被浓度为1μg/

关键词：马IFN-γ 单克隆抗体抗原捕获ELISA 细胞内细胞因子染色酶联免疫斑点试验

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不同n-3PUFA对轻中度血脂增高人群血脂及炎症细胞因子影响的随机、双盲对照研究

不同n-3PUFA对轻中度血脂增高人群血脂及炎症细胞因子影响的随机...

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作者：周泉中山大学

学位级别：博士

2005年,心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVD)已成为全球占首位的死亡因为,在全年总共5,800万的死亡人口中,30％死于心血管疾病。在我国,自20世纪90年代起,CVD已成为城乡居民的第一位死因,目前已占总死亡人数的近40％。心血管疾病... 详细信息

2005年,心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVD)已成为全球占首位的死亡因为,在全年总共5,800万的死亡人口中,30％死于心血管疾病。在我国,自20世纪90年代起,CVD已成为城乡居民的第一位死因,目前已占总死亡人数的近40％。心血管疾病的发生、致死与膳食结构、生活方式密切相关。膳食无疑起着举足轻重的作用,许多食物成分直接或间接参与了机体血压、血脂、血糖的调节及动脉粥样硬化形成的病理过程,进而影响CVD的发生发展。 　　 n-3脂肪酸对心血管疾病的保护效应从上世纪80年代Kromhout首次发表鱼对冠心病有预防作用以后就受到广为关注。随后20年里,研究不断证实鱼类食物或鱼油中富含的EPA/DHA对CVD的保护作用。GISSI—Prevenzione试验报道,每天补充850mgEPA/DHA可使心肌梗塞病人总死亡率降低20％,并使心源性猝死的发生率下降45％。He等进行了一项Meta分析,认为摄入鱼类与致死性CHD呈负相关,每周摄入一次以上的鱼可能与CHD死亡率的下降有关。n-3脂肪酸对心血管疾病具有调节血浆脂质及脂蛋白,调节类二十烷酸代谢,抗心律失常,改善血小板功能,抗凝及调节机体免疫细胞功能等多重保护效应。但是,生态环境改变,地域与文化的差异以及个体对食物的偏好都使得摄入鱼类保护心血管健康的举措难以实施。 　　除了来源于鱼类等水产品的EPA和DHA外,食物中的n-3脂肪酸还包括来源于植物种子的α-亚麻酸(ALA)。相对于EPA/DHA而言,膳食中ALA的来源较为丰富,如大豆油,低芥酸菜籽油、亚麻籽油,核桃等。从理论上讲,ALA是人体的必需脂肪酸,其意义在于ALA在体内可以通过碳链在羧基端的延伸和去饱和,衍生为长链的n-3脂肪酸(EPA/DHA),从而产生生物学效应。但关于ALA摄入与CVD的发病及预防的研究结果并不一致,有流行病调查显示,增加ALA的摄入量约1倍,可使冠心病的发生率下降45％。脂肪细胞内ALA的构成从0.36％增加到0.75％,罹患非致死性心肌梗塞的危险性下降约77％。而在挪威进行的一项一年的干预试验,未发现每天摄入5.5gALA对CHD死亡率有改善作用。在2006年一篇综述中,Calder认为与其他膳食干预手段相比,增加ALA摄入量在转化为EPA/DHA及改变心血管危险因素方面并没有优势。显示ALA对CVD的保护效应尚存争议。 　　为了获得更直接的证据,学者们展开了一系列不同来源n-3脂肪酸对CVD危险因素的影响的比较研究,Wang等认为ALA在减少心脏猝死和中风方面,并不具备和EPA/DHA相一致的健康效应。大型流行病调查显示膳食中EPA/DHA的摄入量与sICAM-1及sVCAM-1呈负相关,而ALA摄入量与CRP,IL-6及E-selectin呈负相关。Yvonne等给150名健康成人分别补充0.7/1.7gEPA/DHA及4.5/9.5gALA,6个月后,1.7gEPA/DHA组干预后TG水平显著下降与9.5gALA组比较差异有显著性,9.5gALA组TG呈上升趋势；。另一项研究则报道与每天补充3.5gALA相比,每天补充EPA/DHA0.44到0.94g之间就能使PBMCs培养上清中释放的IL-6下降。 　　分析上述研究结果不一致的因为可能有多种,如n-3摄入量、摄入方式、研究对象选择标准等,以及膳食背景和遗传背景都可能影响n-3的健康效应。George等报道,分别给习惯摄入地中海膳食或西方膳食的血脂异常人群进行为期12周,8.1gALA/d,的干预,结果显示,补充ALA降低血清炎症因子的效应对后者(饮食中富含饱和脂肪酸且单不饱和脂肪酸较少的人群)更为显著,显示,膳食背景对n-3的健康效应产生显著的影响。此外,一些关于n-3脂肪酸与基因多态性交互作用的报道,也显示炎症相关遗传因素对膳食脂肪酸的健康效应有一定程度的影响。ALA是我国传统膳食中n-3PUFA的主要来源,确定ALA对心血管疾病的保护效应,通过膳食脂肪及脂肪酸的调整来预防心血管疾病具有特殊意义。在我国居民传统膳食及特殊遗传背景下,研究和比较AALA和EPA/DHA对血脂及炎症细胞因子影响健康效应的差异,对确定ALA作为必需脂肪酸的营养学意义,合理利用食物资源,以及为膳食脂肪酸DRI修订有重要的实际意义。 　　综上所述,本研究首先以纳入筛选的基础人群为对象,就其膳食n-3脂肪酸摄入、红细胞膜n-3脂肪酸构成与基因的交互作用开展横断面研究。探讨炎症因子IL-6启动子区域基因多态性与n-3脂肪酸对血脂影响的交互作用。进一步在横断面人群中,招募血脂轻中度增高的志愿者,开展一项以不同来源,不同剂量n-3脂肪酸为

