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长毛明对虾核转录因子NF-κB家族基因的克隆及在细菌侵染过程中的表达变化

中国水产科学 2022年第11期29卷 1551-1563页

作者：梁芳梅朱鹏邱春桃王艳梅刘丽丽蔡双虎王鹏良张虹陈俭清许尤厚北部湾大学广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室广西钦州535011 广东海洋大学水产学院广东湛江524088

核转录因子NF-κB家族在无脊椎动物抵抗病原刺激中起着重要作用。本研究通过RACE技术克隆了长毛明对虾(Fenneropenaeus penicillatus)NF-κB家族基因,分别命名为FpRelish和FpDorsal。FpRelishcDNA全长为5373 bp,其中5’UTR 88 bp,3’UTR 1667 bp,编码区3618 bp,编码1205个氨基酸;FpDorsal cDNA全长为4816 bp,其中5’UTR 611 bp,3’UTR 2147 bp,编码区2058 bp,编码685个氨基酸,两者均具有RHD结构域。同源性和系统进化分析表明,FpRelish和FpDorsal都分别与甲壳动物首先聚为一支。qPCR分析表明,两基因在检测的血液、心脏、肝胰脏、鳃、肠道、性腺、肌肉、神经和胃组织中均有表达,且均在肝胰脏中最低,在血细胞中最高,相差8~10.7倍。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)刺激后,FpRelish和FpDorsal基因在鳃和肝胰脏中均有先上升再下降的表达变化模式,鳃中FpRelish基因6 h表达最高,为对照组2.7倍,FpDorsal基因9 h表达最高,为对照组2.1倍;肝胰脏中FpRelish基因在9 h高表达,最高表达量在48 h,为对照组的4.5倍,FpDorsal基因9 h表达最高,为对照组22倍。溶藻弧菌(Vibrio aliginolyticus)刺激后,鳃中FpRelish基因24 h表达最高,为对照组1.9倍,FpDorsal基因24 h表达最高,为对照组1.5倍;肝胰脏中FpRelish基因3 h达最高表达量,FpDorsal基因6 h表达最高,均为对照组的1.5倍。本研究表明FpRelish和FpDorsal在长毛明对虾免疫调控中发挥了重要作用。

关键词：长毛明对虾 NF-κB家族基因细菌侵染克隆与表达

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细菌侵染对大头金蝇抗菌肽与热激蛋白基因的诱导作用研究

细菌侵染对大头金蝇抗菌肽与热激蛋白基因的诱导作用研究

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作者：余俊锋中山大学

学位级别：硕士

大头金蝇Chrysomya megacephala (Fabricius)生存环境恶劣，传播各种疾病而自身却不得病，说明其免疫系统对病菌有强大的防御能力。昆虫受到病原物侵入时，抗菌肽作为体液免疫的先锋防御因子由脂肪体细胞迅速合成并释放进入血淋巴;而热... 详细信息

