检索结果-内蒙古大学图书馆

林业科学研究 2018年第5期31卷 57-63页

作者：李娜李恩杰王青华王玉珠张永安段立清内蒙古农业大学林学院内蒙古呼和浩特010019 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所北京100091

[目的]根据Ikdea对Hycu NPV全基因组序列的分析,筛选出功能还未被研究的、保守性高的ORF72基因。[方法]将ORF72基因构建到原核表达载体p GEX-4T-1上,对其进行诱导表达,优化表达的条件,并通过GST亲和层析色谱柱纯化融合蛋白。[结果]重组... 详细信息

[目的]根据Ikdea对Hycu NPV全基因组序列的分析,筛选出功能还未被研究的、保守性高的ORF72基因。[方法]将ORF72基因构建到原核表达载体p GEX-4T-1上,对其进行诱导表达,优化表达的条件,并通过GST亲和层析色谱柱纯化融合蛋白。[结果]重组质粒p GEX-4T-1-ORF72的酶切检测以及测序结果均正确,证明重组质粒载体构建成功。通过SDS-PAGE凝胶电泳显示,ORF72蛋白能够与p GEX-4T-1载体上的GST标签蛋白进行融合表达,诱导表达后的融合蛋白大小约为38. 2 k Da。优化后的表达条件为:异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导浓度为1. 0 mmol·L-1,最佳诱导温度为25℃,最佳诱导时间为4 h,并且该蛋白在大肠杆菌BL21和Rosetta表达菌株中均能很好的表达,但在Rosetta菌株中表达量更高。[结论]成功构建了p GEX-4T-1-ORF72原核表达载体,确定出ORF72融合蛋白最佳诱导表达条件,诱导表达并纯化出ORF72融合蛋白,为进一步研究其生物功能奠定基础。

关键词：美国白蛾核型多角体病毒 ORF72 载体构建诱导表达纯化

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美国白蛾核型多角体病毒超氧化物歧化酶基因的序列分析和表达

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微生物学报 2001年第2期41卷 173-180页

作者：曹广力薛仁宇朱越雄魏育红贡成良苏州大学基因工程实验室苏州215151

根据测序结果 ,HcNPVsod的核苷酸序列与BmNPVsod的完全一致 ,与AcNPVsod的核苷酸序列相比 ,同源性达到 97 2 % ;推测HcNPVsod编码 1 51个氨基酸 ,与BmNPVsod的完全一致 ,与AcNPVsod编码的氨基酸相比 ,有三个氨基酸的差别。按基酸序列分... 详细信息

根据测序结果 ,HcNPVsod的核苷酸序列与BmNPVsod的完全一致 ,与AcNPVsod的核苷酸序列相比 ,同源性达到 97 2 % ;推测HcNPVsod编码 1 51个氨基酸 ,与BmNPVsod的完全一致 ,与AcNPVsod编码的氨基酸相比 ,有三个氨基酸的差别。按基酸序列分析表明 ,HcNPVSOD蛋白中含有对SOD结构和活性必需的氨基酸残基 ,在HcNPVsod中均是保守的。SOD活性测定表明酶活为 1 47 0

关键词：美国白蛾核型多角体病毒超氧化物歧化酶表达进化分析

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美国白蛾核型多角体病毒p35基因的克隆及序列分析

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昆虫学报 2002年第6期45卷 711-716页

作者：曹广力薛仁宇朱越雄魏育红贡成良苏州大学生命科学学院苏州215006

对美国白蛾核型多角体病毒 (HycuNPV ,Hyphantriacuneanucleopolyhedrovirus)p35基因的序列分析表明 :HycuNPVp35编码序列 90 0bp ,编码 2 99氨基酸。同源性分析表明 :HycuNPVp35与BomoNPVT3、AucaNPV、SpliNPV、LeseNPV、HearNPV在核苷酸水平上为 99 9%、 95 7%、 93 6 %、 80 2 %和 87 2 % ,在氨基酸水平上为 99 7%、 90 3%、 77%、 6 4 9%和 73 2 % ,显示了杆状病毒p35基因在进化上的保守性。BomoNPVT3中位的H1 2 2 ,在HycuNPV中被R取代。推测HycuNPVp35蛋白的功能及抑制细胞凋亡的能力与BomoNPVT3p35蛋白的相似。

