检索结果-内蒙古大学图书馆

中国医药工业杂志 2020年第2期51卷 211-219页

作者：罗曼玉高阳朱建伟路慧丽上海交通大学药学院细胞工程及抗体药物教育部工程研究中心上海200240

抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗体可抑制新生血管的形成和生长,在年龄相关性黄斑变性眼科疾病的临床治疗中具有重要应用价值,特别是已上市的商品名为雷珠单抗的VEGF抗体Fab片段,在市场上取得巨大成功。本研究探索了雷珠单抗在大肠埃希... 详细信息

抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗体可抑制新生血管的形成和生长,在年龄相关性黄斑变性眼科疾病的临床治疗中具有重要应用价值,特别是已上市的商品名为雷珠单抗的VEGF抗体Fab片段,在市场上取得巨大成功。本研究探索了雷珠单抗在大肠埃希菌中的胞外分泌表达技术,所表达的产品利用SDS-PAGE、Western Blot、肽谱图全序列分析和纳米差示扫描量热法(Nano DSC)等手段进行了初步的结构表征。结果显示,本研究成功实现了雷珠单抗的大肠埃希菌胞外分泌表达,经过进一步的Capto L亲和色谱获得了有正确氨基酸序列的Fab产品,经质谱分析具有正确的二硫键配对,且具有与标准品相似的热稳定性,为其进一步的工业生产奠定了基础。

关键词：雷珠单抗大肠埃希菌胞外分泌表达差示扫描量热法肽谱图

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YebF作为载体蛋白所引导的重组蛋白胞外分泌表达途径的研究进展

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化学与生物工程 2017年第6期34卷 6-11页

作者：郑晓芳赵敏东北林业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150040

大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主菌之一,但是由于它大多将重组蛋白分泌到菌体内部,导致重组蛋白不能正确折叠或者被降解而失去活性,使得目的蛋白的提取和纯化过程较为繁琐。解决这些问题的方法之一就是将重组蛋白分泌到胞外培养基中... 详细信息

大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主菌之一,但是由于它大多将重组蛋白分泌到菌体内部,导致重组蛋白不能正确折叠或者被降解而失去活性,使得目的蛋白的提取和纯化过程较为繁琐。解决这些问题的方法之一就是将重组蛋白分泌到胞外培养基中,这样不仅有利于蛋白的正确折叠,也会极大地简化目的蛋白的提取和纯化过程。近年发现的YebF蛋白是由大肠杆菌分泌到胞外培养基中的可溶内源性短肽,大小为10.8kDa;虽然其功能未知,但是YebF可作为载体蛋白与重组蛋白融合从而引导异源蛋白的胞外分泌表达。综述了YebF蛋白的结构及其胞外分泌表达的机理,总结了应用YebF分泌途径成功胞外表达异源蛋白的例子,阐述了利用YebF胞外分泌途径提高目的蛋白表达量的策略,为更多重组蛋白的高效分泌表达提供了理论基础。

关键词： YebF蛋白载体蛋白重组蛋白胞外分泌表达高效分泌策略

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构建一类Fab片段在大肠杆菌中胞外分泌表达的生产平台

构建一类Fab片段在大肠杆菌中胞外分泌表达的生产平台

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中国生物工程学会第十二届学术年会暨2018年全国生物技术大会

作者：罗曼玉上海交通大学药学院抗体中心

Fab抗体片段是免疫球蛋白(IgG)上的抗原结合片段,通过木瓜蛋白酶等酶对IgG进行降解,可以得到Fab、F(ab`)2、Fc等片段产物。利用表达系统如大肠杆菌等生产的Fab片段作为小分子药物,可以与抗原特异性结合,并且由于缺少Fc段,不会发生聚集... 详细信息

