检索结果-内蒙古大学图书馆

Chinese Journal of Catalysis 2025年第2期 35-51页

作者：姜谊平 Zaw Ko Latt 丛志奇中国科学院青岛生物能源与过程研究所光电转换与太阳能光电转化与利用重点实验室青岛新能源山东省实验室中国科学院生物燃料重点实验室山东省合成生物学重点实验室山东能源研究院缅甸教育部生物技术研究部

过加氧酶是一类重要的氧化酶,它们利用血红素作为辅基参与多种氧化反应.与依赖辅酶和复杂电子传递系统的单加氧酶和双加氧酶相比,过加氧酶能够直接在过氧化氢的驱动下催化底物氧化,该过程更加简洁高效,为有机合成、药物化学和合成生物... 详细信息

过加氧酶是一类重要的氧化酶,它们利用血红素作为辅基参与多种氧化反应.与依赖辅酶和复杂电子传递系统的单加氧酶和双加氧酶相比,过加氧酶能够直接在过氧化氢的驱动下催化底物氧化,该过程更加简洁高效,为有机合成、药物化学和合成生物学等领域提供了有力的工具.然而,天然血红素过加氧酶的种类有限,催化底物谱范围较窄,且活性有待进一步提升,这限制了其在工业中的应用.因此,通过酶工程手段对血红素过加氧酶进行改造,提升其催化性能,成为当前研究的重要方向.本文系统总结了近年来在血红素依赖性过加氧酶工程化改造领域,特别是针对非特异性过加氧酶（UpO）、脂肪酸过加氧酶以及人工改造的p450过加氧酶研究的最新进展.天然UpO具备相对广泛的催化底物谱,因此改造方向主要集中在反应活性、选择性及酶稳定性的提升.概述了通过晶体结构指导的定点突变和定向进化等技术,得到的多种改性后的UpO突变体,实现了稳定性、活性、选择性和底物谱等催化性能显著提升.具体评析了改性UpO高效选择性催化生成多种包括维生素、药物代谢产物等高附加值非天然产物,同时,还介绍了UpO对有机过氧化物外消旋体中特定对映体选择性的富集效果.此外,针对天然p450脂肪酸过加氧酶,特别是CYp152家族的成员,如p450Spα, p450BSβ和p450OleT,尽管野生型已有一定的过加氧反应能力,但通过工程化手段可进一步拓宽其底物范围、增强催化效率并改善选择性.文中概述了近期通过蛋白质工程手段改性的p450脂肪酸过加氧酶研究进展,其中包括高效手性γ-内酯合成酶、苯乙烯环氧化酶等系列过加氧酶,展示了工程化改性后的天然p450过加氧酶在精细化学品合成中的巨大潜力.另外,在p450单加氧酶向过加氧酶的人工转化方面,研究人员通过定向进化、理性设计、双功能小分子（DFSM）辅助系统及H2O2通道工程等多种策略,成功开发出高效的人工p450过加氧酶.这些人工酶不仅保持了p450单加氧酶的高选择性和多样性,还简化了催化循环,提升了p450酶催化机制中过氧化氢旁路的利用效率,避免了对昂贵辅酶及复杂电子传递系统的依赖,以上具体改造策略亦在文中回顾总结.综上所述,本文系统总结了当前过加氧酶改性研究的最新进展,详述了通过蛋白质工程手段提升过加氧酶催化性能的成功案例,并探讨了这些酶在有机合成、药物制造等领域的广泛应用前景.未来,通过引入人工智能等新型工程化策略、进一步扩大底物范围并实现更多高附加值产物的催化,将是该领域研究的重要方向.因此,随着研究的不断深入和技术的不断进步,血红素依赖性过加氧酶有望在生物合成领域发挥重要作用,推动合成方向的绿色可持续发展.

关键词：过加氧酶过氧化氢细胞色素p450过加氧酶非特异性过加氧酶蛋白质工程

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

细胞色素p450BM3的氧化酶与还原酶蛋白之间的相互作用对其催化活性的影响

细胞色素P450BM3的氧化酶与还原酶蛋白之间的相互作用对其催化活...

引用

作者：赵盼霞中国科学院大学

学位级别：硕士

细胞色素p450酶几乎遍及从细菌到人类的整个进化过程，是用途最广泛的生物催化剂之一，能够催化多种类型氧化反应。大多数p450催化功能的实现依赖于一个由p450的血红素结构域（血红素活性中心）和氧化还原伴侣蛋白(Redox partner prote... 详细信息