关键词： α-亚麻酸血脂异常白细胞介素6 肿瘤坏死因子-α 细胞内细胞因子染色心血管疾病

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补肾冲剂治疗慢性乙型肝炎免疫及内分泌机理研究

补肾冲剂治疗慢性乙型肝炎免疫及内分泌机理研究

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作者：何勇上海中医药大学

学位级别：博士

目的:曙光医院肝科从70年代起,在国内率先应用温肾法为主治疗慢性乙型肝炎,并取得较好疗效.本课题在难补肾冲剂治疗慢性乙型肝炎疗效的基础上,分析外周血单个核细胞(PBMC)分泌的细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10,探讨慢性乙型肝炎患... 详细信息

目的:曙光医院肝科从70年代起,在国内率先应用温肾法为主治疗慢性乙型肝炎,并取得较好疗效.本课题在难补肾冲剂治疗慢性乙型肝炎疗效的基础上,分析外周血单个核细胞(PBMC)分泌的细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10,探讨慢性乙型肝炎患者细胞因子谱格局的变化,以此来分析机体Th1/Th2细胞的平衡状态及补肾冲剂的影响;依据补肾法对内分泌系统的显著调节作用,该课题又检测了患者机体内分泌激素水平的变化,通过雄性激素睾酮(T)和雌性激素雌二醇(E2)与细胞因子相磁性分析,推测补肾冲剂治疗慢性乙型肝炎的作用机理是对内分泌轴失衡的显著调节作用,进而影响Th1/Th2细胞病理状态下的平衡,使以Th2细胞介导为主的免疫反应状态向以Th1细胞介导为主的免疫状态.提高细胞免疫,抑制HBV复制,改善肝功能,达到治疗慢性乙型肝炎的目的.结论:补肾冲剂治疗性乙型病毒性肝炎在改善症状、调控免疫、抑制病毒复制和改善肝功能方面具有重要的临床价值;其作用机理是补肾冲剂通过调节内分泌轴失稀状态,进而影响Th1/Th2的病理平衡,提高IL-12水平,刺激Th1细胞因子含量升高,促进慢性乙型肝炎患者Th2细胞向Th1转化.有利于病毒的清除,达到治疗慢性乙型肝炎的目的.