关键词：美国白蛾核型多角体病毒 p35基因克隆序列分析

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美国白蛾核型多角体病毒几丁质酶基因核苷酸序列研究

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病毒学报 1999年第3期15卷 260-269页

作者：贡成良小林淳宫岛成寿金伟吴祥甫苏州大学生物技术学院苏州215151 日本三重大学分子素材工学科浙江大学蚕学系杭州310029 中国科学院上海生物化学研究所上海200031

美国白蛾核型多角体病毒（ＨｃＮＰＶ）编码的几丁质酶Ａ（ＣｈｉｔｉｎａｓｅＡ，ＣｈｉＡ）基因定位在Ｈｉｎｄ Ⅲ－３５ｋｂ片段上。ＤＮＡ测序表明，半胱氨酸蛋白酶（ＣＰ）基因的５＇上游反向存在Ｃ... 详细信息

美国白蛾核型多角体病毒（ＨｃＮＰＶ）编码的几丁质酶Ａ（ＣｈｉｔｉｎａｓｅＡ，ＣｈｉＡ）基因定位在Ｈｉｎｄ Ⅲ－３５ｋｂ片段上。ＤＮＡ测序表明，半胱氨酸蛋白酶（ＣＰ）基因的５＇上游反向存在ＣｈｉＡ基因，ＣｈｉＡ基因的ＯＲＦ为１６６２个核苷酸，编码５５３个氨基酸，５＇、３＇非编码区分别具有ＴＡＡＧ基序和ＡＡＴＡＡＡｐｏｌｙ（Ａ＋）信号序列。同源性分析表明，ＨｃＮＰＶ的ＣｈｉＡ与苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒、家蚕核型多角体病毒的ＣｈｉＡ，在ＤＮＡ水平上的同源性分别为７５３％、７５７％，在氨基酸水平上的同源性分别为７５０％、７８７％，与来自灵菌的ＣｈｉＡ比较，一致性氨基酸达５１％，推测杆状病毒几丁质酶基因与细菌几丁质酶基因可能具有共同的祖先。

关键词：美国白蛾核型多角体病毒几丁质酶核苷酸序列

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美国白蛾核型多角体病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

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昆虫学报 2010年第7期53卷 824-830页

作者：乔鲁芹曲良建王玉珠张永安杨忠岐陶万强关玲山东农业大学植物保护学院山东泰安271018 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所北京100091 北京市林业保护站北京100029

为了建立对昆虫核型多角体病毒(nucleopolyhedrovirus)进行定量检测方法,本研究选用美国白蛾Hyphantria cunea核型多角体病毒的polyhedrin基因为目的基因,经引物设计、PCR扩增、目的片段与载体连接转化以及重组质粒的鉴定,并对重组质粒... 详细信息

为了建立对昆虫核型多角体病毒(nucleopolyhedrovirus)进行定量检测方法,本研究选用美国白蛾Hyphantria cunea核型多角体病毒的polyhedrin基因为目的基因,经引物设计、PCR扩增、目的片段与载体连接转化以及重组质粒的鉴定,并对重组质粒标准品和样品DNA进行检测,构建出美国白蛾核型多角体病毒SYBR GreenⅠ荧光定量标准曲线。统计学分析显示标准品浓度的对数值与Ct值之间存在良好的线性关系(R=0.998)。该方法的检测灵敏度为101～102拷贝/μL,线性范围达5个数量级,扩增产物形成单一的特异性熔解峰,组内组间的变异系数均小于3%。根据已建立的方法对不同感染时间段的感病幼虫进行检测,每毫克幼虫样本内病毒polyhedrin基因拷贝数增殖倍数对数值与感染时间(d)呈正相关(R=0.987)。这些结果表明,建立的美国白蛾核型多角体病毒荧光定量PCR检测方法是可靠的,具有灵敏度高、重复性好等特点,可为昆虫核型多角体病毒体内增殖动态研究及昆虫病毒的标准化生产提供参考。