大头金蝇Chrysomya megacephala (Fabricius)生存环境恶劣，传播各种疾病而自身却不得病，说明其免疫系统对病菌有强大的防御能力。昆虫受到病原物侵入时，抗菌肽作为体液免疫的先锋防御因子由脂肪体细胞迅速合成并释放进入血淋巴;而热激蛋白除了以分子伴侣形式起恢复被破坏的蛋白质结构与活性而维持内环境的稳定外，还参与抗原递呈，免疫调控等功能。但是关于这两类蛋白是否同时对病原物作出响应的关系尚未有文献报道。本文主要从大头金蝇3龄幼虫注射不同浓度大肠杆菌Escherichia coli、金黄葡萄球菌Staphyloccocus aureu和PBS缓冲液，经过不同时间后抗菌肽和热激蛋白的表达量变化作为切入点，对这两种蛋白在大头金蝇免疫防御系统中的诱导作用进行初步研究。本文克隆了大头金蝇Cecropin A和Hsp70基因的cDNA全长，命名为CM-CecA和CM-Hsp70。 CM-CecA基因cDNA全长为421bp，5’-UTR为87bp，3’-UTR为142bp，开放读码框(ORF)为189bp，编码63个氨基酸。ORF的相对分子量为6.7KD：信号肽序列为第1至23个氨基酸;1个亲水区;2个疏水区;2个α螺旋。CM-CecA在大头金蝇世代发育的6个阶段中都有表达，成虫期的表达量最高，在其他阶段的表达量相对比较稳定。CM-Hsp70基因cDNA全长为2281bp，5’-UTR为186bp，3’-UTR为136bp，开放读码框(ORF)为1956bp，编码652个氨基酸，分子质量为70KD。CM-Hsp70蛋白由三个主要结构域组成，即N端高度保守的ATP酶区，相对分子质量约44KD，下游约18KD保守的多肽结合区和C端约10KD的可变区。C端最末端特有的特异性基序EEVD，表明此蛋白质是定位于细胞质内。CM-Hsp70在卵的表达量最高，在其他阶段的表达较为稳定。不同种类的病原物在不同浓度和诱导时间，对CM-CecA基因的诱导表达作用有所不同。对大肠杆菌和金黄葡萄球菌的响应时间峰值都是在第12个小时，分别是40倍和41倍。在注射的大肠杆菌OD600值为0.3和2.0时，反应的强度较高;金黄葡萄球菌OD600值为0.5和1.0时，响应强度最高。而幼虫在经过不同的大肠杆菌和金黄葡萄球菌处理后4个小时，Hsp70的表达量并无显著上升，表明可能大肠杆菌、金黄葡萄球菌等刺激因子可能都对幼虫CM-CecA基因有诱导作用，对CM-Hsp70蛋白没有诱导作用。幼虫面对恶劣的环境时，免疫系统可能以进攻为主。当受到病原物侵染时，CM-CecA抗菌肽表达量剧增，加强幼虫的防御能力。由于热激蛋白的种类较多，而本文仅对其中一种进行了研究，难以真实反映病原物侵染对热激蛋白表达的诱导作用，尚待进一步研究。

关键词：大头金蝇抗菌肽CecropinA 热激蛋白Hsp70 细菌侵染诱导作用

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烟草甲攻击素基因LsAttacin2的表达及其在抗细菌胁迫中的作用

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昆虫学报 2023年第4期66卷 501-509页

作者：夏鹏亮严毅宋兴宜黄勇杨文佳湖北省烟草公司恩施州公司恩施445000 贵阳学院生物与环境工程学院贵州省山地珍稀动物与经济昆虫重点实验室贵阳550005

【目的】本研究旨在阐明烟草甲Lasioderma serricorne幼虫体内攻击素(attacin)基因LsAttacin2在响应细菌侵染过程中的功能。【方法】利用RT-PCR扩增烟草甲LsAttacin2的cDNA全长序列;利用RT-qPCR检测LsAttacin2在烟草甲不同发育阶段(卵... 详细信息

【目的】本研究旨在阐明烟草甲Lasioderma serricorne幼虫体内攻击素(attacin)基因LsAttacin2在响应细菌侵染过程中的功能。【方法】利用RT-PCR扩增烟草甲LsAttacin2的cDNA全长序列;利用RT-qPCR检测LsAttacin2在烟草甲不同发育阶段(卵、低龄幼虫、高龄幼虫、蛹、低龄成虫和高龄成虫)、4龄幼虫不同组织(头、表皮、前肠、中肠、后肠、脂肪体和马氏管)、大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus侵染及其肽聚糖处理4龄幼虫后的相对表达量;通过注射法利用RNAi沉默烟草甲4龄幼虫LsAttacin2的表达后,检测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌侵染烟草甲4龄幼虫后的死亡率。【结果】克隆获得烟草甲LsAttacin2(GenBank登录号:MT635176)的cDNA全长序列,其开放阅读框长504 bp,编码167个氨基酸残基,LsAttacin2 N端存在信号肽,C端具有Attacin_C超家族的保守结构域。RT-qPCR结果表明,LsAttacin2在烟草甲测试的各发育阶段均有表达,且在高龄幼虫和蛹中高表达;LsAttacin2主要在4龄幼虫中肠、表皮和脂肪体等免疫组织中表达;大肠杆菌和金黄色葡萄球菌及其肽聚糖均诱导了烟草甲4龄幼虫体内LsAttacin2的上调表达。RNAi结合细菌生物测定结果表明,ds LsAttacin2注射组4龄幼虫中LsAttacin2的表达量在注射24和48 h时较对照组(注射ds GFP)分别显著下降了72.8%和80.4%;RNAi后48 h,与注射ds GFP的对照组相比,ds LsAttacin2注射组大肠杆菌和金黄色葡萄球菌侵染24 h时4龄幼虫的死亡率分别提高了21.1%和24.4%。【结论】本研究结果表明LsAttacin2可能在烟草甲抗细菌的免疫应答过程中起着重要作用。

