检索结果-内蒙古大学图书馆

1)项目介绍：HPV是常见的性传染病之一，是宫颈癌发生的主要原因。世界卫生组织的统计资料表明，宫颈癌在全球妇女癌症死亡率中位居第二，美国的统计资料显示75%-90%以上的人群有过HPV的感染。据不完全统计，中国现有宫颈癌病人约13.8... 详细信息

标准号: 0700730053

1)项目介绍：HPV是常见的性传染病之一，是宫颈癌发生的主要原因。世界卫生组织的统计资料表明，宫颈癌在全球妇女癌症死亡率中位居第二，美国的统计资料显示75%-90%以上的人群有过HPV的感染。据不完全统计，中国现有宫颈癌病人约13.8万，每年约有5万人死于宫颈癌，而且发病年轻化并有上升趋势，急需开发出一种既能通过清除HPV感染来预防宫颈癌又能治疗宫颈癌的新方法。该项目用RNA干扰技术开发用于该目的的基因治疗新药-HPV特异的小干扰RNA(siRNA)。2)技术优势：与标准方法比较，HPV特异性的siRNA具有如下优势：传统方法不能清除HPV感染，只能对高危型HPV感染者进行定期随访，因失访率很高，患者有可能发展为中晚期宫颈癌而失去治疗的良机。用HPV特异性的siRNA可避免上述问题。一旦发现高危型HPV感染者，即可用相应的siRNA清除其感染，防止宫颈癌的发生；传统方法只对高危型HPV感染者进行定期随访，这些感染者仍作为传染源长期存在。HPV特异性的siRNA可望治愈HPV感染而阻断传染源；该系统既可用于宫颈癌的癌前病变和早期癌变的治疗，又可与手术治疗结合清除残余病灶。所以用HPV特异性的siRNA来防治宫颈癌有重要的临床意义。另外，HPV感染占育龄妇女的20-30%。计划开发的HPV特异性的siRNA将针对5个高危型HPV，16、18、31、45 和58，这5种基因型约占宫颈癌的90%以上，而58型在香港和珠三角地区的中国妇女的感染中占第二位，因而新疗法有广阔的市场空间。

关键词： HPV特异小干扰RNA(siRNA) 腺病毒表达系统宫颈癌病因基因治疗药物

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猪圆环病毒2型ORF2与T细胞表位基因重组腺病毒表达载体的构建及鉴定

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中国畜牧兽医 2014年第3期41卷 58-64页

作者：莫永正罗满林陈瑞爱华南农业大学兽医学院广东广州510642 广东大华农动物保健品股份有限公司广东新兴527400

利用腺病毒表达系统表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的ORF2基因与T细胞表位(T cell epitope,TCE)基因,表达的融合蛋白具有反应原性,为研制PCV2新型疫苗奠定基础。以pMD18-T-ORF2、pMD18-T-TCE为模板,采用PCR方法扩... 详细信息

利用腺病毒表达系统表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的ORF2基因与T细胞表位(T cell epitope,TCE)基因,表达的融合蛋白具有反应原性,为研制PCV2新型疫苗奠定基础。以pMD18-T-ORF2、pMD18-T-TCE为模板,采用PCR方法扩增目的基因ORF2和TCE,以多肽接头(Gly4Ser)3为连接子,运用重叠延伸PCR技术将2段基因通过连接子(Gly4Ser)3进行融合连接。将融合基因定向克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV构建重组质粒pShuttle-CMVORF2-TCE,将该重组质粒用PmeⅠ酶线性化后电转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞(内含pAdEasy-1骨架质粒)进行同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-ORF2-TCE。PacⅠ酶线性化pAd-ORF2-TCE质粒后转染AD293细胞包装病毒,重组腺病毒经3轮噬斑纯化后获得重组腺病毒rAd-ORF2-TCE,病毒滴度为1012.3 TCID50/mL。Western blotting及间接免疫荧光试验(indirect immunofluorecent assay,IFA)结果表明融合蛋白得到正确表达。

关键词：猪圆环病毒2型 ORF2 T细胞表位腺病毒表达系统

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汉坦病毒嵌合基因G1S0.7、G2S0.7重组腺病毒的改建、表达及其免疫学特性的比较研究

汉坦病毒嵌合基因G1S0.7、G2S0.7重组腺病毒的改建、表达及其免疫...