关键词：美国白蛾核型多角体病毒 SYBR GreenⅠ 荧光定量PCR 感病幼虫检测

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美国白蛾核型多角体病毒传播途径及对寄主的持续作用

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林业科学 2009年第6期45卷 83-86页

作者：段彦丽曲良建王玉珠张永安陶万强关玲杨忠岐中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所国家林业局森林保护学重点实验室北京100091 北京市林业保护站北京100029

用不同浓度的美国白蛾核型多角体病毒亚致死剂量感染美国白蛾4龄和5龄幼虫,并分别收集不同处理的残余带毒试虫进行室内传代饲养。结果表明:病毒对寄主昆虫不仅具有直接致死作用,而且对蛹重和雌虫产卵量均有明显影响,尤其是对亲代、子一... 详细信息

用不同浓度的美国白蛾核型多角体病毒亚致死剂量感染美国白蛾4龄和5龄幼虫,并分别收集不同处理的残余带毒试虫进行室内传代饲养。结果表明:病毒对寄主昆虫不仅具有直接致死作用,而且对蛹重和雌虫产卵量均有明显影响,尤其是对亲代、子一代和子二代寄主昆虫。对病毒传播途径的研究证实HcNPV可通过多种途径传播到寄主种群中。

关键词：持续作用美国白蛾核型多角体病毒传播途径

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美国白蛾核型多角体病毒中国分离株的基因组结构与遗传多样性研究

美国白蛾核型多角体病毒中国分离株的基因组结构与遗传多样性研究

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作者：彭小伟中国科学院大学

学位级别：博士

美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantriacuneanucleopolyhedrovirus，HycuNPV)作为一种安全的生物杀虫剂，在我国美国白蛾（HyphantriacuneaDrury）生物防治过程中被广泛使用。本研究利用高通量测序技术，对两个中国分离株(HycuNPV-HB与Hycu... 详细信息

