检索结果-内蒙古大学图书馆

血清中hsa_circRNA_103191绝对荧光定量pcr方法的构建及应用

新余学院学报 2022年第1期27卷 11-18页

作者：严家来方安宁丁艳常文雅潘思梦安徽医学高等专科学校医学技术学院安徽合肥230601 安徽医学高等专科学校基础医学院安徽合肥230601 东南大学医学院病原生物学与免疫学系江苏南京210009 合肥千麦医学检验实验室有限公司安徽合肥230000 合肥迪安医学检验实验室有限公司安徽合肥230000

目的:建立准确定量血清中hsa_circRNA_103191的绝对反转录荧光定量pcr(RT-qpcr)方法,并在肝癌患者外周血清中验证hsa_circRNA_103191的拷贝数。方法:提取肝癌患者肿瘤组织和血清中的总RNA,反转录获得cDNA,再以cDNA为模板,pcr法扩增出包... 详细信息

目的:建立准确定量血清中hsa_circRNA_103191的绝对反转录荧光定量pcr(RT-qpcr)方法,并在肝癌患者外周血清中验证hsa_circRNA_103191的拷贝数。方法:提取肝癌患者肿瘤组织和血清中的总RNA,反转录获得cDNA,再以cDNA为模板,pcr法扩增出包含反向剪接位点的hsa_circ RNA_103191的119bp特异性片段,克隆到T载体中,经蓝白斑筛选,测序鉴定重组质粒。对重组质粒进行梯度稀释成标准品。采用SYBR荧光染料法进行扩增,建立标准曲线,在肝癌患者外周血中验证hsa_circRNA_103191的copies。结果:肝癌患者外周血清中游离的总RNA较肝癌组织中总RNA降低(t=10.95,p<0.0001)。建立了能准确定量血清中GAPDH和hsa_circRNA_103191拷贝数的RT-qpcr方法,使用该定量方法能检测血清中GAPDH和hsa_circRNA_103191的表达。结论:建立了检测hsa_circRNA_103191的绝对荧光定量RT-qpcr方法,该法检测线性范围广,灵敏度、特异性、重复性均良好,可为血清中circRNA精确定量提供参考方法。

关键词： hsa_circRNA_103191 绝对荧光定量pcr 血清原发性肝癌

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太平洋鳕RAG1和IgM基因荧光定量pcr方法的建立及初步应用

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水产学报 2015年第4期39卷 475-484页

作者：李幸温施慧毛明光姜志强蒋洁兰大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室

为研究太平洋鳕发育早期特异免疫系统形成的机制,通过RAG1和Ig M基因的转录水平衡量特异免疫系统的发育特点。根据Gen Bank中RAG1和Ig M的序列信息,分别设计1对特异引物,从太平洋鳕头肾中扩增得到RAG1和Ig M的基因片段。将所获基因片段... 详细信息

为研究太平洋鳕发育早期特异免疫系统形成的机制,通过RAG1和Ig M基因的转录水平衡量特异免疫系统的发育特点。根据Gen Bank中RAG1和Ig M的序列信息,分别设计1对特异引物,从太平洋鳕头肾中扩增得到RAG1和Ig M的基因片段。将所获基因片段分别插入到克隆载体p MD18-T中,从而构建太平洋鳕RAG1和Ig M基因的质粒标准品。建立并优化太平洋鳕RAG1和Ig M基因绝对荧光定量pcr方法。为进一步验证该方法的可靠性,分别利用绝对定量和相对定量检验目的基因在太平洋鳕早期发育过程不同组织内的表达差异。以优化后的绝对荧光定量pcr方法检测不同发育时期太平洋鳕RAG1和Ig M的表达情况。结果显示,RAG1的回归方程为y=-3.266x+33.77,回归系数R2=0.996;Ig M的回归方程为y=-3.119x+27.61,回归系数R2=0.998。绝对定量和相对定量结果在基因转录趋势上显现出一致性,即RAG1基因在胸腺和头肾中表达,且在胸腺中的表达量显著高于头肾中的表达量,在肝脏和脾脏中无表达;Ig M基因在胸腺、头肾、肝脏和脾脏中均有表达,其中脾脏中表达量最高,其次是头肾。RAG1基因在太平洋鳕发育早期的表达水平很低,到61日龄(days posthatching,dph)至95 dph表达量显著提高;Ig M基因在早期表达水平同样很低,到33 dph至61 dph才有明显表达,在95 dph时表达量显著提高。研究表明,本实验方法可靠,特异性较强,可成功对目标基因转录水平进行检测。

