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花蓟马化学感受蛋白FintCSP2与聚集信息素苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯的结合特性

昆虫学报 2024年第7期67卷 897-908页

作者：李恒田厚军陈艺欣林硕魏辉陈勇福建省农业科学院植物保护研究所福建省作物有害生物监测与治理重点实验室农业部福州作物有害生物科学观测试验站福州350013

【目的】本研究旨在明确花蓟马Frankliniella intonsa化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)FintCSP2与聚集信息素苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯[neryl(S)-2-methylbutanoate]的结合能力。【方法】利用RT-PCR法扩增花蓟马FintCSP2的开放阅读框序列,并对其进行生物信息学分析;利用RT-qPCR检测FintCSP2在花蓟马雌成虫不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹和足)中的表达量;利用RNAi通过向花蓟马雌成虫注射dsRNA沉默FintCSP2,24 h时通过触角电位(electroantennogram,EAG)实验检测花蓟马对苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯的反应,利用Y型嗅觉仪测定花蓟马雌成虫对苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯的的选择性;原核表达FintCSP2重组蛋白,利用荧光竞争结合实验检测FintCSP2重组蛋白与苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯结合力;采用分子对接模拟技术和蛋白定点突变技术分析FintCSP2与苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯结合的关键氨基酸残基。【结果】花蓟马FintCSP2(GenBank登录号:MT211602.1)开放阅读框长390 bp,编码129个氨基酸,N端有一个包含20个氨基酸的信号肽,含有4个保守的半胱氨酸。氨基酸序列分析结果表明,FintCSP2氨基酸与花蓟马CSP1(GenBank登录号:WBW64307.1)、西花蓟马*** CSPs(GenBank登录号:WBW64306.1,AJL33750.1)和牛角花齿蓟马Odontothrips loti CSP2(GenBank登录号:WBU77202.1)的亲缘关系最近,氨基酸序列一致性分别为99.22%,99.22%,86.05%和65.85%。RT-qPCR结果表明,FintCSP2在雌成虫各组织中均有表达,其中在触角中的表达量最高。与对照组(注射ds EGFP)比,沉默FintCSP2显著降低花蓟马对苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯的EAG反应绝对值和选择率。分子对接预测Tyr24,Phe29,Leu38,Val71,Cys76,Cys79和Gln83这7个氨基酸残基最可能参与FintCSP2结合苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯;定点突变和荧光竞争结合实验结果表明,与野生型蛋白相比,FintCSP2-Tyr24Ala和FintCSP2-Gln83Ala突变蛋白与苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯结合能力显著下降,FintCSP2-Phe29Ala突变体蛋白失去与苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯的结合能力。【结论】花蓟马FintCSP2蛋白在识别苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯过程中起关键作用,Tyr24,Phe29和Gln83是FintCSP2结合苨肉基(S)-2-甲基丁酸酯的3个关键氨基酸残基。

关键词：花蓟马聚集信息素化学感受蛋白 RNA干扰定点突变荧光竞争结合实验

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柑橘大实蝇化学感受蛋白基因BminCSP3的克隆、表达及结合特征分析

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果树学报 2022年第3期39卷 343-351页

作者：王兆祥陈剑杨岭田晓丽桂连友王福莲张国辉长江大学农学院·长江大学昆虫研究所湖北荆州434025 长江大学生命科学学院湖北荆州434025

【目的】探究在柑橘大实蝇成虫触角高表达的化学感受蛋白BminCSP3与气味配体的结合特性,以期为揭示柑橘大实蝇嗅觉识别的分子机制提供一定理论依据。【方法】通过RT-PCR克隆BminCSP3基因,并对其进行生物信息学分析;以原核表达系统和镍... 详细信息