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作者：李璞媛第四军医大学

学位级别：博士

肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)是由汉坦病毒(Hantavirus, HTV)引起的急性病毒性传染病,临床上尚缺乏特异有效的治疗药物,因此其防治任务十分艰巨。现有的HFRS疫苗主要是鼠脑来源和细胞来源的灭活疫苗,... 详细信息

肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)是由汉坦病毒(Hantavirus, HTV)引起的急性病毒性传染病,临床上尚缺乏特异有效的治疗药物,因此其防治任务十分艰巨。现有的HFRS疫苗主要是鼠脑来源和细胞来源的灭活疫苗,虽然该疫苗在HFRS防治方面起到了积极作用,但仍存在明显不足,主要是其诱导机体产生中和抗体的能力较弱,中和抗体滴度不高,细胞免疫水平亦不高。因此需要更为有效的新型疫苗来弥补现有疫苗的不足。 HTV的囊膜糖蛋白(Glycoprotein, GP)是HFRS基因工程疫苗基础研究中的重要组分。研究表明,GP上有中和抗原表位,能诱导机体产生中和抗体从而起到保护作用。但是GP免疫原性较弱,诱生的抗体出现晚,滴度低;而HTV的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein, NP)被认为是其三个结构蛋白中免疫原性强的蛋白,且NP诱生的抗体出现早,滴度高。虽然现有研究对其是否具有中和抗原表位存在争议,但是大量研究证实NP对HTV感染的实验动物具有保护作用。此外NP上还存在多个针对HTV的CTL表位,因此NP在机体的细胞免疫应答中发挥重要作用。我室以往研究表明,NP的抗原结合位点主要位于S基因0.7 kb片段(即编码NP氨基端1～274aa片段)上。将该截短片段克隆进原核载体并用表达产物免疫小鼠,动物实验结果显示与完整NP免疫效果基本相同;进一步构建了M片段与S0.7的嵌合基因(G1S0.7、G2S0.7),并在不同系统中表达,同时对其免疫学特性进行检测,结果显示嵌合基因/融合蛋白能有效的诱导机体体液和细胞免疫应答,且其在腺病毒载体中的免疫效果优于其他系统。然而研究中我们发现各个表达系统存在融合蛋白表达水平不高、表达产物免疫小鼠后细胞免疫水平也相对较低的问题。因此有必要采取有效策略来解决这一问题。本课题在我室前期工作基础上,以人5型复制缺陷型腺病毒Adeno-XTM系统为基础,利用基因重组技术,对含HTV嵌合基因G1S0.7、G2S0.7的pShuttle转移载体进行改建和修饰,包括将原有人巨细胞病毒早期增强子/启动子(Human cytomegalovirus early enhancer/promoter, CMV)替换为CMV与鸡β肌动蛋白的杂合启动子(hybrid of Human cytomegalovirus early enhancer and chickenβ-actin promoter, CAG),单独插入土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(Woodchuck Hepatitis Virus post-transcriptional regulatory element, WPRE),或替换启动子的同时插入WPRE,以期在转录及转录后调控阶段提高抗原的表达水平;构建病毒载体并包装重组腺病毒,鉴定并比较不同重组腺病毒中融合蛋白G1S0.7、G2S0.7的表达及其水平的高低;大量制备、纯化各重组腺病毒,免疫小鼠,并对其免疫学特性进行系统研究。 1、设计并合成CAG启动子,替换pShuttle转移载体CMV启动子,获得含HTV嵌合基因G1S0.7、G2S0.7的改建重组腺病毒转移载体,分别命名为G1S0.7-pCAG和G2S0.7-pCAG;设计并合成WPRE,插入重组pShuttle载体中目的片段3端,获得含HTV嵌合基因G1S0.7、G2S0.7的改建重组腺病毒转移载体,分别命名为G1S0.7-WPRE和G2S0.7-WPRE;同时替换启动子并插入WPRE,获得含HTV嵌合基因G1S0.7、G2S0.7的改建重组腺病毒转移载体,分别命名为G1S0.7-pCAG-WPRE和G2S0.7-pCAG-WPRE。 2、将上述改建的重组转移载体分别克隆入腺病毒载体骨架pAdeno-X DNA,并经XhoⅠ、PCR及PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切鉴定,获得阳性重组腺病毒DNA。转染HEK 293细胞,包装重组腺病毒,分别命名rAd-G1S0.7-pCAG、rAd-G2S0.7-pCAG、rAd-G1S0.7-WPRE、rAd-G2S0.7-WPRE、rAd-G1S0.7-pCAG-WPRE和rAd-G2S0.7-pCAG-WPRE。 3、扩增、纯化并测定重组腺病毒滴度,用IFA和Western blot对表达产物进行鉴定,同时加入未改建的含嵌合基因重组腺病毒rAd-G1S0.7、rAd-G2S0.7作为对照。结果显示,所有重组腺病毒感染HEK 293细胞后,用特异性抗体均可检测到胞浆内的绿色荧光,表明所有重组腺病毒均可表达融合蛋白G1S0.7和G2S0.7,其中替换启动子的rAd-G1S0.7-pCAG