美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantriacuneanucleopolyhedrovirus，HycuNPV)作为一种安全的生物杀虫剂，在我国美国白蛾（HyphantriacuneaDrury）生物防治过程中被广泛使用。本研究利用高通量测序技术，对两个中国分离株(HycuNPV-HB与HycuNPV-BJ)进行基因组测序，获得2条完整的基因组序列，通过与日本分离株HycuNPV-N9比较，分析了HycuNPV基因组水平上的遗传多样性特点及其系统进化史。　　我们分析了两株HycuNPV中国分离株的基因组遗传学特征，通过比较不同HycuNPV基因组中ORF的顺序及组成，发现中国株和日本株之间具有显著的遗传学差异，包括基因插入、缺失、结构突变及广泛存在的SNP。我们分析了HycuNPV全基因组水平上的遗传多样性，在HycuNPV中国种群内部，共检测到10393个SNP，约占HycuNPV-N9参考基因组总长度的8％。通过分析非同义突变的核苷酸，我们发现高频突变基因主要是ie2、ep32、me53、hycu36、desmop、etm和hycu121等，它们的NSSP值都超过40×10-3NSS/bp，并且大多属于功能未知基因。各功能分组的基因遗传多样性无显著区别，并且高频突变基因的分布与功能分组也没有显著的相关性;除未知功能组外，各功能组的NSSP平均值都低于整个基因组上的NSSP平均值（23.28×10-3NSS/bp）。在复制、转录及结构功能分组中，非核心基因的NSSP值显著高于核心基因，并且早期基因（例如:p15，ie2，pe38）比晚期基因具有更高的遗传多样性。此外，我们通过选择压力分析，筛选到一个正向选择基因hycu78。基于R脚本的LC50的比较分析，显示HycuNPV-HB株的感染性与杀虫速度均优于HycuNPV-BJ株，基因组遗传学比较表明两者毒力差异主要受到SNP及结构差异，尤其是hrs区的影响。基于38个杆状病毒核心基因的HycuNPV的系统发育分析及K2P距离分析表明，两个HycuNPV中国分离株同属可以感染美国白蛾的一个杆状病毒新种，而与HycuNPV日本株不是一个种。我们推断HycuNPV-HB株与HycuNPV-BJ株基因组上遗传物质的获得与丢失，增强了病毒对中国地区的美国白蛾种群的适应力。　　在开发新的杀虫剂和监测昆虫的抗药性种群时，通常要比较不同杀虫剂对某个种群或一种杀虫剂对不同种群的相对活性，可以用多种软件来计算和比较致死剂量（LD50），但是这些软件的结论只局限于药物剂量-反应死亡率回归线斜率相等的条件下成立。我们利用R语言中的glm函数，在回归线斜率不相等的条件下实现了计算和比较不同期望死亡率的致死剂量。当使用logit模型拟合生物测定数据时，当纳入异质性因子h时，使用Fieller定理计算出的致死剂量的95％置信限(95％CLs)，与使用PoloPlus软件的计算结果相同;而使用delta法给出的95％置信限与使用R的drc包算出的95％的置信限相同。当使用probit模型拟合相同的生测数据时，利用该R脚本的计算结果与PoloPlus和drc软件包计算的95％置信限接近。在本研究中，我们使用效价比和z检验来比较两个致死剂量之间的差异。当使用x2和LR检验来确定回归线是否平行时，计算结果均与PoloPlus和drc包相同。　　本研究扩展了我们对HycuNPV基因组遗传多样性的认识，并有助于开发有效的美国白蛾生物杀虫剂。

关键词：杆状病毒美国白蛾核型多角体病毒遗传多样性 LD50 杀虫剂

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美国白蛾核型多角体病毒检测方法的建立及ORF72基因的研究

美国白蛾核型多角体病毒检测方法的建立及ORF72基因的研究

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作者：李娜内蒙古农业大学

学位级别：硕士

美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantria cunea Nuclear Polyhedrosis Virus,HycuNPV)作为一种强效、无危害、专化性强和环境友好型的生防致病因子,在美国白蛾种群的持续防控中占据重要地位。本论文通过高效、快速的HycuNPV定量检测方法和OR... 详细信息

美国白蛾核型多角体病毒(Hyphantria cunea Nuclear Polyhedrosis Virus,HycuNPV)作为一种强效、无危害、专化性强和环境友好型的生防致病因子,在美国白蛾种群的持续防控中占据重要地位。本论文通过高效、快速的HycuNPV定量检测方法和ORF72基因的研究,为该病毒的持续控制提供了可行的监测方法,同时弥补了其在ORF72基因功能研究上的空白。论文研究结果如下:1.利用TaqMan探针法成功建立了实时荧光定量PCR对HycuNPV含量进行检测的方法。首先,将polh基因构建到pGEM-T-easy载体上,制备标准品质粒。然后,将标准品质粒10倍梯度稀释为1.0×10～8、1.0×10～7、1.0×10～6、1.0×10～5、1.0×10～4和1.0×10～3copies/μL 6个梯度浓度,以此为模版进行荧光定量PCR,建立标准品的扩增曲线和标准曲线。最后,通过得到的标准曲线计算出幼虫在接毒后的不同时间点其体内所含的病毒拷贝数。验证方法:以取食3.0×10～6PIB/mL浓度病毒的美国白蛾幼虫基因组DNA为模版,进行荧光定量PCR后发现,病毒在幼虫体内的含量在第5d开始呈大幅增长趋势,第6d时达到最高。***72基因的研究。将克隆的ORF72基因构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,对其进行诱导表达,优化表达的条件,并通过GST亲和层析色谱柱纯化融合蛋白。通过SDS-PAGE凝胶电泳显示,ORF72蛋白能够与pGEX-4T-1载体上的GST标签蛋白进行融合表达,诱导表达后的融合蛋白大小约为38.2kDa。优化后的表达条件为:异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的最佳诱导浓度为1.0mmol/L,最佳诱导温度为25℃,最佳诱导时间为4h,并且该蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21和Rosetta表达菌株中均能得到很好的表达,但在Rosetta菌株中诱导的蛋白表达量更高。诱导表达并纯化出ORF72融合蛋白,为后续生物功能的研究奠定基础。