细胞色素p450酶几乎遍及从细菌到人类的整个进化过程，是用途最广泛的生物催化剂之一，能够催化多种类型氧化反应。大多数p450催化功能的实现依赖于一个由p450的血红素结构域（血红素活性中心）和氧化还原伴侣蛋白(Redox partner protein)组成的，复杂的氧化还原分子机器。p450酶与还原伴侣之间的蛋白-蛋白相互作用如何影响其催化活性和/或产物分布，是一个长期存在的问题，已引起了越来越多的讨论。显然这种相互作用同时影响着p450酶的电子传递效率和构象的变化。前者可以通过测量第一电子传递速率或氧化还原电位变化来评价，而后者主要通过分子动力学模拟或光谱分析等定性的角度来研究。如何定量评价由这种蛋白-蛋白相互作用导致的p450构象变化对催化活性或者分布的影响仍是一个有待解决的问题。　　本研究中，我们利用高活性的p450BM3过加氧酶体系研究这种蛋白．蛋白间相互作用对催化活性与产物分布的影响。为探讨p450BM3的氧化酶与其还原酶结构域之间蛋白-蛋白相互作用对p450BM3催化活性和产物分布的影响，我们首先以双功能小分子存在下H2O2驱动的苯乙烯环氧化作为模型反应，研究p450BM3氧化酶的87位单点突变体与相应的p450BM3全酶（融合有p450还原酶结构域）的87位突变体的催化活性与产物分布。其次选取一些特定位点，比如氧化酶与还原酶结构域的连接区以及还原酶结构域，制备突变体文库，研究其催化活性与产物分布。鉴于单个位点突变即会对蛋白的构象产生一定的影响，这些突变也必然会对氧化酶与还原酶结构域的蛋白-蛋白相互作用产生影响，进而引起氧化酶的构象变化，从而导致对催化活性或产物分布的影响。最后同样的以双功能小分子促进的p450过加氧酶反应为工具，通过比较p450BM3氧化酶与其融合了还原酶结构域的全酶催化亚磺化、羟基化等不同类型反应，发现血红素结构域与还原酶间蛋白-蛋白相互作用对反应催化活性具有一定的影响，还原酶结构域上以及相邻结构域连接区上的单位点突变也会通过构像变化的传递对催化活性产生一定影响。进一步证明p450BM3的氧化酶与其还原酶结构域之间蛋白-蛋白相互作用对p450BM3催化活性和产物分布的影响。本研究为理解p450酶氧化酶与还原酶蛋白-蛋白相互作用对催化反应的影响提供了新的机理视角，主要的研究结果如下:　　1、首先对p450BM3选定的F87位点进行系列突变，已经得到F87A、F87G、F87I、F87V等四个单点突变体蛋白;在单突变的基础上，对p450BM3氧化酶结构域上的268位进行突变得到了F87A-T268I、F87A-T268V、F87V-T268V、F87G-T268V、F87G-T268I五个双突变体蛋白;在单突变的基础上对p450BM3氧化酶与还原酶结构域的连接区域以及其还原酶结构域上的471-473、570、574、654、689、852、1037进行突变，得到了F87G-R471A-K472A-K473A、F87G-G570D、F87G-W574D/G、F87G-p654K、F87G-D689G、F87G-E852p和F87G-E1037G;F87A-R471A-K472A-K473A、F87A-G570D、F87A-W574D/G、F87A-p654K、F87A-D689G、F87A-E852p和F87A-E1037G这16个突变体蛋白。　　2、在p450-Im-C6-phe-H2O2体系下，通过比较F87A/G/I/V-BM3和F87A/G/I/V-BMp突变体酶催化苯乙烯氧化反应活性的TON，如F87G-BM3氧化苯乙烯的TON比F87G-BMp高25％，但F87A-BM3氧化苯乙烯的TON比F87A-BMp的低57％。p450BM3的氧化酶的结构发生变化，导致p450BM3突变体酶的氧化酶与还原酶蛋白之间结合的构象发生改变，p450BM3突变体酶的氧化酶与还原酶蛋白之间的相互作用对其催化活性有影响。　　3、在p450-Im-C6-phe-H2O2体系下，p450BM3的氧化酶与还原酶结构域的连接区域以及其还原酶结构域的结构发生变化时。比较p450BM3突变体与F87A、F87G苯乙烯环氧化的TON，p450BM3突变体氧化苯乙烯的TON都比其母本F87A和F87G氧化苯乙烯的TON高10％-90％。p450BM3的氧化酶与还原酶结构域的连接区域以及其还原酶结构域的结构发生变化时，导致p450BM3突变体酶的氧化酶与还原酶蛋白之间结合的构象发生改变，p450BM3突变体酶的氧化酶与还原酶蛋白之间的相互作用对其催化活性有影响。　　4、最后将催化的非天然底物扩展到苯甲硫醚的亚磺化、乙苯和丙烷的羟基化反应，在p450-H2O2体系下，双功能小分子(Im-C6-phe)是否存在两种情况下，通过比较

关键词：细胞色素p450过加氧酶氧化酶结构域还原酶结构域蛋白-蛋白相互作用催化活性

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

双功能小分子激活p450BM3过加氧酶活性

双功能小分子激活P450BM3过加氧酶活性

引用

作者：马娜娜中国科学院大学

学位级别：硕士

细胞色素p450酶能在温和条件下高选择性地催化羟化、环氧化、杂原子氧化等多种类型的反应，在生物化工和有机合成领域有着巨大的应用潜力。但是p450的实际应用受到自身条件的限制，其利用O2作为氧源的催化过程高度依赖提供电子的还原辅... 详细信息