关键词：汉坦病毒嵌合基因载体改建腺病毒表达系统免疫学特性

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腺病毒介导人卵泡刺激素基因在山羊乳腺上皮细胞的表达及蛋白活性分析

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家畜生态学报 2020年第10期41卷 18-23页

作者：李媛华荣茂段家昕陈华丽徐德军杨丽程建勇李晓亚耿果霞李青旺西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

该研究旨在构建含人FSH基因的重组腺病毒载体,在山羊乳腺上皮细胞中进行表达,验证重组人FSH的体外生物学活性。利用AdEasy重组腺病毒系统获得pAdEasy-FSH/His重组腺病毒载体,经HEK293A细胞包装、扩增后获得重组人FSH腺病毒,感染GMEC后,... 详细信息

该研究旨在构建含人FSH基因的重组腺病毒载体,在山羊乳腺上皮细胞中进行表达,验证重组人FSH的体外生物学活性。利用AdEasy重组腺病毒系统获得pAdEasy-FSH/His重组腺病毒载体,经HEK293A细胞包装、扩增后获得重组人FSH腺病毒,感染GMEC后,检测FSH表达情况。结果表明,将获得的较高滴度的含FSH目的基因的重组腺病毒感染GMEC后,经Western blot检测GMEC细胞可以成功表达FSH蛋白;通过体外细胞活性试验验证其具备生物学活性。综上所述,腺病毒介导的羊乳腺上皮细胞表达的重组人FSH具备体外生物学活性,这为进一步在大动物乳腺表达重组FSH奠定了基础。

关键词： FSH 腺病毒表达系统羊乳腺上皮细胞生物活性

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猪IL-10重组腺病毒的构建及其对PRRSV体外增殖的影响

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中国兽医学报 2021年第3期41卷 438-444页

作者：魏婷婷刘思颖杜连昭李晨王茜茜马欣王兴龙西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

为探索猪IL-10对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)增殖的影响,本研究构建表达猪IL-10的重组腺病毒对其进行过表达研究。根据GenBank收录的猪IL-10基因序列设计引物并扩增获得该基因... 详细信息

