检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：苏愉福建师范大学

学位级别：硕士

固定化细胞（cell immobilization）技术是指将微生物固定在水不溶载体上,在特定的空间区域内完成生命活动。和游离细胞培养相比,固定化细胞技术在许多方面都表现出了显著的优势。例如,连续利用、较高的细胞密度、更好的代谢活性、更高... 详细信息

固定化细胞（cell immobilization）技术是指将微生物固定在水不溶载体上,在特定的空间区域内完成生命活动。和游离细胞培养相比,固定化细胞技术在许多方面都表现出了显著的优势。例如,连续利用、较高的细胞密度、更好的代谢活性、更高的生产力。固定化细胞的方法包括包埋法、共价结合法、交联法和吸附法等。其中吸附法通过物理手段或者离子作用将细胞固定在载体上,此方法简单易行,虽然不会对细胞造成影响,但是由于吸附能力较弱,细胞很容易脱离其中,因此,解决吸附法吸附能力弱等问题弱迫在眉睫。细菌表面展示（Bacterial Surface Display）可以将目标蛋白表达转运并锚定在细菌表面,把外源功能蛋白的编码基因与宿主细菌的锚定域（Anchoring Domain）编码基因通过DNA重组融合,融合蛋白可以在锚定基序（Anchoring motif）引导下,在宿主细菌中表达、分泌并锚定在细胞膜上实现细菌表面展示,蛋白可以维持原有的构象和生物学功能,具备生物诱导催化的活性。本文利用细菌表面展示技术,将来源于凤梨欧氏杆菌（Erwinia ananas）的Ina A和来源于丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的Inak为锚定蛋白,将带负电荷的氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）锚定在大肠杆菌（Escherichia coli）表面,以此来增加***表面的负电性,从而强化工程化***与改性后的生物炭之间的吸附作用,同时将带正电荷的氨基酸（赖氨酸）锚定在大肠杆菌表面作为对照。通过Western blotting结果显示,来源于***的Ina A成功将融合蛋白锚定在***细胞膜上。生物炭（Biochar）制作成本低,合成较简单、快速,拥有较高的孔隙率、比表面积大,同时具有高吸附性能、优异的阳离子交换容量和稳定性较好等特性,能为细菌提供一个稳定的环境同时保护它们免受外界环境的损害,因此生物炭是一种非常适合细菌固定的载体。据报道大多数未改性的生物炭表面都带有正电荷,而大肠杆菌等细菌表面带负电荷,根据静电作用原理,如果生物炭进行改性可以使其表面带正电荷,则可以吸附带负电的细胞。本文使用玉米秸秆,通过热解法制备出玉米秸秆生物炭,并使用三种无机化合物Fe Cl、Mg Cl、Al Cl进行改性,将改性生物炭通过Zeta电位分析仪检测表面电性,三种无机化合物都成功改性生物炭从负电性到正电性,其中Fe Cl改性的生物炭（MBC-Fe）当剂量为2 mg/m L的时候,表面能够富集最多的正电荷（+8.96 m V）。通过扫描电子显微（Scanning Electron Microscope,SEM）观察细胞与生物炭的吸附情况得知,携带更多负电荷氨基酸的重组***细胞与MBC-Fe之间具有更强的吸附效率,形态观察说明生物炭能够为细胞提供一个相对稳定的环境,使细胞能够保持原有的形态。利用傅里叶远红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectrometer,FT-IR）表征分析生物炭及其生物炭固定化细胞表面的官能团位置和分布情况,结果表明重组***细胞被成功固定在MBC-Fe上。测定MBC-Fe固定化细胞的效率,结果表明Tp AE-N45@MBC-Fe（59.45%）>Tp AE-N9@MBC-Fe（50.1%）>TpAE-N0@MBC-Fe（48.25%）>Tp AE-P7@MBC-Fe（40.15%）>原始菌株TpE@MBC-Fe（27.6%）,细胞膜表面负载负电荷的菌株固定化率显著高于表面负载正电荷的菌株和原始菌株。将上述开发的固定化细胞系统应用到发酵产色氨酸（L-Tryptophan,L-Trp）和全细胞催化产吲哚-3乙酸（Indole-3 acetic-acid,IAA）中,Mp-trp AN45@MBC-Fe细胞表面锚定最多负电荷氨基酸的固定化细胞,在发酵过程中能够连续循环四轮发酵（288 h）,而其他菌株细胞膜表面表达了较少负电荷或正电荷均只能进行一次性发酵一轮（72 h）。在产IAA菌株全细胞催化中,固定化的菌株Mp-IAAN45@MBC-Fe在全细胞催化过程中能够连续进行催化六轮发酵生产（432 h）,在第六轮中IAA产量为0.27 g/L;而对照菌株Mp-IAA@MBC-Fe在全细胞催化过程中最多只能够进行三轮发酵生产（216 h）。本研究开发的固定化细胞系统能够改善吸附法固定化细胞的吸附效率低的问题,在发酵和全细胞催化中能够延长细胞生长周期并连续生产L-Trp和IAA,同时节约了前期细胞培养的时间,提高了固定化细胞的利用率,并且具有一定的工业化前景。

关键词：固定化细胞细菌表面展示技术生物炭改性 E. coli L-色氨酸吲哚-3乙酸

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利用细菌表面展示技术强化细胞固定化生产吲哚-3-乙酸

引用

福建农业科技 2022年第8期53卷 14-22页

作者：苏愉刘晴浩包心茹黄建忠祁峰福建师范大学生命科学学院工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心福建福州350117 福建师范大学细胞逆境响应与代谢调控福建省高校重点实验室福建福州350108

目的利用细菌表面展示技术,以冰晶核蛋白INaA、INaK为锚定蛋白,将负电荷的氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)锚定在大肠杆菌表面(Escherichia coli),增加细胞膜表面携带的负电荷,与改性后带正电荷的生物炭吸附以强化生物炭固定化细胞的功能。利... 详细信息

目的利用细菌表面展示技术,以冰晶核蛋白INaA、INaK为锚定蛋白,将负电荷的氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)锚定在大肠杆菌表面(Escherichia coli),增加细胞膜表面携带的负电荷,与改性后带正电荷的生物炭吸附以强化生物炭固定化细胞的功能。利用2 mol·L^(-1)的FeCl_(3)改性玉米秸秆生物炭使其呈正电性,将改性生物炭与细胞表面负电荷增加的重组菌株进行静电吸附,重组菌株EPA03与对照菌株相比吸附率提高31.75%。将此策略应用在固定化细胞高效生产IAA的菌株中,在全细胞催化连续循环中,菌株EPA03连续循环中能连续反应6个循环,IAA积累量比对照菌株提高了42.85%。

关键词：生物炭固定化细胞细菌表面展示技术大肠杆菌吲哚-3-乙酸

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