关键词：烟草甲攻击素基因表达细菌侵染免疫 RNA干扰

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新疆细菌性棉花烂铃病发病机理及传播途径的研究

新疆细菌性棉花烂铃病发病机理及传播途径的研究

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作者：任毓忠石河子大学

学位级别：博士

本文对新疆棉花上新出现的细菌性烂铃病田间的发生情况及对棉花产量和棉纤维品质的影响进行了调查、明确了引起病害的主要原因、病原菌的主要侵入方式及遗传分化，查明了病害在田间的主要传播途径，为有效控制病害，制定合理的病害防治... 详细信息

本文对新疆棉花上新出现的细菌性烂铃病田间的发生情况及对棉花产量和棉纤维品质的影响进行了调查、明确了引起病害的主要原因、病原菌的主要侵入方式及遗传分化，查明了病害在田间的主要传播途径，为有效控制病害，制定合理的病害防治措施提供理论依据。棉花细菌性烂铃病在田间的症状表现为未成熟的棉铃表面沿纵沟线出现褐色坏死条带，剖开棉铃，内部未成熟的部分或全部棉纤维变褐，并呈水渍状，严重时整个棉铃变褐，棉壳变软，棉纤维和种子呈褐色，棉铃提早开裂，无法正常成熟。从田间采集的棉铃病样中分离、纯化得到53个细菌分离物，供试菌株针刺和注射接种棉铃进行致病性测定，都能引起棉铃腐烂症状的发生，通过病原菌形态特征、培养特性、生理生化反应的观察和测定，同时结合细菌16srDNA序列的测定，将引起新疆棉花细菌性烂铃病的病原确定为成团泛生菌。本研究主要内容包括：　　⑴通过大田调查和小区实验，查明了细菌性烂铃病在新疆棉田的发生和危害情况以及病害对棉花产量和纤维品质的影响;结果显示，棉花细菌性烂铃病在新疆棉田中普遍发生，平均发病率为20.6％，减产10%-20%;棉花不同品种间发病情况有明显的差别。病害对棉花产量形成因子的影响主要体现在单铃重的减轻27.6%、衣分平均降低5.3%和瘪籽率平均增加1.6倍;对棉花纤维品质的影响体现在纤维比强度和伸长率的下降、马克隆值的增加等。带菌的种子的发芽率和出苗率都明显降低。棉花不同生长时期，通过田间人工接种实验，确定***在棉花上的主要侵染途径;结果显示：病原菌不能通过种子和土壤带菌传播，棉株中内生的***与棉花烂铃病的发生之间没有明显的相关性，病原菌也不能通过植株、花器、铃表面的喷雾侵入寄主，棉铃表面的轻微刮伤也不能作为病原菌侵入的通道，只能通过棉铃穿刺（刺透铃壳）和注射接种才能造成烂铃症状的出现。棉花结铃盛期,采集棉田中主要昆虫，分离并确定各种昆虫体内是否携带***，结果表明，在新疆棉田昆虫体内能分离得到成团泛生菌***的有缨翅目的花蓟马（***）、半翅目的牧草盲蝽（Lygus pratensis）、苜蓿盲蝽（Adelphocoris suturalis）长蝽（***）、花蝽（***）和缘蝽（***），鞘翅目的多异瓢虫（Adonia variegata）、七星瓢虫（Coccinella septempunctata），鳞翅目的棉铃虫幼虫（Heliothis armigera）;棉蚜（Aphis gossypii）体内没有分离到目标菌。田间的花蓟马、牧草盲蝽、苜蓿盲蝽的带菌率最高。花蓟马的带菌量相对较低，单个虫体的带菌量最多为44 CFU/头，而盲蝽的个体带菌量为80-5.14*103CFU/头，盲蝽的个体带菌量远远大于田间花蓟马的带菌量。　　⑵应用对不同药剂敏感性分析和REP-PCR技术分析了不同来源株菌的遗传多样性，室内药敏性测定的聚类分析得出，33个菌株可分为5个群，两个大组群：A群和B群各含14个和16个菌株，两组群菌株数占了总菌株数的91.0%，A组主要包含了来自棉花烂铃病的菌株和田间盲蝽的分离物。REP-PCR结果显示，供试菌株在70%的差异性上可以分为5个群，其中B群最大，包括了21个菌株，占供试菌株的67.7%，且来自棉花烂铃病的菌株与来自田间盲蝽的菌株具有更近的亲缘关系。在离体条件下，分别用带有抗生素抗性基因标记的突变菌株Cx21-R和带有绿色荧光标记的菌株Cx21-GFP饲喂盲蝽后，盲蝽的喙、头部和消化道中都能分离到Cx21-R菌株，且消化道中细菌的含量明显高于喙和头部，盲蝽消化道的中肠和后肠中有明显的绿色荧光产生。表明细菌主要定殖在盲蝽的消化道中。用带有抗性标记菌株CX21-R的绿豆饲喂盲蝽后，将带菌盲蝽转接到离体棉铃上，盲蝽取食后棉铃的发病率分别为47.1%和56.25%，明显高于未接菌盲蝽取食后棉铃的发病率（分别为10.0%和6.25%）。表明，带菌盲蝽在离体棉铃上取食后，可将病原细菌Pantoea agglomerans有效的转移进入棉铃内部。且不同生长阶段的棉铃发病率存在一定差异，结铃10左右的幼铃和结铃20d左右的中等大小棉铃的发病率较高，幼铃的发病率分别为71.88%和67.86%，中等大小棉铃的发病率分别为66.67%和64.28%;而结铃30d以上的成铃发病率分别为33.33%和30.77%。表明铃的成熟程度对病原的侵染能力影响较大，幼铃和中等大小的棉铃更容易感染病害，而成熟阶段的棉铃对病害的感染能力较弱。不同的盲蝽数量与棉铃的发病率之间存在显著的正相关性，分别接种2头、5头和10头带菌的盲蝽，棉铃的发病率分别为13.79%