Fab抗体片段是免疫球蛋白(IgG)上的抗原结合片段,通过木瓜蛋白酶等酶对IgG进行降解,可以得到Fab、F(ab`)2、Fc等片段产物。利用表达系统如大肠杆菌等生产的Fab片段作为小分子药物,可以与抗原特异性结合,并且由于缺少Fc段,不会发生聚集沉淀反应,并且Fab片段抗体药物具有免疫原性低,分子量小等优点。然而由于外源基因表达时通常会在大肠杆菌内形成不可溶的包涵体,给纯化带来难题,得到的蛋白活性也会有损失。所以如何获得可溶性的重组Fab,并且简化纯化操作一直是蛋白表达领域中的关注重点。本研究挑选了5类已上市的抗体类药物的Fab片段为研究对象,研究了重组Fab在大肠杆菌中进行可溶性分泌表达及纯化的策略,并对分离纯化后的产物进行生物学活性等分析,建立了一个重组Fab片段的可溶性分泌表达的通用平台,并为其大规模的工业生产奠定了实验室研究的基础。本课题构建了Fab片段(抗IGF1R抗体、抗Her2抗体、抗VEGF抗体、抗RANKL抗体、抗PD-1抗体)与phoA质粒的表达载体,通过实验摸索发酵条件:37℃在LB培养基中培养至OD～1.0左右,改用以PIPES为主的磷酸盐诱导培养基,20℃,12h低温诱导,发现Fab蛋白可以在大肠杆菌中可溶性表达并分泌到培养基中,随后分离纯化得到高纯度的产物。实验证明,使用phoA表达系统、优化培养基配方以及降低诱导表达的温度等措施可以提高Fab片段在大肠杆菌中的分泌表达,使用Capto L一步亲和层析纯化表达产物,能够获得纯度>90%的目的蛋白。应用SEC-HPLC、MALDI-TOF MS、Fortebio检测及人宫颈癌细胞(Hela)、血管内皮细胞(HUVEC)、人外周血白血病T细胞(Jurkat)活性检测等方法分析所获纯化产物的质量,结果表明五种Fab的纯度均达到90%,相对分子质量与理论值相近,对特异性抗原的的亲和力和商品化抗体药物近似,KD达到11pM-323nM。在特异性表达抗原的细胞模型上,采用流式细胞术能够检测到Fab与相应细胞有特异性结合,证明具有较好的生物学活性,以Fab3为例,其可抑制VEGF对HUVEC细胞的促增殖作用。雷珠单抗对照组的EC50为47.26 ng/ml,本试验所表达纯化的Fab3的EC50为34.88 ng/ml,为雷珠单抗的73.8%。以上结果说明phoA启动子诱导的大肠杆菌分泌型表达体系适合Fab类抗体药物的制备,产品具有较高的产量和质量,具有大规模生产的可行性。

关键词：抗体药物 Fab 胞外分泌表达大肠杆菌生产平台

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利用α-溶血素系统分泌表达重组人白介素-6

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免疫学杂志 2008年第4期24卷 380-384页

作者：宁亚蕾周立雄张卫军鲁东水肖斌毛旭虎邹全明第三军医大学检验系临床微生物及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心重庆400038 重庆工学院生物工程学院生物制药系重庆400050

目的构建基于大肠杆菌α-溶血素(HlyA)分泌机制的原核胞外分泌表达载体系统,将重组人白介素6(rhIL-6)分泌至胞外培养基中。方法利用分子克隆手段,从引起人泌尿道感染的大肠杆菌UPECJ96菌株染色体上获得了α-溶血素(HlyA)系统的分泌功能... 详细信息

目的构建基于大肠杆菌α-溶血素(HlyA)分泌机制的原核胞外分泌表达载体系统,将重组人白介素6(rhIL-6)分泌至胞外培养基中。方法利用分子克隆手段,从引起人泌尿道感染的大肠杆菌UPECJ96菌株染色体上获得了α-溶血素(HlyA)系统的分泌功能基因,与外源基因片段hIL-6一起克隆至pQE30骨架载体,构建了胞外分泌表达质粒pISQ,转化***10,诱导表达后通过Western blot检测培养上清中hIL-6的表达。结果获得了与设计完全一致的pISU载体,Western blot结果显示,可以在pISQ/*** Top10培养液上清中检测到与His-hIL6-HlyAs融合蛋白相对分子质量大小一致的特异条带。结论大肠杆菌HlyA分泌系统操纵子能够在染色体和质粒间传递,rhIL-6能够通过该系统被特异地分泌至胞外培养基中,以可溶形式存在,为后续生物学研究奠定了基础。