关键词：太平洋鳕 RAG1 IgM 绝对荧光定量pcr

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hsa＿circ＿0004123绝对定量pcr方法的建立及验证

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解放军医学杂志 2019年第11期44卷 906-911页

作者：付立芳张航吕文琼韩星邹琳重庆医科大学附属儿童医院临床分子医学中心/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心/儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地/重庆市干细胞治疗工程技术研究中心重庆400014 四川省雅安市人民医院检验科四川雅安625000 成都市第三人民医院实验医学科临床检验部成都610000 四川大学华西第二医院小儿血液肿瘤科成都610000 西安市儿童医院检验科西安710004

目的建立能精确定量hsa_circ_0004123的绝对反转录荧光定量pcr(RT-qpcr)方法,并在白血病细胞系中验证hsa_circ_0004123的拷贝数。方法提取B淋巴母细胞系***总RNA,反转录合成cDNA。以cDNA为模板,扩增包含hsa_circ_0004123反向剪接位点的2... 详细信息

目的建立能精确定量hsa_circ_0004123的绝对反转录荧光定量pcr(RT-qpcr)方法,并在白血病细胞系中验证hsa_circ_0004123的拷贝数。方法提取B淋巴母细胞系***总RNA,反转录合成cDNA。以cDNA为模板,扩增包含hsa_circ_0004123反向剪接位点的236 bp特征片段,克隆到pGM-T载体中,并对重组质粒进行测序鉴定。以梯度稀释的重组质粒为标准品,采用SYBR荧光染料法进行RT-qpcr并建立标准曲线,在4种白血病细胞系(***、Jurkat、Raji、K562)中验证hsa_circ_0004123的拷贝数。结果建立了能精确定量hsa_circ_0004123拷贝数的绝对RT-qpcr方法,其线性范围为(9.63×10^3~9.63×10^9)拷贝/μl,灵敏度为(4528±516)拷贝/μl,批内变异系数(CV)为0.30%~1.86%,批间CV为1.40%~2.30%,且熔解曲线为单一峰值曲线。对4种白血病细胞系(***、Jurkat、Raji、K562)中hsa_circ_0004123的拷贝数分别用本法进行检测,结果显示,hsa_circ_0004123在4种白血病细胞系中的表达差异有统计学意义(P<0.001)。结论建立的检测hsa_circ_0004123的绝对RT-qpcr方法具有线性范围广,灵敏度、特异性高,重复性好等特点,可为hsa_circ_0004123在白血病中的精确定量提供技术支持。

关键词： hsa_circ_0004123 绝对荧光定量pcr 白血病

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美棘蓟马体内Wolbachia感染的时空分布

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昆虫学报 2018年第7期61卷 843-850页

作者：张晓晨冯纪年西北农林科技大学植保资源与病虫害治理教育部重点实验室陕西杨凌712100

【目的】明确共生菌Wolbachia在美棘蓟马Echinothrips americanus体内的时空分布动态。【方法】基于Wolbachia的外膜蛋白基因(wsp)序列设计特异引物构建标准质粒,用绝对荧光定量pcr的方法测定美棘蓟马不同发育阶段(卵、若虫、预蛹、蛹... 详细信息