为探索猪IL-10对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)增殖的影响,本研究构建表达猪IL-10的重组腺病毒对其进行过表达研究。根据GenBank收录的猪IL-10基因序列设计引物并扩增获得该基因,将其克隆至pAdTrack-cmv载体后,转化BJ5183菌株与pAdEasy-1骨架载体进行同源重组,获得pAd-IL-10重组腺病毒质粒。将重组质粒线性化后转染HEK-293A细胞完成rHAd-IL-10重组腺病毒包装,经RT-qPCR、Western blot方法证实获得重组腺病毒可表达目的蛋白。将rHAd-IL-10与rHAd-EGFP重组腺病毒分别感染Marc-145细胞后再接入PRRSVSD16-GFP毒株培养后,利用RT-qPCR、Western blot与TCID50测定等方法检测不同试验组的PRRSV水平,结果显示使用rHAd-IL-10在Marc-145细胞中过表达猪IL-10,可显著促进PRRSV SD16-GFP毒株在细胞内的增殖。本研究成功构建rHAd-IL-10重组腺病毒,并证实猪IL-10过表达可以促进PRRSV SD16-GFP在细胞内的增殖,为后续研究IL-10在PRRSV感染中的作用奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒白介素10 腺病毒表达系统病毒增殖

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腺病毒介导O型口蹄疫病毒VP1基因在关中奶山羊乳腺上皮细胞中的表达

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中国兽医学报 2016年第9期36卷 1537-1543页

作者：贺晓丽林小湲刘军王勃卓伟伟张涌郑月茂西北农林科技大学动物医学院农业部动物生物技术重点开放实验室陕西杨凌712100 新疆哈密地区动物疫病预防控制中心新疆哈密839000

构建O型口蹄疫病毒抗原表位VP1的重组腺病毒载体,并在体外和体内培养试验中检测腺病毒介导VP1的表达。利用PCR技术,从原始质粒中扩增VP1基因片段,双酶切后连接载体构建重组穿梭质粒pHBAd-MCMVVP1-GFP,并经磷酸钙沉淀法携带骨架质粒按比... 详细信息

构建O型口蹄疫病毒抗原表位VP1的重组腺病毒载体,并在体外和体内培养试验中检测腺病毒介导VP1的表达。利用PCR技术,从原始质粒中扩增VP1基因片段,双酶切后连接载体构建重组穿梭质粒pHBAd-MCMVVP1-GFP,并经磷酸钙沉淀法携带骨架质粒按比例转染HEK293A细胞,获得P1代腺病毒颗粒,经多轮扩增后进行浓缩纯化,获得复制缺陷型腺病毒颗粒,测定病毒滴度。进行体外感染乳腺上皮细胞,通过GFP的荧光表达量确定最佳感染复数。然后用RT-PCR和Western blotting检测感染的乳腺上皮细胞中抗原表位VP1的表达。进一步用纯化的腺病毒通过乳头滴定法感染羊乳腺组织,检测其乳汁中VP1的表达。结果显示,PCR、双酶切和基因测序等结果表明基因扩增和腺病毒载体构建正确,以其感染关中奶山羊乳腺上皮细胞和乳腺组织时,均可检测到VP1蛋白表达。结果表明,成功构建了含VP1基因的重组腺病毒载体,且能够介导VP1基因在体外和体内培养试验中有效表达,为进一步研究纯化分离的VP1蛋白的抗原性并提高抗原优化技术提供基础研究。

关键词： VP1 腺病毒表达系统蛋白表达乳腺上皮细胞奶山羊

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表达H5N1禽流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及免疫保护性研究

表达H5N1禽流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及免疫保护性研究

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作者：王伟东北农业大学

学位级别：硕士

H5N1亚型高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza，HPAI)是一种严重危害养禽业的高度传染性、致死性疾病。自1997年起，H5N1病毒在全世界范围内蔓延，并且突破种间屏障感染包括人类在内的多种哺乳动物。目前疫苗免疫仍然是... 详细信息