关键词：棉花种植细菌侵染介体传播病原鉴定

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分枝杆菌细胞全容物在细菌抵御巨噬细胞降解作用的研究

分枝杆菌细胞全容物在细菌抵御巨噬细胞降解作用的研究

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作者：秦彪杰大连医科大学

学位级别：硕士

结核杆菌是一种慢生长胞内细菌,能够在细胞内存活并缓慢增殖,在免疫系统功能下降时,细菌爆发性增值并引起严重肺部炎症,威胁生命。结核杆菌作为一种胞内细菌,具有逃避免疫细胞攻击的特点,研究其对免疫系统攻击机制对研发特效抗结核药物... 详细信息

结核杆菌是一种慢生长胞内细菌,能够在细胞内存活并缓慢增殖,在免疫系统功能下降时,细菌爆发性增值并引起严重肺部炎症,威胁生命。结核杆菌作为一种胞内细菌,具有逃避免疫细胞攻击的特点,研究其对免疫系统攻击机制对研发特效抗结核药物以及新的检测手段的发现具有十分重要的意义。位于细胞壁外侧的脂多糖可以引发多种免疫反应,尤其是LAM/LM(脂阿拉伯甘露糖聚糖/脂甘露糖聚糖)被认为介导了Thl/Th2型细胞免疫反应,决定了细菌在细胞内的存活。然而,结核杆菌与细胞互作是一个复杂的免疫反应,寻找具有免疫逃避功能的分子,需要从不同水平进行检测,包括从细菌水平到分子水平如LAM等,才能确认靶分子并对细菌与细胞互作进行真实的表述。由于结核杆菌具有高的致病性,耻够杆菌常作为替代菌对结核相关特性进行研究。本论文使用耻垢分枝杆菌及其细胞全容物利用气雾攻击法,对小鼠肺部进行侵染,同时利用巨噬细胞做了相应的体外实验,对细菌在细胞以及肺部互作规律进行描述,为细菌在细胞内存活相关活性因子提供了实验依据,并为进一步分选有效组分提供研究手段。本课题使用了耻垢分枝杆菌和大肠杆菌两种细菌对小鼠肺脏进行了侵染,发现这两种细菌在存活和被清除的特点上存在差异。在较低侵染浓度时(MOI≤10以及≤108CFU/mouse)两种细菌都表现为迅速被清除,当侵染浓度较高时(MOI≥100以及≥109CFU/mouse)表现为肺脏清除细菌速率减慢,甚至不能控制细菌的增值,于是选择适当的细菌侵染浓度(MOI=10以及107CFU/mouse)进行实验,发现细菌在24-72h内表现为被清除,但耻垢分枝杆菌清除速率较大肠杆菌的要慢,于是利用两种细菌的细胞全溶解物(WCL)对这两种模型进行干预,发现细菌细胞全容物影响细菌存活和清除的规律,且耻垢分枝杆菌WCL(S)降低了大肠杆菌被清除的速率。进一步利用分离的细胞壁组分对这两中模型进行干预,发现细菌细胞全容物影响巨噬细胞功能,对细菌存活率有较大影响,WCL(S)具有帮助大肠杆菌提高在细胞内存活的能。同时检测了细胞形态以及肺部损伤与细菌清除规律之间的关系。分别从动物和细胞水平,验证了细菌存活能力的差异,以及WCL在其中所起的作用。实验结果显示,利用高浓度耻垢分枝杆菌侵染小鼠肺部后,肺部出现炎症,短期出现了结核相类似的病理特征,提示该模型可用于模拟结核杆菌对肺部的早期感染。耻够杆菌在巨噬细胞中表现出较大肠杆菌更长的存活时间,且清除速率较慢,且WCL(S)具有帮助大肠杆菌提高在细胞内存活的能力。