关键词：慢性乙型肝炎补肾冲剂 T辅助细胞亚群内分泌激素抗HBc-lgG亚群细胞内细胞因子染色

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HIV-1感染者CD8+T细胞中Toll样受体的表达及免疫功能研究

HIV-1感染者CD8+T细胞中Toll样受体的表达及免疫功能研究

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作者：宋扬第四军医大学

学位级别：博士

【背景】获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS），简称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起的致命性慢性传染病。研究显示CD8+T细胞在控制HIV-1感染中起重要作用。它... 详细信息

【背景】获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS），简称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起的致命性慢性传染病。研究显示CD8+T细胞在控制HIV-1感染中起重要作用。它所介导的CTLs反应是机体针对HIV-1感染最有力的效应武器，但其具体机制尚未完全阐明。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）作为联系固有免疫与适应性免疫系统的桥梁，可特异性的识别病原微生物，偶联信号转导途径，从而诱导特异性基因的表达和细胞因子/趋化因子的分泌，在机体抗感染免疫中发挥重要作用。已有研究提示TLRs与HIV-1感染密切相关。但HIV-1感染者CD8+T细胞与TLRs之间的关系尚未见报道。因此，本课题主要采用实时定量PCR（real-time PCR）法、流式细胞术及细胞内因子染色（intracellular cytokines staining,ICS）等技术分析了31例HIV-1感染者和20例正常人CD8+T细胞中TLR4、TLR5和TLR7的表达，以筛选出表达异常的TLR，并探讨其功能，从而为揭示HIV-1感染过程中TLR的作用、确定抗病毒药物的研制靶点及提供新的疫苗候选分子打下坚实的实验基础。【目的】 1.筛选HIV-1感染者CD8+T细胞中表达异常的TLR；2.研究TLR表达与CD4+T细胞计数、HIV-1病毒载量及HAART治疗的关系，探讨其在HIV-1感染过程中的意义；3.研究TLR配体对CD8+T细胞的激活作用及CD8+T细胞分泌细胞因子的情况，以了解HIV-1感染过程中TLR的功能及辅助因子在其中的作用。【方法】 1.使用富集CD8+T细胞抗体混合物从人外周血中分离CD8+T细胞，采用实时定量PCR法筛选HIV-1感染者CD8+T细胞中表达异常的TLRmRNA，TLRmRNA的相对表达量通过2-Ct法计算，随后采用流式细胞术在蛋白水平验证TLR的表达差异；2.采用流式细胞术和实时荧光定量PCR法检测HIV-1感染者CD4+T细胞计数及病毒载量，通过统计学方法分析表达异常的TLR与CD4+T细胞计数、病毒载量及HAART治疗的关系；3.采用密度梯度分离法从人外周血中分离PBMC，随后通过流式细胞术检测不同浓度的TLR7配体（0.5、1和5μg/ml）刺激6h后，纯化CD8+T细胞和PBMC中CD8+T细胞表面CD69的表达；4.应用细胞内细胞因子染色技术检测不同浓度的TLR7配体（0.5、1和5μg/ml）刺激6h及20h后，纯化CD8+T细胞和PBMC中CD8+T细胞分泌IL-2和IFN-γ的情况。【结果】 1.实时定量PCR法检测HIV-1感染者和正常人CD8+T细胞中TLR4、TLR5和TLR7的表达，结果显示，HIV-1感染者CD8+T细胞中均有TLR4、TLR5和TLR7mRNA的表达，其中HIV-1感染者CD8+T细胞中TLR7mRNA的表达显著升高（P<0.05），而TLR4、TLR5mRNA的表达未见明显变化（P>0.05）。为进一步证实TLR7的表达差异，采用流式细胞术检测了HIV-1感染者和正常人CD8+T淋巴细胞中TLR7蛋白的表达，结果显示HIV-1感染者CD8+T细胞中TLR7蛋白的表达亦显著升高（P<0.05）。但HIV-1感染者CD8+T细胞上TLR7的表达与CD4+T细胞计数、病毒载量均无明显相关性（P>0.05）。根据CD4+T细胞计数（>200cells/μl和<200cells/μl）、病毒载量（>105copies/ml和<105copies/ml）及有无接受HAART治疗对HIV-1感染者进行分组，TLR7的表达亦无显著差异（P>0.05）； 2.不同浓度（0.5、1和5μg/ml）的TLR7配体CL097刺激纯化CD8+T细胞和PBMC 6h后，用流式细胞术检测CD8+T细胞表面CD69的表达水平，结果显示HIV-1感染者和正常人纯化CD8+T细胞表面CD69的表达均增高（P<0.05），并且HIV-1感染者CD8+T细胞表面CD69的表达显著高于其在正常人中的表达（P<0.05）。此外，HIV-1感染者PBMC中CD8+T细胞表面CD69的表达也显著增高（P<0.05），但与纯化的CD8+T细胞表面CD69的表达无显著差异（P>0.05）。并且CD69在CD8+T细胞表面的表达呈浓度依赖性，CL097在浓度为0.5μg/ml时，CD8+T细胞表面CD69的表达最高； 3.不同浓度（0.5、1和5μg/ml）的TLR7配体刺激纯化CD8+T细胞6h后