关键词：人白介素6 α-溶血素分泌系统 hly操纵子胞外分泌表达

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猪α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达

猪α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达

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作者：黄海南京师范大学

学位级别：硕士

干扰素(Interferon,IFN)是一类重要的细胞因子,具种属特异性,在同种细胞上具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖、免疫调节等多种生物活性。其中IFN-α/β是机体的第一抵御病毒体系。猪是一种重要的经济动物,因此采用重组DNA技术生产猪α干扰... 详细信息

干扰素(Interferon,IFN)是一类重要的细胞因子,具种属特异性,在同种细胞上具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖、免疫调节等多种生物活性。其中IFN-α/β是机体的第一抵御病毒体系。猪是一种重要的经济动物,因此采用重组DNA技术生产猪α干扰素作为免疫增强剂和免疫治疗剂无疑有重要意义。本文成功实现了Pο-IFNα在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高效分泌表达。 Pichia pastoris表达系统是近年来迅速发展起来的一种真核表达系统。Pichia pastoris是一种甲醇酵母,可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长。在表达真核细胞外源蛋白时,不仅具有原核生物生长快、操作简便、成本低的特点,又具备哺乳动物的翻译后加工修饰的功能,从而表达有生物活性的外源蛋白。本研究以含有强启动子P和α-factor信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体质粒pPICZαA,构建猪IFNα基因的重组质粒pPICZαA-IFNα,并转入E. coli JM109中,得到转猪IFNα基因工程菌,经酶切鉴定克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为猪IFNα基因。通过电击将经Sac Ⅰ酶切后线性化的pPICZαA-IFNα质粒转化到巴斯德毕赤酵母KM71H中,经Zeocin抗性浓度梯度筛选出高抗性重组菌株,用1%甲醇诱导目的蛋白表达。SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物的结果表明,分泌于胞外的猪IFNα蛋白分子量比猪IFNα理论值分子量稍大,估计是糖基化的原因。表达的蛋白可发生正确的抗原-抗体反应,表达量为0.45mg/mL。将蛋白表达上清经细胞毒性实验检测表达产物的抗病毒活性为2.5×10IU/mL。

关键词：猪α干扰素巴斯德毕赤酵母基因重组胞外分泌表达

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κ-卡拉胶酶基因克隆表达及酶法制备卡拉胶低聚糖工艺研究

κ-卡拉胶酶基因克隆表达及酶法制备卡拉胶低聚糖工艺研究

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作者：刘哲民中国海洋大学

学位级别：硕士

κ-卡拉胶是存在于海洋红藻细胞壁中的一种结构性多糖，大量研究证实，κ-卡拉胶寡糖及其衍生物具有抗病毒、抗肿瘤、抗HIV、免疫调节等多种生理活性，具有较高的药用开发价值。毋庸置疑，酶解法具有特异性强、产物单一、反应条件温和... 详细信息