【目的】明确共生菌Wolbachia在美棘蓟马Echinothrips americanus体内的时空分布动态。【方法】基于Wolbachia的外膜蛋白基因(wsp)序列设计特异引物构建标准质粒,用绝对荧光定量pcr的方法测定美棘蓟马不同发育阶段(卵、若虫、预蛹、蛹、成虫)和雌雄成虫不同组织(头、胸、腹、腹末3节)中Wolbachia的wsp基因拷贝数,分析美棘蓟马共生菌Wolbachia的感染情况。【结果】美棘蓟马体内Wolbachia拷贝数随美棘蓟马发育进程逐渐增大,雌性成虫期Wolbachia拷贝数显著高于卵和若虫期;雌雄成虫不同组织中的拷贝数存在差异,雌性成虫腹部Wolbachia拷贝数显著高于头部、胸部和腹末3节,雄性成虫胸部和腹部Wolbachia拷贝数显著高于头部和腹末3节。美棘蓟马性别和组织与体内Wolbachia拷贝数存在显著的交互作用。【结论】本研究结果表明,美棘蓟马体内的Wolbachia感染状态不仅受宿主发育阶段的影响,而且与性别及分布位置有很大关系,为进一步了解该蓟马的发生、定植和扩散机理提供理论依据。

关键词：美棘蓟马 Wolbachia wsp 时空分布感染密度绝对荧光定量pcr

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光唇鱼生殖干细胞提取、冻存及移植的研究

光唇鱼生殖干细胞提取、冻存及移植的研究

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作者：李文雅宁波大学

学位级别：硕士

光唇鱼(Acrossocheilus fasciatus)属于我国溪流性特色经济鱼类,主要产于浙江、江苏、福建等地。近年来,由于生存环境的破坏和过度的捕捞导致光唇鱼种质资源逐渐衰退。因此对光唇鱼进行种质资源保护显得尤为重要。光唇鱼雌鱼较雄鱼具有... 详细信息

光唇鱼(Acrossocheilus fasciatus)属于我国溪流性特色经济鱼类,主要产于浙江、江苏、福建等地。近年来,由于生存环境的破坏和过度的捕捞导致光唇鱼种质资源逐渐衰退。因此对光唇鱼进行种质资源保护显得尤为重要。光唇鱼雌鱼较雄鱼具有更高的经济价值,实现全雌繁育可以提高光唇鱼养殖的经济效益。本研究目的是完成光唇鱼生殖干细胞的提取、生殖干细胞冻存及移植,此技术的成功可以推进光唇鱼种质资源的保护和全雌繁育的进程。研究中将光唇鱼性腺利用不同的消化酶体系和不同的消化时间进行条件优化;性腺冻存中选用不同浓度的抗冻剂及不同的降温方式对冻存条件进行优化;利用显微注射技术将光唇鱼生殖干细胞移植进入斑马鱼仔鱼腹腔内,通过荧光显微镜观察和绝对荧光定量确定移植是否成功。研究结果如下:(1)利用不同的消化酶体系及不同消化时间进行性腺消化,获得最适消化体系为:L-15(细胞培养基):1%胶原酶:0.05%DNA酶Ⅰ:0.25%胰酶:胎牛血清=850μL:30μL:50μL:50μL:20μL,最佳消化时间3小时,以此条件获得的精原细胞和卵原细胞的数目分别为(16.5±0.50)×10～5个/μL和(12.7±0.70)×10～5个/μL。(2)性腺冻存中采用程序降温法,分别选用了不同比例的二甲基亚砜、乙二醇、甲醇为冻存剂,比较性腺复苏后生殖干细胞的存活率确定10%二甲基亚砜为最适冻存剂,复苏后的光唇鱼卵原细胞和精原细胞存活率分别为(42.20±1.02)%和(28.22±2.14)%。(3)消化分离的生殖干细胞悬液经过PKH26荧光染料标记后,移入刚出膜2-3日的斑马鱼仔鱼腹腔内。移植后1-5日实验组仔鱼腹腔内可见明显荧光信号,移植后第1日荧光散布在整个腹腔,第3日荧光向背侧集中,第5日荧光聚集在腹腔后端背侧;对照组仔鱼1-5日腹腔中均无荧光信号,第7日则因色素细胞发育而出现自发荧光;移植组仔鱼第7日腹腔后端背侧也有荧光、但无法与自发荧光相区别。基于光唇鱼ND5线粒体基因特异序列设计引物,光唇鱼组织DNA利用引物扩增后构建质粒标准品,梯度稀释后经绝对荧光定量pcr绘出标准曲线。将移植后的斑马鱼DNA利用ND5基因特异性引物进行荧光定量pcr,通过Ct值计算拷贝数,移植后1日、3日、5日、7日的拷贝数平均值分别为:28355±99copies/100 ng,28372±104 copies/100 ng,23210±871 copies/100 ng,17494±582 copies/100 ng,第7日拷贝数显著减少、为第1日的61.7%。荧光观察和定量检测结果显示光唇鱼生殖干细胞被成功移入斑马鱼仔鱼腹腔。综上所述,本实验中通过各种条件优化后获得光唇鱼生殖干细胞提取和冻存的方法,利用生殖细胞移植技术,将光唇鱼生殖干细胞成功地移入斑马鱼仔鱼腹腔内,结果证明了光唇鱼生殖干细胞提取、冻存、移植的可行性,也为光唇鱼种质资源保护和全雌繁育研究奠定了基础。