关键词：美国白蛾核型多角体病毒 TaqMan探针荧光定量PCR ORF72 诱导表达

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美国白蛾核型多角体病毒的稳定性研究

美国白蛾核型多角体病毒的稳定性研究

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作者：殷灿山东农业大学

学位级别：硕士

本文采用生物测定的方法,研究了温度、紫外辐射、pH值、日光照射和保存时间对美国白蛾核型多角体病毒(HcNPV)稳定性的影响,HcNPV的稳定性主要由感染美国白蛾幼虫的死亡率及致死中时间的变化来评价,主要结果如下：1、水浴55℃处理美国白... 详细信息

本文采用生物测定的方法,研究了温度、紫外辐射、pH值、日光照射和保存时间对美国白蛾核型多角体病毒(HcNPV)稳定性的影响,HcNPV的稳定性主要由感染美国白蛾幼虫的死亡率及致死中时间的变化来评价,主要结果如下： 1、水浴55℃处理美国白蛾核型多角体病毒水剂,灭活时间—死亡率的回归方程为：y=83.44-0.31x(p<0.01),相应的,处理的HcNPV感染美国白蛾的LT50也由12.18d到15.81d逐渐增长。处理90min,HcNPV活性仍有50%以上。 HcNPV干粉比HcNPV水剂对温度的耐受性更强,处理时间同为15min,水浴处理的病毒水剂的温度—死亡率回归方程为：=104.16—0.93x(p<0.01),100℃处理后,病毒水剂的致病率仅为17.41%；烘箱处理的病毒干粉的温度—死亡率回归方程为：y=101.31—0.46x(p<0.01),120℃处理后,干粉病毒的致病率仍有53.91%。水浴55℃处理美国白蛾核型多角体病毒水剂150min和水浴80℃处理美国白蛾核型多角体病毒水剂15min,HcNPV活性仍然保有30%左右,因此,说明HcNPV水剂对一定时间的亚高温(40℃～60℃)和短时的高温(80℃以上)有一定的耐受性。 2、30W(波长为200nm～300m,最强处波长为253.7nm)的紫外灯在强度为213μw/cm2处对美国白蛾核型多角体病毒进行紫外线辐射,辐射时间—死亡率的回归方程为：y=102.46-0.41x(p<0.01)；在不同强度下,辐射30min,辐射强度-死亡率的回归方程为：y=110.70-0.06x(p<0.01).强度为213μw/cm2的紫外线辐射120min和强度为765μW/cm2的紫外线辐射30min,美国白蛾核型多角体病毒感染美国白蛾幼虫的死亡率仍然在55%以上,说明美国白蛾核型多角体病毒可以耐受较长时间的低强度紫外线和短时的高强度紫外线辐射。无论是紫外辐射时间不同还是紫外强度不同,紫外辐射对美国白蛾核型多角体病毒感染宿主整个过程的前期(3-6d)没有显著影响,对感染后期(7-12d)的影响较为显著,尤其是感染9d后的影响尤为显著。 3、美国白蛾核型多角体病毒在pH7的环境中,活性最强。升高或降低pH值,美国白蛾核型多角体病毒感染的美国白蛾幼虫的死亡率都会下降,但在pH6和pH8-12的条件下,其感病幼虫的死亡率没有显著性差异。随着pH的升高,HcNPV感染美国白蛾幼虫的LT50逐渐缩短。由于pHH10和pHH12的溶液体系非缓冲体系,溶液体系最终的pH都降低到7-8之间,而其他各溶液体系的pH变化不大。 4、美国白蛾核型多角体病毒在野外环境条件中具有一定的存活能力,自然暴露10d,其活性仍然有63.35%。晴朗高温的天气状况不利于HcNPV维持其稳定性。整体上,晴朗高温天气时的相对灭活率高于阴雨天气的,但在第一天的晴朗高温天气状况下暴露,HcNPV的相对灭活率最低。 5、不同方法储存的美国白蛾核型多角体病毒,其稳定性不同。保存7年的美国白蛾核型多角体病毒,冷冻储存的比冷藏的活性高；冷冻保存7年的、冷冻保存3年的和冷藏保存1年的美国白蛾核型多角体病毒活性与当年新复制提存的没有显著差异,因此,对于长期保存,冷冻保存相对于冷藏保存是能保持HcNPV活性的储存方法。保存5年的美国白蛾核型多角体病毒与其他各保存年限的HcNPV相比,LT50显著增长,对宿主的致病率显著降低,是由于保存过程中,曾提纯过部分该病毒,在此过程中出现了反复冻融,因此,反复冻融对美国白蛾核型多角体病毒活性的保持有一定影响。

