豹纹鳃棘鲈(Plectropomus leopardus)又名东星斑,是一种十分名贵的海洋养殖鱼类,主要分布于波斯湾至太平洋之间的暖水区域。然而,随着豹纹鳃棘鲈繁育和养殖的不断发展,苗种繁育和成鱼生产中出现的各类病害也日益增多,已严重制约了其养殖业的健康发展。鱼类细胞系是一个低成本、高重复的离体培养系统,具有高度可精确控制的特性,在病毒学、免疫学、肿瘤学、基因组研究、毒理学等方面都具有很高的使用价值。本文主要采用鱼类细胞培养技术,构建了豹纹鳃棘鲈的肠细胞系和鳃细胞系,确定了这两种细胞系的最佳生长条件,探索了这两种细胞系对不同种类的细菌及重金属的敏感性。主要研究内容及结果如下:1、以组织块消化贴壁法,分别建立了豹纹鳃棘鲈肠细胞系(PLI)和豹纹鳃棘鲈鳃细胞系(PLG)。形态学观察结果显示:PLI和PLG在光学显微镜下观察均呈现纤维状,至今已传至40余代。对PLI和PLG的最适生长条件研究表明,PLI和PLG的最适宜生长条件为:血清含量为20%,培养基类型为L15,生长温度为26℃。2、将扩增的18 S rRNA基因片段和NCBI上已公布的豹纹鳃棘鲈的18 S r RNA基因序列进行比较,结果显示两者的同源性为100%,表明两个细胞系均来源于豹纹鳃棘鲈。经核型分析实验鉴定,发现两种细胞系种均有染色体的非整倍性,说明两种细胞系存在缺失、断裂和畸变现象,但依然保存了48条特征性染色体组型数。对PLI和PLG的两个细胞进行细胞周期检测,发现它们都是由具有增殖能力的二倍体细胞构成,可以进行连续的体外培养和基因研究。3、使用脂质体转染技术,将加强型的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因成功在两个细胞系中表达,得到PLI的转染效率约为20%,PLG的转染效率约为15%。通过分析细胞对细菌的敏感性可得,PLI和PLG对哈维氏弧菌和迟缓爱德华氏菌均较为敏感,且对哈维氏弧菌的敏感性更强。通过分析细胞对重金属的敏感性可得,PLI和PLG对Cd,Cu和Hg三种重金属均表现敏感,细胞对重金属Hg更为敏感,且PLI和PLG的细胞存活率与重金属溶液的浓度之间有剂量依赖性。综上所述,本研究构建了豹纹鳃棘鲈肠细胞系和鳃细胞系,这两种细胞系都可作为体外实验研究的理想工具,为进一步开展豹纹鳃棘鲈基因的功能、毒理学、免疫学等研究工作提供全新的实验材料与思路,同时也为其他鱼类细胞系的构建提供了借鉴。
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