关键词：细菌侵染清除及存活规律细胞壁组分肺部损伤

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达氏鲟HSP70-4基因序列特征及其饥饿与病原菌感染下的差异表达模式分析

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农业生物技术学报 2021年第8期29卷 1584-1593页

作者：龚全李青芝孙甲华林珏肖宇苏旭涛刘光迅杜军四川省农业科学院水产研究所

热休克蛋白(heat shock protein, HSPs)是一类在不同生命形式间高度保守的蛋白质,参与蛋白质的折叠、生物基质的稳定、大分子装配、多肽的降解及转录调控等。为研究达氏鲟(Acipenser dabryanus)热休克蛋白70-4 (HSP70-4)基因组织差异表... 详细信息

热休克蛋白(heat shock protein, HSPs)是一类在不同生命形式间高度保守的蛋白质,参与蛋白质的折叠、生物基质的稳定、大分子装配、多肽的降解及转录调控等。为研究达氏鲟(Acipenser dabryanus)热休克蛋白70-4 (HSP70-4)基因组织差异表达谱及其在饥饿和细菌侵染状态下的表达变化,本研究通过达氏鲟全长转录组测序数据库,获得HSP70-4基因序列,其cDNA全长为4 029 bp,ORF为2 550 bp (GenBank No. MZ285757),编码849个氨基酸。其中5'UTR为234 bp,3'UTR为1 245 bp。系统发育树显示,达氏鲟HSP70-4与小体鲟(A. ruthenu) HSP70-4聚在一支,置信度为100%。组织分布结果表明,达氏鲟肝脏、性腺、肌肉、脑、眼睛、皮肤、头肾、心脏、肠、脾脏和鳃11个组织中均有HSP70-4表达,其中,眼睛中的表达量最高,其次为脑和肌肉,肝脏、头肾、皮肤和肠道中的表达量较低。在饥饿胁迫下,达氏鲟HSP70-4 mRNA出现了上调表达,饥饿14 d后,肠道及肌肉中HSP70-4基因均出现显著上调表达;感染迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)(1×107 CFU/mL) 12 h后,皮肤、脾脏和头肾中的HSP70-4与对照组相比显著上调表达(P<0.05);24 h后,鳃组织中的表达量开始显著上调(P<0.05)。研究结果表明达氏鲟HSP70-4参与了机体对抗饥饿及致病菌侵染的生物学过程,为进一步研究达氏鲟HSP70-4基因的诱导差异表达机制以及抗逆机理提供理论依据。

关键词：达氏鲟 HSP70-4 饥饿胁迫细菌侵染

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达氏鲟心型脂肪酸结合蛋白的基因克隆及表达分析

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农业生物技术学报 2020年第1期28卷 139-149页

作者：陈叶雨刘亚赖见生宋明江龚全四川省农业科学院水产研究所

心型脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid-binding proteins, FABP-3)是脂质结合蛋白超家族的成员,主要参与机体脂肪酸摄取和转运等代谢过程。为深入了解FABP-3的结构及其在达氏鲟(Acipenser dabryanus)营养代谢及免疫调控中的功能,... 详细信息