细胞色素p450酶能在温和条件下高选择性地催化羟化、环氧化、杂原子氧化等多种类型的反应，在生物化工和有机合成领域有着巨大的应用潜力。但是p450的实际应用受到自身条件的限制，其利用O2作为氧源的催化过程高度依赖提供电子的还原辅酶NAD(p)H，以及负责电子传递的还原伴侣蛋白;还原辅酶价格昂贵且其原位再生技术不成熟。利用过氧化氢(H2O2)作为氧源可以大大缩短催化循环路径，不需要NAD(p)H和复杂的电子传递链。然而，仪有极少数的p450酶可以利用H2O2的催化路径，如p450spα与p450BSβ。但是这些H2O2依赖的p450s专门催化长烷基链脂肪酸的羟基化，具有很高的底物特异性，因此构建H2O2驱动的一般p450过加氧酶，将为p450酶的催化应用提供新的途径。目前已有很多策略来尝试发展人工p450-H2O2系统，如定向进化、理性设计，但结果不尽人意。凶而发展新的策略构建稳定高效的p450-H2O2催化系统具有十分重要的意义。　　本研究创新性地提出了双功能小分子(Dual Functional Small Molecules，DFSMs)（如N-（ω-咪唑基，脂肪酰基）-L-氨基酸衍生物）激活p450BM3过加氧酶活性的策略。双功能小分子一端的酰基氨基酸衍生基团作为锚定基团与p450BM3的底物口袋结合，另一端的咪唑基团作为“酸-碱”催化剂来活化H2O2生成Compound I活性物质，进而氧化底物。主要的研究结果如下。　　1.首先成功构建了pET-28a(+)-BMp重组质粒（BMp为p450BM3的血红素结构域），并以此为模板对87位苯丙氨酸进行定点突变，获得了pET-28a(+)-F87A/L/G/I/V重组质粒，通过诱导表达纯化获得了BMp、F87A、F87L、F87G、F87I、F87V的纯蛋白。　　2.以F87A催化苯乙烯的环氧化为模式反应筛选了一系列双功能小分子结果显示:在Im-C6-phe的存在下，F87A催化苯乙烯环氧化反应的TON可达1377，相比于不添加Im-C6-phe的对照体系的催化反应TON(56)提高了20多倍，产物牛成速率（1min反应）也由14μmol·min-1·(μmol p450)-1提高至796μmol·min-1·(μmol p450)-1。此结果充分显示了双功能小分子对p450BM3利用H2O2催化苯乙烯环氧化的重要作用。另外通过控制实验发现双功能小分子的“锚定基团”和“酸碱催化基团”均必不可少。　　3.在对Im-C6-phe存在下F87A催化苯乙烯环氧化的反应条件优化后，将此策略扩展到BMp及其他突变体中，研究发现:在Im-C6-phe存在下，反应活性均提高2～3倍甚至更多，其中F87G与F87A活性提高至20多倍。此结果不仅证明了上述策略的适配性，而且提示在设计双功能小分子驱动p450-H2O2催化系统时需重视活性中心周围底物口袋结构的影响。并探讨了p450BM3在H2O2中的稳定性，结果发现Im-C6-phe促进H2O2活化形成活性物质，其中大部分用于最终的环氧化反应，但相当一部分仍然通过酶的降解而消耗。通过低温长时间反应，F87A催化苯乙烯环氧化的最终TON可达2733。　　4.在完成以上工作后，又对双功能小分子驱动p450BM3-H2O2催化苯乙烯环氧化的立体选择性进行了研究。结果显示，在无Im-C6-phe存在下，BMp，F87L，F87I，F87V催化生成的氧化苯乙烯倾向于S构型（ee值在1％～67％之间），F87A和F87G催化生成的氧化苯乙烯倾向于R构型，ee值分别为7％和52％，在加入Im-C6-phe后，除BMp和F87L外，其他突变体催化生成的氧化苯乙烯都显著偏向R构型，其中F87A在Im-C6-phe存在下显示了最好的立体选择性，其ee值可达84％(R)。除此之外，研究发现通过改变锚定基团中不同的酰基氨基酸衍生基团也会对立体选择性产生不同的效果差异。　　5.最后将此策略的应用扩展到苯甲硫醚的亚磺化反应中，研究发现在Im-C6-phe存在下，F87A催化苯甲硫醚亚磺化生成单一产物甲基苯基亚砜，其产物生成速率（1min反应）高达888μmol·min-1·(μmol p450)-1;反应30min其TON可达3436，比无Im-C6-phe存在下提高了35倍之多;甲基苯基亚砜立体选择性倾向于S构型，ee值为32％;另外其低温长时间反应的最终TON可达4910。以上结果证明了双功能小分子促进的p450BM3-H2O2催化体系也可用于苯甲硫醚的亚磺化反应。

关键词：细胞色素p450过加氧酶双功能小分子催化活性立体选择性

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：