H5N1亚型高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza，HPAI)是一种严重危害养禽业的高度传染性、致死性疾病。自1997年起，H5N1病毒在全世界范围内蔓延，并且突破种间屏障感染包括人类在内的多种哺乳动物。目前疫苗免疫仍然是预防禽流感大流行的最有效途径，现有的传统全病毒灭活苗，依赖鸡胚进行生产，耗时长，难以满足需求。因此，寻求一种能够迅速生产、廉价、高效的新型流感疫苗对于禽流感的防控具有重要的意义。腺病毒载体做为治疗基因的递送载体，具有宿主范围广、高效表达外源基因、安全性好和免疫途径简捷等优点，具有广阔的应用前景。本研究通过RT-PCR扩增H5N1亚型禽流感病毒A/wild duck/Shandong/628/2011(SD628)(Clade2.3.4)和A/wild duck/Shandong/2/2011(SD2)(Clade2.3.2.1)的HA基因，将其克隆到pShuttle-CMV中构建重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV-SD628-HA和pShuttle-CMV-SD2-HA。采用Ad-Easy技术，制备表达禽流感病毒HA基因的复制缺陷型重组腺病毒rAd-HA(rAd-SD628-HA和rAd-SD2-HA)，将其感染AD293细胞后，可产生明显的细胞病变，通过细胞超薄切片可观察到完整的腺病毒。经RT-PCR、间接免疫荧光及westernblot证明HA基因在AD293细胞中成功转录和表达，并且表达的蛋白具有良好的生物学活性。用腺病毒纯化试剂盒纯化P4代重组腺病毒，测其TCID值，rAd-SD628-HA的病毒滴度为10TCID/mL;rAd-SD2-HA的病毒滴度为7.5×10TCID/mL。 rAd-SD628-HA经肌肉注射和滴鼻免疫BALB/c小鼠，免疫剂量分别为10TCID/只，5×10TCID/只。初免3周后，采用同种剂量、同种途径进行加强免疫。以病毒中和试验(VN)检测小鼠血清抗体效价，二免1周，肌肉注射免疫组和滴鼻免疫组中和抗体效价达到最高分别达到1:113，1:66，中和抗体效价呈明显的上升趋势。同源SD628病毒攻毒后，腺病毒疫苗免疫组小鼠状态良好，无小鼠死亡，体重未出现明显波动。对照组小鼠精神萎靡，皮毛粗糙，体重持续下降，最低下降到原体重的81%，并且有2只小鼠死亡。以上结果表明：rAd-SD628-HA经肌肉和鼻粘膜两种途径免疫BALB/c小鼠均能够诱导良好的免疫应答反应，保护小鼠抵抗致死剂量H5N1流感病毒的攻击。 rAd-SD628-HA采用肌肉注射的方式免疫SPF鸡，初免3周后，加强免疫。二免2周后，分别用10EID剂量的同源病毒SD628、异源病毒SD2进行攻毒。血凝抑制试验(HI)检测鸡血清抗体效价。SD628攻毒组的SPF鸡以抗原A/wild duck/Shandong/628/2011(H5N1)检测HI抗体效价，攻毒前，二免2周HI抗体效价达到最高;10TCID剂量组、10TCID剂量组和Re-6灭活疫苗免疫组HI抗体效价分别达到9log2，9.16log2，6.88log2。同源SD628病毒后，10TCID剂量组有1只鸡死亡(保护率87.5%)，3只鸡排毒;10TCID剂量组没有鸡死亡，未出现鸡排毒(保护率100%);Re-6疫苗组有3只鸡排毒，没有鸡死亡(保护率100%);对照组的鸡全部死亡。结果表明：针对同源病毒的攻击，rAd-SD628-HA以10TCID剂量免疫SPF鸡在保护力和抑制排毒等方面都优于10TCID剂量，保护效果与灭活疫苗无显著差别。 rAd-SD628-HA免疫SPF鸡后，SD2攻毒组的SPF鸡以抗原A/wild duck/Shandong/2/2011(H5N1)检测HI抗体效价，二免2周，10TCID剂量组和Re-6灭活疫苗组抗体效价分别达到4log2，10.88log2。异源SD2病毒攻毒2周后，腺病毒免疫组抗体效价明显升高达到6.14log2，Re-6灭活疫苗免疫组抗体效价略有上升达到11.14log2。同时，10TCID剂量组和Re-6疫苗组的SPF鸡均未出现死亡情况(保护率100%)，但是，10TCID剂量组有4只鸡排毒，Re-6疫苗组鸡未出现排毒，对照组的鸡全部死亡。结果表明：rAd-SD628-HA以10TCID剂量免疫SPF鸡，也能抵御异源病毒的致死性攻击。本研究构建的H5N1亚型禽流感病毒重组腺病毒活载体疫苗在BALB/c小鼠和SPF鸡上均能够诱导高水平的抗体，并且可以完全保护小鼠和鸡抵抗致死性AIV的攻击，为新型流感疫苗的研发提供了理论依据。