心型脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid-binding proteins, FABP-3)是脂质结合蛋白超家族的成员,主要参与机体脂肪酸摄取和转运等代谢过程。为深入了解FABP-3的结构及其在达氏鲟(Acipenser dabryanus)营养代谢及免疫调控中的功能,本研究以达氏鲟3代全长转录组测序获得的unigenes序列为基础,获得FABP-3的cDNA序列,分析FABP-3基因在不同组织、饥饿胁迫及迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)侵染作用下的表达情况。结果显示,FABP-3基因cDNA全长为641 bp (GenBank ***064725),其中5’非编译区为89 bp,3’非编译区为150 bp,开放阅读框为402 bp,编码133个氨基酸。其三维结构由10个β-折叠和2个α-螺旋组成,包含3个保守氨基酸残基(Arg 107, Arg 127, Tyr 129),在氨基酸6～120位置之间具有保守的脂质转运蛋白结构域。FABP-3在达氏鲟各组织中广泛分布,其中,肌肉中FABP-3表达量最高,显著高于其他组织(P≤0.05)。饥饿条件下,脑、肝和胃中的FABP-3表达量呈先上升后降低的趋势;肠道和肌肉中的FABP-3表达量在饥饿过程中出现下调,且均显著低于第0天(P≤0.05)的表达水平。迟缓爱德华氏菌侵染作用下,FABP-3在鳃和脾中呈现先下降后上升的表达趋势;感染12 h后,在肠道中的表达量是对照组的219倍。本研究结果表明达氏鲟FABP-3参与机体营养代谢及免疫应答等生物学途径,为今后达氏鲟营养及免疫调控分子机制的研究提供了理论基础。

关键词：达氏鲟心型脂肪酸结合蛋白组织表达饥饿胁迫细菌侵染

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似鲇高原鳅LEAP-2基因序列特征及表达分析

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西南农业学报 2021年第9期34卷 2050-2056页

作者：宋明江陈叶雨吴晓雲刘亚龚全赖见生四川省农业科学院水产研究所四川成都611731

【目的】研究似鲇高原鳅抗菌肽的生物学功能。【方法】通过似鲇高原鳅转录组测序数据库,获得LEAP-2基因序列。【结果】cDNA序列为2253 bp,其中5’非编译区(UTR)为270 bp, 3’UTR为1698 bp,开放阅读框为285 bp,编码94个氨基酸。信号肽预... 详细信息

【目的】研究似鲇高原鳅抗菌肽的生物学功能。【方法】通过似鲇高原鳅转录组测序数据库,获得LEAP-2基因序列。【结果】cDNA序列为2253 bp,其中5’非编译区(UTR)为270 bp, 3’UTR为1698 bp,开放阅读框为285 bp,编码94个氨基酸。信号肽预测结果显示LEAP-2信号肽包含28个氨基酸残基。似鲇高原鳅的LEAP-2与西藏高原鳅LEAP-2聚在一支,置信度为99%。组织分布结果表明,LEAP-2在健康似鲇高原鳅的鳃、肾脏、肝脏、肌肉、胃、脑、肠道、脾脏、皮肤、眼睛和心脏共11个组织中均有表达,其中,在似鲇高原鳅肝脏中的表达量最高,是鳃中表达量的2000多倍。在迟缓爱德华氏菌作用下,似鲇高原鳅LEAP-2 mRNA表达量在各免疫组织中呈现出不同的变化趋势。在粘膜相关组织皮肤、鳃和肠道中,细菌侵染后LEAP-2出现显著上调表达(P<0.05)。在系统性免疫组织脾脏、肝脏和肾脏中,肝脏中的LEAP-2在细菌侵染24 h时显著上调表达(P<0.05),随后下降;脾脏中LEAP-2先下降表达,随后显著上调表达(P<0.05),最终恢复到正常表达水平;肾脏中的LEAP-2在攻毒96 h上调表达(P<0.05)。【结论】似鲇高原鳅LEAP-2参与了机体对抗致病菌侵染的生物学过程。

关键词：似鲇高原鳅抗菌肽 LEAP-2 细菌侵染

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复制可控型AcMNPV载体构建及其在粘虫基因功能研究中的应用

复制可控型AcMNPV载体构建及其在粘虫基因功能研究中的应用

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作者：周义成华中农业大学

学位级别：博士

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)是目前研究最多的杆状病毒,可感染多种鳞翅目害虫,可高效的携带外源基因进入细胞内表达,具有开发成基因传递载体的潜力,但因其对寄主昆虫具有高致病性,导致难以将其应用于鳞翅目害虫基因功能研究。... 详细信息