关键词： I型人类免疫缺陷病毒获得性免疫缺陷综合征 CD8+T细胞 Toll样受体-7 细胞内细胞因子染色

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保存条件对恒河猴CD8^(+)T细胞活性的影响

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中国比较医学杂志 2021年第4期31卷 33-37页

作者：罗嘉慧卢秋翰李国萃张京京丛喆魏强北京协和医学院比较医学中心中国医学科学院医学实验动物研究所国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室新发再发传染病动物模型研究北京市重点实验室北京100021

目的通过细胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining,ICS)检测CD8^(+)T细胞反应强度,探究不同保存条件对CD8+T细胞活性影响。方法采集9只恒河猴外周血,分离外周血单个核细胞(PBMC),一部分新鲜细胞直接用于检测,剩余细胞冻存至... 详细信息

目的通过细胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining,ICS)检测CD8^(+)T细胞反应强度,探究不同保存条件对CD8+T细胞活性影响。方法采集9只恒河猴外周血,分离外周血单个核细胞(PBMC),一部分新鲜细胞直接用于检测,剩余细胞冻存至-80℃和液氮,冻存1周和1年再用于检测,检测时用阳性刺激物进行刺激,流式分析活细胞比例,MIP-1β、TNF-α、IL-2、IFN-γ四种细胞因子分泌情况和细胞脱粒标志物CD107a的表达情况。结果随着冻存时间的增加,细胞存活率降低,且液氮冻存比-80℃冻存有更高的存活率。在细胞因子分泌和细胞脱粒标志物CD107a的表达情况中,冻存一年的细胞MIP-1β、TNF-α分泌量显著高于正常细胞,细胞状态发生了改变,冻存一周的细胞与新鲜细胞状态更为相近。结论想要保持低的细胞死亡率和正常的CD8+T细胞反应,应使用新鲜细胞或短期冻存的细胞进行测量CD8^(+)T细胞反应水平的实验。

关键词：细胞内细胞因子染色 CD8^(+)T细胞细胞活性恒河猴

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健康HLA-A2～+供者HCMV特异性CTL的频率及其表型和功能分析

健康HLA-A2～+供者HCMV特异性CTL的频率及其表型和功能分析

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作者：查庆兵暨南大学

学位级别：硕士

目的：利用负载人巨细胞病毒（HCMV）结构蛋白pp65衍生抗原肽NLV(pp65495-503)的HLA-A*0201（A2-NLV）四聚体，探讨四聚体染色条件的优化，比较健康的中国青年人、老年人HCMV特异性CTL频率和表型，并分析HCMV抗原肽NLV特异性CTL细... 详细信息

目的：利用负载人巨细胞病毒（HCMV）结构蛋白pp65衍生抗原肽NLV(pp65495-503)的HLA-A*0201（A2-NLV）四聚体，探讨四聚体染色条件的优化，比较健康的中国青年人、老年人HCMV特异性CTL频率和表型，并分析HCMV抗原肽NLV特异性CTL细胞的功能特性和TCR Vβ的取用。方法： 1．以HLA-A2+供者外周血为实验材料，在不同条件下进行A2-NLV四聚体／PE染色，然后以anti-CD3-FITC和anti-CD8-APC标记，流式细胞术分析染色结果，寻找四聚体最佳染色条件。 2．取中国健康老年人和年轻人HLA-A2+供者外周血，以A2-NLV四聚体／PE和anti-CD8-APC、anti-CD28-FITC或anti-CD57-FITC（表型抗体）标记，流式细胞术分析染色结果。 3．将HLA-A2／NLV四聚体染色与细胞内细胞因子或穿孔素染色相结合，以流式细胞仪直接分析NLV特异性CTL细胞内穿孔素的表达水平，或者在NLV抗原肽刺激6h后分析γ-干扰素（IFN-γ）的表达水平。

关键词： HLA-A2四聚体细胞毒T淋巴细胞人巨细胞病毒细胞内细胞因子染色流式细胞术 TCR取用

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