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上海交通大学学报（医学版） 2013年第9期33卷 1215-1219,1254页

作者：赵海光上海交通大学医学院附属第九人民医院血管外科上海200011

目的观察Ras基因对人股动脉平滑肌细胞增殖过程中基因表达的影响。方法以显性激活RAS基因和显性失活RAS基因重组腺病毒(AdRasV12和AdRasN17)转染人股动脉平滑肌细胞,采用Affymetrix基因芯片检测转染细胞的基因表达变化。结果转染AdRasN1... 详细信息

目的观察Ras基因对人股动脉平滑肌细胞增殖过程中基因表达的影响。方法以显性激活RAS基因和显性失活RAS基因重组腺病毒(AdRasV12和AdRasN17)转染人股动脉平滑肌细胞,采用Affymetrix基因芯片检测转染细胞的基因表达变化。结果转染AdRasN17后,120个基因表达发生显著变化,其中43个基因表达上调,77个基因表达下调。转染AdRasV12后,231个基因被确定为差异表达,其中127个基因表达上调,104个基因表达下调。这些基因功能主要与细胞周期和凋亡、信号转导、代谢和对刺激应答有关。结论激活和失活突变的Ras可改变人股动脉平滑肌细胞的基因表达,这些基因可能与动脉粥样硬化和再狭窄等心血管疾病发展过程中的动脉平滑肌细胞异常增殖有关。

关键词：股动脉平滑肌细胞 RasN17 RasV12 细胞增殖微阵列

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线粒体异质性与缺氧性肺动脉高压

线粒体异质性与缺氧性肺动脉高压

引用

作者：周娟华中科技大学

学位级别：博士

肺动脉高压是严重危害人类身心健康的一种疾病，其发病仅次于高血压和冠心病，在心血管疾病中位居第三位。其特征是肺血管收缩和肺血管改建，并最终导致右心衰竭和死亡。引起肺动脉高压的原因很多，随着社会的发展，以缺氧和呼吸系统疾... 详细信息