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)是目前研究最多的杆状病毒,可感染多种鳞翅目害虫,可高效的携带外源基因进入细胞内表达,具有开发成基因传递载体的潜力,但因其对寄主昆虫具有高致病性,导致难以将其应用于鳞翅目害虫基因功能研究。本研究通过诱导调控表达系统控制AcMNPV复制必须基因的表达来降低其对寄主昆虫的致病性,使其成为携带外源基因进入昆虫细胞进行基因沉默、敲除、过表达和蛋白标记的载体,并使用构建的复制可控型AcMNPV载体在粘虫Mythimna separata中进行基因功能研究。将AcMNPV用作基因功能研究工具首先需要包装病毒,目前杆状病毒常利用Bac-to-Bac系统包装,在哺乳动物中,细菌侵染可介导基因转移至哺乳动物细胞和组织表达。本研究将文献报道的对哺乳动物细胞有侵染性的因子克隆到大肠杆菌中表达,筛选对昆虫细胞具有侵染性的因子,最终筛选到来源于假结核耶尔森氏菌Yersinia pseudotuberculosis的yad A蛋白可提高细菌对sf9细胞的侵染能力,利用表达yad A的细菌介导AcMNPV转移到sf9细胞制备病毒时,表达yad A的菌株介导杆状病毒传递到sf9细胞的效率是普通菌株的4.9倍。为了降低AcMNPV对其寄主的致病性,本研究利用Red重组系统将AcMNPV的复制必须基因ie1敲除,再利用Tet-On 3G系统控制ie1基因表达,此AcMNPV在sf9细胞中存在少量背景复制,但在粘虫体内复制完全不受控制,表明单独使用Tet-On 3G系统控制杆状病毒复制时背景表达水平过高,达不到控制杆状病毒复制的目的。鉴于使用Tet-On 3G系统控制病毒复制时背景表达水平仍然过高,本研究采用多种策略降低Tet-On 3G系统的背景表达水平,一是利用Csy4系统在转录后水平降低Tet-On 3G系统的背景表达水平,另一种策略是构建转基因粘虫将Tet-On 3G基因整合到粘虫基因组中。使用优化后背景表达水平更低的Tet-On 3G-Csy4系统控制AcMNPV的ie1基因表达时,病毒在sf9细胞中的复制可受诱导剂强力霉素Dox调控,将病毒注射粘虫喂食Dox后,从第24h至第48h开始往饲料中添加抗病毒药物abacavir,粘虫感染率可达到60.2%-70.1%,而存活率保持在58.9%-82.2%,在粘虫体内可实现病毒复制可控,病毒可感染粘虫而不杀死粘虫。而在构建转基因粘虫降低背景表达水平的方式中,我们虽成功将Tet-On 3G基因插入到粘虫基因组,但这个转基因品系不能支持ie1基因敲除的病毒复制。为了将复制可控型AcMNPV载体用于粘虫基因功能研究,我们将ds RNA基因表达盒和CRISPR/Cas9系统装载到AcMNPV基因组中,选择粘虫Mschs B基因作为靶标,分别进行基因沉默和敲除实验,但未能检测到靶标基因沉默和敲除。本研究筛选对sf9细胞具有侵染能力的因子,利用细菌介导基因转移至sf9细胞的方式生产杆状病毒,简化了病毒包装流程,降低了生产成本,可为高通量生产杆状病毒提供便利;通过构建复制可控型AcMNPV载体,降低AcMNPV其对寄主的致病性,可携带外源基因进入昆虫体内进行沉默、敲除过表达和蛋白标记等研究,为进一步利用病毒载体进行基因功能研究奠定了基础。

关键词：细菌侵染 AcMNPV 诱导调控表达系统粘虫 RNA干扰 CRISPR

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两种新型多功能纤溶酶的鉴定及其分子生物学特性研究

两种新型多功能纤溶酶的鉴定及其分子生物学特性研究

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作者：高柱虎武汉大学

学位级别：博士

在朝鲜的清曲酱、中国的豆豉、日本的纳豆等大豆发酵食品中存在着大量的枯草杆菌纤维蛋白溶解酶，这种酶具有安全性高、规模化生产、直接分解纤维蛋白、口服使用、特异性高、预防和治疗血栓疾病等许多优点，因此对这类纤溶酶进行了深入... 详细信息