关键词：光唇鱼生殖干细胞细胞冻存生殖细胞移植绝对荧光定量pcr

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中华小长臂虾微孢子虫的传播途径及检测技术研究

中华小长臂虾微孢子虫的传播途径及检测技术研究

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作者：刘京慧沈阳农业大学

学位级别：硕士

2020年在辽宁省盘锦市发现中华小长臂虾（Palaemonetes sinensis）感染微孢子虫Enterocytospora artemiae（EAM）,该微孢子虫呈卵圆形,大小为1.9×1.1μm,使虾体肝胰腺乳白化,背部花纹由棕色变为青绿色,死亡率虽低,但吸收宿主营养,... 详细信息

2020年在辽宁省盘锦市发现中华小长臂虾（Palaemonetes sinensis）感染微孢子虫Enterocytospora artemiae（EAM）,该微孢子虫呈卵圆形,大小为1.9×1.1μm,使虾体肝胰腺乳白化,背部花纹由棕色变为青绿色,死亡率虽低,但吸收宿主营养,导致新陈代谢减慢,增加稻田养殖成本,损失较大。而中华小长臂虾微孢子虫的传播途径尚不明确,传播机制中仍有问题尚未得到证明,由于它属于胞内寄生,没有特效药物可以进行防控,所以明确中华小长臂虾微孢子虫的传播途径将有利于有效预防。目前EAM的分子检测技术都是用常规pcr通用引物扩增,特异性、灵敏度有限制,易扩出其他种类的微孢子虫,对虾苗早期感染的检测效果也不佳,依赖于热循环仪,只能对该种病原进行定性检测,无法进行定量研究,且不易携带到实际养殖场进行现场检测,因此急需建立快速且特异可以进行定量、适合感染早期检测和适用于实际养殖现场可恒温检测的技术。根据EAM在中华小长臂虾中人工感染过程,进一步了解EAM在实际养殖塘中传播途径的特点结合建立EAM的绝对荧光定量pcr（quantitative real-time pcr,q pcr）和重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）检测方法,制定适合的防控措施,为中华小长臂虾养殖业提供有效防控理论依据。研究水平传播途径进行含有EAM水体浸泡、投喂感染EAM病虾的组织和健康虾、患病虾混合饲养三种人工感染试验,在不同的时间点（第7天、10天、15天和21天）采集试验样本,并使用pcr、Masson染色、荧光增白剂28染色和phloxin B染色确认EAM水平传播结果。垂直传播途径研究将试验亲虾浸泡于EAM-水体并投喂患EAM的组织,采集发育成熟的卵巢和不同发育阶段的胚胎样本进行pcr检测、使用体视显微镜观察胚胎发育特征并进行胚胎发育分期、对糠虾期胚胎组织病理切片进行糖原染色和革兰氏染色、使用q pcr检测亲虾性腺中携带EAM虫体量确认EAM垂直传播结果。基于腺苷酸激酶基因（adenylate kinas）和S8丝氨酸蛋白（S8 serine protein）基因,设计特异性引物,构建重组质粒,从灵敏度、特异性、实际样品检测率、EAM在中华小长臂虾体内组织分布、部分环境生物样品检测等方面进行研究,建立绝对荧光定量pcr和重组酶聚合酶-胶体金型（RPA-LFD）、重组酶聚合酶-凝胶电泳型（RPA-AGE）检测技术。水平传播人工感染试验中EAM水体侵染和投喂感染组织在第7天pcr结果呈阳性,与受感染的虾混合饲养第10天呈阳性,且三组均有较高感染率,病理切片表明组织胞质中存在大量孢子。垂直传播试验表明感染EAM亲虾卵巢检测呈阳性,不同阶段的胚胎也均携带EAM,糠虾期胚胎组织切片中呈现明显的阳性。绝对荧光定量pcr最低检测限为7.7×10～0copies/μL,扩增效率为104.278%,R2=0.999,且具有较好的特异性和重复性。RPA-AGE和RPA-LFD方法检测EAM的最低浓度为4.7×10～0copies/μL,可进行恒温扩增,反应时间仅需要30 min和10 min,灵敏均高于常规pcr。本研究明确了EAM在中华小长臂虾中存在水平传播和垂直传播途径。建立了可定量的绝对荧光定量pcr以及可恒温扩增适用于现场应用的RPA检测技术。