肺动脉高压是严重危害人类身心健康的一种疾病，其发病仅次于高血压和冠心病，在心血管疾病中位居第三位。其特征是肺血管收缩和肺血管改建，并最终导致右心衰竭和死亡。引起肺动脉高压的原因很多，随着社会的发展，以缺氧和呼吸系统疾病所致的肺动脉高压发病率正逐年上升。缺氧引起的肺血管收缩是肺动脉高压和肺心病发生发展的重要环节。肺血管收缩与细胞内钙离子浓度密切相关。Vadula等发现，缺氧可引起肝细胞内线粒体源性活性氧产生增加1，从而使线粒体在HPV中的作用受到特别关注。大量研究已基本证实，HPV的核心机制主要是缺氧诱导线粒体产生活性氧，从而抑制肺血管平滑肌细胞膜上的电压门控性K+通道，使细胞膜去极化，细胞外钙内流，最终导致细胞收缩2。与缺氧性肺血管收缩反应不同的是，体循环血管在缺氧时表现为舒张，以此增加血流量，保证组织的供血和供氧。有研究表明，缺氧使得肺循环血管K+通道受抑制，血管收缩，而体循环血管K+电流增加，血管扩张3。在缺氧刺激下，肺动脉平滑肌能量产生和利用增加，股动脉平滑肌则迅速降低，从而使得肺动脉收缩而股动脉舒张，由此可见，肺、体循环动脉血管平滑肌在缺氧时的变化差异可能与能量有关。线粒体是细胞能量生成和氧化磷酸化的主要场所，不同的组织因为能量需求不同其线粒体也存在差异。其差异不仅仅表现在线粒体数目上4，而且也体现在形态5、结构6,7和功能8等诸多方面，即线粒体存在异质性。肺动脉平滑肌细胞中的线粒体和体循环动脉平滑肌细胞中的线粒体，无论是在功能还是形态上，都有差异，肺动脉平滑肌中的线粒体多呈现梭形或者椭圆形，基础呼吸率较高，而股动脉平滑肌中的线粒体则多为长条形，基础呼吸率较肺动脉平滑肌低9。线粒体源性的活性氧在HPV中发挥关键作用，促使人们越来越重视线粒体异质性在肺、体循环血管对缺氧反应差异中所起的作用，然而，要深入揭示其中的机制和意义有待新的技术路线和研究策略。通过预实验研究发现，离体分离的线粒体在相当程度上能够保持其在体内或者细胞内的功能和特征，而且能够融入到培养的细胞、离体血管以及活体肺循环血管平滑肌细胞中，在此基础之上，本研究将深入探讨线粒体差异对缺氧性肺血管收缩和肺动脉高压的影响，以期望为肺动脉高压机制研究和治疗提供可供探索的全新的途径。第一部分线粒体异质性对血管平滑肌细胞急性缺氧反应的影响目的探讨外源性线粒体向细胞内移植的动力学特征，并在此基础上观察，分别移植同源性和异源性线粒体对PASMC和FASMC缺氧反应的影响。方法用DsRed-mito和GFP-mito标记平滑肌细胞线粒体；利用梯度离心法从细胞中提取带荧光标记的线粒体并孵育细胞；用共聚焦荧光显微镜观察外源性线粒体在细胞被的分布情况，并分析外源性线粒体移植的动力学特征；用EB抑制内源性线粒体DNA合成；用Fura-2/AM探针检测细胞内钙离子变化；用JC-1检测细胞膜电位。结果 1.活细胞共聚焦成像技术观察，空白对照组PASMC没有任何荧光显示，而孵育了标记DsRed外源性线粒体的PASMC组，细胞内有红色荧光，表明外源性线粒体进入细胞内。通过二维荧光计数分析可知，外源性线粒体进入细胞的数量具有孵育浓度和时间依赖性。而通过共聚焦三维重构发现，进入细胞的外源性主要分布在靠近细胞膜的区域内。 2.对照组肺动脉平滑肌细胞缺氧时，胞浆内钙离子浓度增加，与添加Py+Ur（提供细胞所需的能量）的细胞反应一致；而添加Py+Ur+EB （EB耗竭细胞内线粒体DNA合成，同时Py和Ur为细胞提供能量）的细胞缺氧时，胞浆内钙离子浓度没有变化；移植入PASMC-mito可逆转线粒体DNA剔除的PASMC胞浆内钙反应消失；而移植入FASMC-mito却无此作用。缺氧诱导FASMC胞浆内钙离子浓度降低，添加Py+Ur不影响股动脉平滑肌细胞缺氧时钙离子降低；线粒体DNA剔除则使细胞在缺氧时不引起细胞胞浆内钙离子浓度降低，移植PASMC-mito后使线粒体DNA剔除的细胞在缺氧时产生明显的细胞内钙离子浓度升高；而移植FASMC-mito可恢复缺氧引起的细胞内钙离子浓度下降这一反应。PASMC和FASMC在不剔除自身内源性线粒体的条件下直接转入外源性线粒体，其对缺氧引起的钙反应的影响类似于以上实验结果。 3.移植了PASMC-mito的肺动脉平滑肌细胞在缺氧时，细胞膜去极化，反应与正常肺动脉平滑肌细胞一样，然而移植了FASMC-mito后细胞膜出现超极化。移植同源性细胞线粒体的FASMC在缺氧时，和正常股动脉平滑肌细胞一样，细胞膜均超极化；而移植来自异种细胞线粒体（PASMC-mito）后，缺氧会引起细胞膜稳定去极化。结论 1.外源性线粒体移植入细胞的数量具有时间和浓

关键词：线粒体钙信号肺动脉平滑肌细胞股动脉平滑肌细胞缺氧线粒体肺血管收缩肺血管重构肺动脉高压

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