关键词： H5N1亚型禽流感病毒腺病毒表达系统 HA基因免疫效力

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双靶向腺病毒皮下递送

双靶向腺病毒皮下递送

引用

作者： P·颂雄 K·尼亚齐 S·拉比扎德美国加利福尼亚州

考虑了免疫治疗方法和组合物，其中新表位和/或肿瘤相关抗原通过靶向MHC‑I和/或MHC‑II呈递系统的腺病毒表达系统递送至树突细胞，并进一步提供一种或多种重组肽以刺激T细胞活化并干扰检查点抑制。通过输入NK细胞进一步支持治疗，NK细胞... 详细信息

标准号: CN109069598A

考虑了免疫治疗方法和组合物，其中新表位和/或肿瘤相关抗原通过靶向MHC‑I和/或MHC‑II呈递系统的腺病毒表达系统递送至树突细胞，并进一步提供一种或多种重组肽以刺激T细胞活化并干扰检查点抑制。通过输入NK细胞进一步支持治疗，NK细胞可以被修饰为具有高亲和力CD16受体和/或与一种或多种新表位和/或肿瘤相关抗原结合的嵌合抗原受体。

关键词：肿瘤相关抗原新表腺病毒表达系统呈递系统高亲和力免疫治疗嵌合抗原树突细胞递送检查点重组肽靶向修饰刺激治疗

来源：评论

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tbc1d14基因过表达腺病毒、载体及构建和包装方法

tbc1d14基因过表达腺病毒、载体及构建和包装方法

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作者：焦寒伟黄庆洲帅学宏郭芳芳陈吉轩伍莉甘玲罗献梅王红均 402460 重庆市荣昌区学院路160号

本发明公开了tbc1d14基因过表达腺病毒载体，以pHBAd‑EF1‑MCS‑GFP为载体，整合连接tbc1d14基因，进行重组，得到tbc1d14基因过表达腺病毒载体。本发明还公开了上述腺病毒载体的构建方法、腺病毒的包装方法及获得的腺病毒。本发明采用了... 详细信息

标准号: CN108103101A

本发明公开了tbc1d14基因过表达腺病毒载体，以pHBAd‑EF1‑MCS‑GFP为载体，整合连接tbc1d14基因，进行重组，得到tbc1d14基因过表达腺病毒载体。本发明还公开了上述腺病毒载体的构建方法、腺病毒的包装方法及获得的腺病毒。本发明采用了腺病毒表达系统，用同源重组的方法将外源基因小鼠tbc1d14基因构建至腺病毒骨架载体上，构建重组腺病毒Ad‑tbc1d14，从而获得高滴度的重组腺病毒，是目前最高效可靠且最稳定的小鼠tbc1d14基因表达系统，可用于在哺乳细胞中瞬时及高水平地表达小鼠tbc1d14目的蛋白，从而为研究tbc1d14基因在细胞自噬过程中的生物学功能做铺垫。

关键词：腺病毒载体小鼠基因过表达重组腺病毒腺病毒构建腺病毒表达系统腺病毒骨架载体基因表达系统生物学功能哺乳细胞基因构建目的蛋白同源重组外源基因基因高滴度可用整合铺垫细胞研究

来源：评论

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