关键词：中华小长臂虾微孢子虫中华小长臂虾传播途径绝对荧光定量pcr 重组酶聚合酶扩增

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梭梭内参基因的克隆与筛选

梭梭内参基因的克隆与筛选

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作者：杜辉辉新疆农业大学

学位级别：硕士

梭梭(Haloxylon ammodendron)是一种在沙地中生长的防风固沙植物,具有非常强的抗逆特性。目前人们对梭梭的研究已逐渐从其生态学与生物学方面转向分子水平,但是对于其分子水平的研究还比较落后。要研究梭梭的生长发育和抗逆分子调控机制... 详细信息

梭梭(Haloxylon ammodendron)是一种在沙地中生长的防风固沙植物,具有非常强的抗逆特性。目前人们对梭梭的研究已逐渐从其生态学与生物学方面转向分子水平,但是对于其分子水平的研究还比较落后。要研究梭梭的生长发育和抗逆分子调控机制,就必须要有相应条件下表达稳定的内参基因作为参照,因此研究不同内参基因在不同条件下的表达稳定性,从而针对不同逆境条件筛选合适的内参基因,同时建立优化的实时定量表达体系,对研究梭梭的逆境分子机制具有重要的理论和现实意义。本研究根据梭梭转录组测序结果分析所得内参基因的部分序列设计荧光定量pcr引物,利用半定量及荧光定量pcr分析了梭梭不同组织及不同逆境胁迫下的内参基因的表达情况。具体的研究如下:(1)根据梭梭的转录组测序结果,分析了多条内参基因,最终筛选出了其中的8条内参基因作为研究对象,并根据拼接得到的核酸序列设计引物克隆内参基因序列。将所克隆的梭梭各内参基因与其他植物对应的内参基因进行同源性比对,发现它们与其它植物对应的内参基因的相似性均在80%以上,说明所选取的梭梭这8条内参基因具有高度的保守性,符合对内参基因选取的基本要求。并在此研究基础上,获得了Ha ACT1和Ha ACT2全长c DNA和基因组DNA序列。本研究作为梭梭内参基因的基础性研究,为后续实验提供了比较准确的数据信息,同时也为梭梭中其他内参基因的全长c DNA序列和基因组DNA序列的获得奠定了基础。(2)对选取的梭梭8个内参基因设计荧光定量pcr引物,以不同基因的质粒标准品为模板,按10倍系列稀释为8个浓度梯度,建立了实时荧光定量pcr反应最优化体系。以实验所得的各质粒稀释品的Ct值为纵坐标、以不同质粒浓度拷贝数的对数为横坐标绘制标准曲线。结果表明,梭梭各内参基因的标准曲线较为理想,线性关系较好,可用于后续实验数据的分析。(3)对梭梭内参基因在不同组织中的表达量进行半定量pcr分析。结果表明,这8个内参基因在梭梭同化枝、花、根、种子中均能够表达。对各种非生物胁迫下的梭梭各内参基因进行绝对荧光定量pcr实验,并运用生物统计学软件ge Norm、Best Keeper、Norm Finder综合分析了不同逆境胁迫下内参基因表达稳定性。结果表明,干旱胁迫、高温胁迫、高盐胁迫、低温胁迫及伤害胁下,梭梭最适内参基因分别为:Ha18Sr RNA、Ha TUA5及Ha UBQ10;Ha18Sr RNA和Ha GAPDH;Ha ACT7和Ha UBQ10;Ha ACT1和Ha TUA5;Ha TUA5和Ha GAPDH。