关键词：美国白蛾核型多角体病毒稳定性温度紫外辐射 pH 日光照射储存时间

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3-溴丙酮酸对美国白蛾核型多角体病毒的增效作用

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林业科学研究 2022年第6期35卷 101-107页

作者：刘瑞霞李恩杰柏超王青华段立清中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所/国家林业和草原局森林保护学重点实验室北京100091 内蒙古农业大学林学院内蒙古呼和浩特010019 中国林业科学研究院华北林业实验中心北京102300 北京市新海园林工程有限公司北京100018

[目的]利用3-溴丙酮酸(3-BrPA)作为美国白蛾核型多角体病毒(HycuNPV)的生物增效剂,探讨3-BrPA对HycuNPV的毒力和对美国白蛾生长发育的影响,为进一步推进HycuNPV杀虫剂的应用提供新的增效剂。[方法]通过室内在HycuNPV中添加不同剂量3-Br... 详细信息

[目的]利用3-溴丙酮酸(3-BrPA)作为美国白蛾核型多角体病毒(HycuNPV)的生物增效剂,探讨3-BrPA对HycuNPV的毒力和对美国白蛾生长发育的影响,为进一步推进HycuNPV杀虫剂的应用提供新的增效剂。[方法]通过室内在HycuNPV中添加不同剂量3-BrPA,分析其对HycuNPV的增效作用以及对美国白蛾生长发育的影响。[结果]室内生物活性结果表明,3-BrPA对HycuNPV具有增效作用,不仅可以提高HycuNPV的感染能力,还能提高杀虫速度。当3-BrPA的添加剂量为5.0、10.0和15.0 mg·g^(−1)时,HycuNPV作用于美国白蛾3龄幼虫的LC_(50)都有不同程度地降低;并且对HycuNPV的增效倍数(S_(R))分别为825.14、164.72和0.47,共毒系数(CTC)分别为82613.63、16579.25和147.27。不同浓度的HycuNPV在不同剂量的3-BrPA作用下,其杀虫效果各不相同。添加不同剂量的3-BrPA,LT_(50)缩短了3.280~9.724 d。根据SR、CTC、LT_(50)及ST等指标评判,在浓度为9.0×10^(5)OBs·mL^(−1)的HycuNPV中添加5.0 mg·g^(−1)的3-BrPA时,增效作用最优。此外,3-BrPA和HycuNPV联合作用还显著抑制了幼虫的生长发育,且存活幼虫的化蛹率和羽化率均低于单独使用病毒杀虫剂。[结论]3-BrPA对HycuNPV具有增效作用,有望作为理想的病毒杀虫剂的增效剂。

关键词：美国白蛾核型多角体病毒 3-溴丙酮酸美国白蛾增效作用

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