在朝鲜的清曲酱、中国的豆豉、日本的纳豆等大豆发酵食品中存在着大量的枯草杆菌纤维蛋白溶解酶，这种酶具有安全性高、规模化生产、直接分解纤维蛋白、口服使用、特异性高、预防和治疗血栓疾病等许多优点，因此对这类纤溶酶进行了深入的研究。到目前为止大部分研究者都使用从市售食品中分离的酶来研究，尚无筛选食品中纤溶酶活性最高的菌株的、更无有关这种酶的抗氧化作用、细胞保护作用、靶向性等多种功能的研究。本文从发酵大豆中筛选并分离了一株可产生高活性纤溶酶的枯草杆菌，并对该纤溶酶进行了多种功能的研究，为开发第三代溶栓剂奠定了基础。作者利用纤维蛋白平板法从用水稻叶包裹的大豆发酵品中筛选了一株产高活性纤溶酶的枯草杆菌Bacillus subtilis QK02，经中国典型培养物保藏中心鉴定并保存，保存序号为CCTCC No：M203078。这个菌种的纤溶酶活性比一般枯草杆菌的高出5-60倍。从该菌的培养液中纯化出两种纤溶酶（称为Subtilisin,QK-1和QK-2），分子量分别为42，000和28，000，比活性为1930IU／mg和41，000IU／mg。它们都直接分解纤维蛋白的Aα-，Bβ-，γ-链，对胰蛋白酶的降解具有抗性。其中低分子量的纤溶酶QK一2不受血液中纤溶酶活化抑制剂（PAI一1）的抑制，QK一2的N一末端氨基酸序列为 A一Q一S一V一P一Y一G一I一S一Q一I一K一A一P一A一L一H一S一Q一G，和Subtilisin NAT、Subtilisin J、SubtilisinE、Subtilisin Amylosaeeharitieus、MensentrieoPePtidase的完全一致，故命名QK一2为Subtilisin QK。以Subtilisin QK（以后简称QK）的N一端氨基酸序列和已发表的纳豆激酶C一端序列设计引物，从枯草杆菌B. subtilis QKOZ基因组中扩增了qk基因，该基因由828 bp的DNA组成，编码一个由2 75个氨基酸组成的蛋白质。氨基酸序列中含有纤溶酶活性中心Asp32、 His64、ser22‘和底物结合位点ser‘26、Leu‘27、oly，28，与纳豆激酶很相似。从推断的氨基酸序列和限制性酶切图谱分析，该酶和已报道的Subtilisin家族的5 个蛋白酶不一样，与此酶同源性最高的是Subtilisin NAT（高于96.8%）。根据 subtilisin BPN’的3维结构模拟了QK蛋白酶的3维结构，该酶具有6个a一螺旋和9个p一折叠，由活性中心和底物结合位点的氨基酸组成的裂缝（d eft）结构，便于与纤维蛋白分子的接触和结合。通过常规操作获得了含有qk基因的重组表达质粒，在大肠杆菌中表达的重组纤溶酶r一QK具有与天然蛋白相同的纤溶酶活性。 QK在体外拮抗由氧化剂引起的牛血清白蛋白氧化的能力用分光光度计、荧光光谱、ELISA和westhern blot进行了检测，在体内用ELISA检测了QK对亚硝酸钠和过氧化氢引起的老鼠的脑、心、肝、肾和肌肉中的蛋白质的酪氨酸硝酸化的抑制作用。结果表明QK在体外和体内都有明显的抗蛋白质硝酸化作用。QK还能抑制NO对血红素蛋白的氧化，这种作用可能是一种与纤溶活性无关的酶学反应。除此之外，QK还可以保护人脐血管内皮细胞（ECV一304）不受亚硝酸钠和过氧化氢的毒害。另一方面，作者还用引物（p4，ps）从枯草杆菌*** QK02基因组扩增出另一个798bp的DNA片段，从DNA序列推导该片段编码一个257个氨基酸组成的蛋白质，推论的纤溶酶活性中心为Asp38、His6“、Ser222。据同源性比较发现，这个蛋白与已发表的枯草杆菌所有纤溶酶无同源性，而与大肠杆菌的一种丝氨酸蛋白酶DegS的同源性高于98，7%，但缺乏DegS的跨膜区（TM domain），所以我们将此基因命名为△TM一degs。利用据此△TM一degs和degs基因的N一段与degs基因的C一段设计的引物DSI，PKI和PDZ的菌

关键词：纤溶作用枯草杆菌抗氧化作用细菌侵染血纤溶酶激活单链抗体基因噬菌体展示抗体库腺病毒载体丝氨酸蛋白酶细胞保护作用蛋白质亚硝酸化

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