关键词：梭梭内参基因逆境胁迫克隆绝对荧光定量pcr 稳定性表达

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PRRSV四种受体在莱芜黑猪主要组织中的相对表达量检测

PRRSV四种受体在莱芜黑猪主要组织中的相对表达量检测

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作者：王辉山东农业大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus, PRRSV）引起的，以母猪繁殖障碍（流产、死产、弱胎、木乃伊胎）以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为主要特征的一种新型传染病。该病1987年首次在美国发生，1990年首次在荷兰从肺泡巨噬细胞中分离到病原，之后在德国、西班牙、英国、法国、丹麦等国家也先后报道发生该病。1996年郭宝清等人用间接免疫荧光法首次证实本病在国内存在。PRSSV有2个血清型，美洲型和欧洲型，我国爆发的主要以美洲型为主。为了检测地方品种猪对PRRSV的耐受性及病毒在体内的增殖规律，15头经RT-pcr检测为PRRSV抗原阴性和ELISA检测为PRRSV抗体阴性的30日龄健康莱芜黑猪仔猪，随机分为2组，攻毒组10头，对照组5头，分别人工鼻腔接种1mL/头（104TCID50/mL）PRRSV液和PBS。分别于感染后观察攻毒猪的临床症状，并于第3d、7d、14d、21d、28d剖杀对照组1头、攻毒组2头试验猪，观察攻毒猪病理变化，采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、扁桃体、下颌淋巴结、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结并立即放入液氮中，-80℃保存。为检测PRRSV在莱芜黑猪体内的增殖规律，本研究合成了TaqMan探针，并建立了检测PRRSV的绝对定量pcr方法，得到标准曲线方程为y=-3.1843x+39.241867，相关系数R2=0.99，该方法特异性和重复性好，灵敏度高，最低可检测到10拷贝数的病毒，比普通pcr方法高10倍～100倍。应用建立的荧光定量RT-pcr方法对各组织中病毒进行定量。结果表明，对照组莱芜黑猪PRRSV呈阴性，感染组PRRSV均呈阳性。PRRSV攻毒后第3d感染组猪的各组织中均检测到低拷贝病毒核酸存在，攻毒后7～21d，各种组织中的病毒载量维持在较高水平，而攻毒后第28d时，多数组织中的PRRSV病毒含量明显下降。扁桃体及各种淋巴结中的病毒载量要明显高于其他脏器，显示PRRSV在感染莱芜黑猪后对淋巴组织具有组织嗜性。建立检测PRRSV的四种受体（包括五号受体、唾液酸黏附素受体、CD163受体和波形蛋白受体）的相对荧光定量RT-pcr方法。应用建立的荧光定量RT-pcr方法检测攻毒后3d、7d、14d、21d、28d莱芜黑猪各组织中PRRSV的上述四种受体相对表达量变化情况。结果发现：攻毒后不同时间PRRSV四种受体在不同组织中的相对表达量出现不同变化。其中，攻毒后14dPRRSV的四种受体在脾脏中相对表达量都呈增加变化，而在扁桃体中四种受体表达量都呈减少变化。研究结果表明PRRSV感染莱芜黑猪后，体内各组织中PRRSV四种病毒受体相对表达量呈现不同的变化趋势，无明显规律。推测这种结果是实验动物数量所限造成的。