κ-卡拉胶是存在于海洋红藻细胞壁中的一种结构性多糖，大量研究证实，κ-卡拉胶寡糖及其衍生物具有抗病毒、抗肿瘤、抗HIV、免疫调节等多种生理活性，具有较高的药用开发价值。毋庸置疑，酶解法具有特异性强、产物单一、反应条件温和等特点，因此，酶解法制备κ-卡拉胶寡糖是一种理想手段。但自然界分离得到的κ-卡拉胶酶产生菌酶产量较低无法满足生产需求。酶基因工程技术的发展为酶的定向改造提供了条件，拓展了酶的研究空间。本文采用基因工程技术对细菌来源的κ-卡拉胶酶基因进行异源分泌表达，以期实现酶产量的大幅提升，进一步拓宽酶的应用范围。研究结果如下：（1）经16s rDNA鉴定，野生的κ-卡拉胶酶产生菌属于Zobellia属并命名为Zobellia sp. ZM-2。应用Primer-Blast设计了三对引物FP1/RP1、 FP2/RP2、FP3/RP3扩增κ-卡拉胶酶基因，结果显示，采用引物对FP2/RP2可以扩增出单一的目的条带。所得κ-卡拉胶酶基因的ORF长度为1638bp，编码545aa，其中N-端的29aa为信号肽序列，基因所编码的氨基酸序列与现有序列的最大相似度为86%，可以确定为一种新的κ-卡拉胶酶基因，并命名为cgkZ。进一步比对分析发现，该酶具有GH16糖苷水解酶家族共有的催化结构E(I/L/V)D(I/V/A/F)(V/I/L/M/F)(0,1)E，说明该κ-卡拉胶酶也属于GH16糖苷水解酶家族。（2）在获得cgkZ基因全序列的基础上，设计了带有限制性酶切位点BamH1和XhoI的引物，用来扩增包含有信号肽序列（cgkZ）和不带有信号肽序列（cgkZˉ）的卡拉胶酶基因。然后构建重组质粒pProEX-HTa-cgkZ及pProEX-HTa-cgkZˉ，转化大肠杆菌BL21(DE3)进行异源表达。结果发现，带有信号肽的重组菌BL21-HTa-cgkZ在保证胞内酶活力与不带信号肽的重组菌BL21-HTa-cgkZˉ基本相同的前提下，能将重组酶较多的分泌到胞外。为了使酶的产`量得到进一步提升，对重组菌BL21-HTa-cgkZ的胞外产酶条件进行了一系列的优化，确定了最佳的诱导条件（诱导温度23℃，IPTG浓度0.9mM，诱导时机2.5h）和培养条件（接种量1%，培养基pH5.5）。同时，培养基中添加0.5%乳糖或诱导后2h添加0.1%TritonX-100或0.5%Gly有利于胞外酶的进一步释放。生长产酶曲线表明，使用LB培养基进行培养的条件下，胞外酶活力最大可达9.37U/mL，最大周质空间酶活为6.06U/mL。综合来看，约51%的卡拉胶酶被分泌到胞外，33%的酶积累中周质空间中，远大于野生菌κ-卡拉胶酶的产量0.33U/mL，从而实现了κ-卡拉胶酶产量的大幅提升。（3）SDS-PAGE分析发现，重组酶的分子量为45kDa，小于根据基因序列推定的分子量61.9kDa，推测可能存在一翻译后加工过程切除了部分片段。His-Tag的存在方便了蛋白纯化，采用Ni-琼脂糖亲和纯化的方法可得到较纯的重组蛋白。酶学性质的研究表明，重组酶的最适反应温度为39℃，40℃条件下保存1h酶活力损失50%，在35℃保存3h酶活力没有明显损失。重组酶的最适pH为6.0，在pH6.0～7.0条件下保存2h酶活力无明显损失。Na+、Tween-80、TritonX-100、DTT对重组κ-卡拉胶酶活力有明显的促进作用；Cu2+、Pb2+、EDTA对酶活力有明显的抑制作用，5mM Cu2+存在条件下可以使酶活力损失73.4%。ESI-MS分析降解后的卡拉胶寡糖发现，酶解产物中包含特征性的κ-卡拉胶四糖[A-G4s]2，六糖[A-G4s]3，八糖[A-G4s]4的电荷峰，其中六糖的电荷峰数量较多。红外分析结果显示寡糖的红外谱图中包含有848cm-1，929cm-1的强吸收峰，分别为κ-卡拉胶基本结构组成糖单元的特征吸收峰，进一步验证了所得卡拉胶寡糖为κ-型的卡拉胶寡糖。（4）以耳突麒麟菜替代κ-卡拉胶为原料制备κ-卡拉胶寡糖。通过单因素实验确定了纤维素酶的作用条件：纤维素酶添加量2.1万U/g麒麟菜，酶解时间2.5h；κ-卡拉胶酶的添加量和酶解时间确定为6U/g麒麟菜和6h。在此基础上，采用Design-Expert7.0设计了三因素三水平的响应面分析实验，得出最佳的pH、卡拉胶酶添加量、温度组合：温度35.71℃，pH5.87，加酶量8.86U/g麒麟菜。在优化条件下对耳突麒麟菜进行降解，醇沉法收集制备卡拉胶寡糖，寡糖的得率在50%以上。该工艺大大促进κ-卡拉胶寡糖在食品、药品、保健品领域的应用。

关键词： Zobellia sp. ZM-2 κ-卡拉胶 cgkZ 胞外分泌表达条件优化胶寡糖制备工艺

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