关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合症绝对荧光定量pcr 相对荧光定量pcr 病毒载量

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雌雄香鱼DNA序列差异、遗传性别检测方法及初步验证

雌雄香鱼DNA序列差异、遗传性别检测方法及初步验证

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作者：杜静雅宁波大学

学位级别：硕士

香鱼（Plecoglossusaltivelis）是我国养殖的名贵鱼类，具有较高的经济价值。养殖雌性香鱼不仅生长速度快、销售期长，而且怀卵香鱼的市场价格更高，因此生产全雌苗种具有重要的社会经济意义，而诱导性逆转并鉴定出功能性雄鱼是生产全... 详细信息

香鱼（Plecoglossusaltivelis）是我国养殖的名贵鱼类，具有较高的经济价值。养殖雌性香鱼不仅生长速度快、销售期长，而且怀卵香鱼的市场价格更高，因此生产全雌苗种具有重要的社会经济意义，而诱导性逆转并鉴定出功能性雄鱼是生产全雌苗种关键。本研究以实验室已获得的香鱼雄性特异性AFLP分子标记为基础，通过染色体步移扩增香鱼的性别差异序列，对性别差异序列进行分析并建立可快捷、简便的鉴定香鱼遗传性别的检测方法，验证了甲基睾酮（MT）浸泡能否诱导香鱼性逆转并通过分子标记鉴定了功能性雄鱼。研究结果如下：　　（1）以本实验室获取的香鱼雄性特异性AFLP分子标记序列（长度为139bp）为基础，对雄性香鱼基因组DNA进行染色体步移扩增，经测序、拼接获得长度为3442bp的序列。根据步移序列设计pcr引物在雌、雄各2尾香鱼中进行验证扩增，4尾鱼中均扩增到长度为2783bp的序列（两尾雄鱼的序列完全一致，两尾雌鱼分别仅有5个和4个碱基与雄鱼不同），但2尾雌鱼的扩增条带明显弱于雄鱼。BLASTN检索显示该序列中未发现功能基因，前端（21-1058bp）和后端（2608-3021bp）分别在白鲑Coregonussp.‘blachen’和鲤鱼Cyprinuscarpio基因组的多条染色体上存在相似序列、且在一条染色体上存在多个拷贝，中间部分（1059-2607bp）为未知序列。　　（2）构建了的香鱼性别差异序列和内参β-actin序列质粒标准品，通过绝对荧光定量pcr技术检测该段序列在雌、雄香鱼基因组中拷贝数的差异。根据梯度稀释后的质粒标准品荧光定量Ct值绘制标准曲线，香鱼性别差异序列的线性方程为：y=39.323-3.5618x，R2=0.9937;β-actin序列的线性方程为：y=38.228-3.3804x，R2=0.9987。以10尾香鱼（雌、雄各5尾）的基因组DNA为模板进行绝对荧光定量pcr检测，结果表明：β-actin序列在雄鱼和雌鱼中的拷贝数分别为149057-277046copies/50ngDNA和146042-230504copies/50ngDNA，平均拷贝数分别为218870copies/50ngDNA和199952copies/50ngDNA;性别差异序列在雄鱼和雌鱼中的拷贝数分别为45269-106265copies/50ngDNA和31-677copies/50ngDNA，平均拷贝数分别为67390copies/50ngDNA和357copies/50ngDNA。β-actin序列在两性中的拷贝数基本相同（雄:雌=1.09:1），性别差异序列则是雄鱼中的拷贝数远多于雌鱼（雄:雌=188.77:1）。　　（3）基于性别差异序列在雌、雄香鱼基因组中的拷贝数存在明显差异，构建了可同时扩增性别差异序列和内参β-actin序列的双重pcr体系，以实现香鱼遗传性别的便捷鉴定。为探寻最佳扩增条件，设置不同循环次数（分别为15次、20次、25次、30次、35次、40次）的比较，对pcr产物的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测显示：循环25次为最佳条件，此条件下遗传性别为雄性的个体可扩增出清晰的2条带（446bp的内参β-actin条带和262bp的性别差异序列条带），而遗传性别为雌性的个体仅出现1条446bp的内参β-actin条带;当循环数大于25次时，雌鱼中也会扩增出2条带、且性别差异序列条带亮度随循环次数的增多而增加;当循环数低于25次时，雄鱼个体可扩增出2条亮度较弱的条带（446bp的内参β-actin条带和262bp的性别差异序列条带），而雌鱼个体仅出现1条亮度较弱的446bp的内参β-actin条带。　　（4）为探索诱导香鱼性逆转的可能性、为今后开展全雌群体繁育奠定基础，对30日龄香鱼幼鱼进行MT浸泡处理（终浓度0.2μg/L，每天浸泡2h、连续浸泡40d）。结果显示：MT浸泡对香鱼生长无明显影响;9月龄时对照组香鱼性腺均发育良好，经性腺石蜡切片观察和双重pcr鉴定，所有个体的性腺性别均与遗传性别相符，雌、雄比例为0.68:1。MT处理组中遗传性别为雄性的个体性腺均为精巢且发育良好;遗传性别为雌性的21尾鱼中鉴定到1尾性腺为精巢的功能性雄鱼，另有5尾鱼性腺为卵巢、但卵母细胞呈明显的空泡化，其余15尾尚未发育出肉眼可见的性腺。验证结果表明MT浸泡幼鱼可诱导雌性香鱼性逆转，并可通过检测性别差异序列鉴定出功能性雄鱼。　　综上所述，本研究通过染色体步移技术从香鱼基因组中扩增得到一段性别差异序列，利用实时荧光定量pcr技术证明该序列在雄性基因组中的拷贝数明显高于雌性，建立了可同时扩增性别差异序列和内参β-actin序列的双重pcr体系用于简便、快速鉴定香鱼的遗传性别，证明了MT浸泡幼鱼诱导香鱼性逆转并通过检测性别差异序列鉴定出功能

关键词：香鱼性别差异序列染色体步移绝对荧光定量pcr 双重pcr

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圆圈病毒3型对鸡和小鼠致病性研究

圆圈病毒3型对鸡和小鼠致病性研究

引用

中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十五次学术交流会、中国病理生理学会动物病理学专业委员会第二十四次学术研讨会、中国实验动物学会实验病理学专业委员会第四次学术研讨会、中国兽医病理学家第四次研讨会

作者：袁世玉李根严天行郑高颖薛靖雯成子强山东农业大学动物科技学院分子病理实验室

(目的)圆圈病毒3型(Gyrovirus 3,Gy V3)首次从儿童腹泻粪便物中检到并从鸡体中分离鉴定,其对禽类及哺乳动物的感染性和致病性尚不清楚。(方法)为明确Gy V3的致病性及发病规律,将腺胃原代细胞培养的Gy V3通过腹腔注射接种鸡及小鼠,经大... 详细信息

(目的)圆圈病毒3型(Gyrovirus 3,Gy V3)首次从儿童腹泻粪便物中检到并从鸡体中分离鉴定,其对禽类及哺乳动物的感染性和致病性尚不清楚。(方法)为明确Gy V3的致病性及发病规律,将腺胃原代细胞培养的Gy V3通过腹腔注射接种鸡及小鼠,经大体剖检、血液学和病理组织学观察病变情况,并通过绝对荧光定量pcr检测病毒在鸡体内的动态分布过程。(结果)动物回归实验结果显示:接毒鸡感染率为95%;接毒鸡表现消瘦、腺胃肿大、腺胃乳头肿胀等典型的传染性腺胃炎症状,此外还能引起鸡的贫血和免疫抑制症状;绝对荧光定量pcr结果显示病毒含量最高的组织为肾上腺和骨髓;接毒小鼠表现为贫血及肠炎症状。(结论)本研究明确了Gy V3在鸡体内靶器官为肾上腺和骨髓,证实Gy V3为人畜共患病原,为Gy V3的免疫防控及公共卫生提供理论依据。

关键词：鸡传染性腺胃炎 GyV3 致病性绝对荧光定量pcr

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