【目的】探究在柑橘大实蝇成虫触角高表达的化学感受蛋白BminCSP3与气味配体的结合特性,以期为揭示柑橘大实蝇嗅觉识别的分子机制提供一定理论依据。【方法】通过RT-PCR克隆BminCSP3基因,并对其进行生物信息学分析;以原核表达系统和镍柱体外表达纯化得到BminCSP3蛋白;利用荧光竞争结合实验检测BminCSP3与14种气味配体的结合特性。【结果】BminCSP3开放阅读框全长为474 bp,编码157个氨基酸,含有4个半胱氨酸残基,为典型的化学感受蛋白;预测其等电点为5.41,信号肽由22个氨基酸组成,无跨膜结构域,亲水性总平均值为-0.397,是亲水性蛋白。荧光竞争结合实验结果表明,BminCSP3与供试14种气味配体的亲和力均较弱,其Ki值均大于20μmol·L^(-1)。一般认为Ki值大于20μmol·L^(-1),说明蛋白与配体分子间的亲和力较弱。【结论】BminCSP3虽然在柑橘大实蝇成虫触角中显著上调表达,但可能不参与柑橘大实蝇成虫的嗅觉识别过程;或本试验所用配体并非BminCSP3最适配体,应扩大配体库进一步验证BminCSP3的嗅觉功能。

关键词：柑橘大实蝇化学感受蛋白原核表达蛋白纯化荧光竞争结合实验

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枣食芽象甲化学感受蛋白PyasCSP4的基因克隆、表达及配体结合特征

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昆虫学报 2022年第7期65卷 831-842页

作者：洪波常青翟颖妍任博文谢毓芬张锋陕西省生物农业研究所西安710043 陕西省林业科学院西安710082

【目的】本研究为明确枣树Zizyphus jujuba主要害虫枣食芽象甲Scythropus yasumatsui化学感受蛋白4(chemosensory protein 4,CSP4)的表达特点及配体结合特性。【方法】基于枣食芽象甲成虫触角转录组数据,利用RT-PCR方法克隆了枣食芽象甲... 详细信息

【目的】本研究为明确枣树Zizyphus jujuba主要害虫枣食芽象甲Scythropus yasumatsui化学感受蛋白4(chemosensory protein 4,CSP4)的表达特点及配体结合特性。【方法】基于枣食芽象甲成虫触角转录组数据,利用RT-PCR方法克隆了枣食芽象甲PyasCSP4 cDNA序列,并进行生物信息学分析。通过RT-qPCR方法测定PyasCSP4在枣食芽象甲成虫不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹、足和翅)中的表达水平。通过原核表达系统和镍柱纯化获得PyasCSP4重组蛋白,采用荧光竞争结合实验测定重组蛋白PyasCSP4与35种枣树挥发物的结合特性。【结果】克隆获得枣食芽象甲PyasCSP4的cDNA序列(GenBank登录号:OK322362),其开放阅读框全长为366 bp,编码121个氨基酸,N末端有18个氨基酸组成的信号肽序列,PyasCSP4成熟蛋白序列具有4个保守的半胱氨酸残基。RT-qPCR结果表明,PyasCSP4基因在成虫不同组织中均有表达,在触角和翅中的表达量显著高于在其他组织中的表达量。重组蛋白PyasCSP4与25种配体具有结合活性,尤其与α-蒎烯、α-水芹烯和罗勒烯等的结合能力最强,解离常数(Ki)值分别为6.29,6.58和6.69μmol/L。【结论】PyasCSP4能够与多种枣树挥发物结合,推测其可能在枣食芽象甲定位寄主植物的过程中发挥重要作用。本研究的结果对阐明枣食芽象甲嗅觉机制和开展绿色防控研究具有重要意义。

关键词：枣食芽象甲化学感受蛋白配体结合特性原核表达荧光竞争结合实验

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信息素和双峰驼挥发性化合物对黑须污蝇嗅觉感受的分子机制研究

信息素和双峰驼挥发性化合物对黑须污蝇嗅觉感受的分子机制研究

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作者：李雷芬内蒙古农业大学

学位级别：硕士

高度发达的感觉器官有助于黑须污蝇适应复杂多变的环境,在其生活中起着关键作用,如识别和定位宿主、觅食、交配和产卵。课题组之前的研究表明,多种信息素和双峰驼挥发物对黑须污蝇有显著的引诱和驱避活性,但不清楚其相应的嗅觉感受机制... 详细信息

高度发达的感觉器官有助于黑须污蝇适应复杂多变的环境,在其生活中起着关键作用,如识别和定位宿主、觅食、交配和产卵。课题组之前的研究表明,多种信息素和双峰驼挥发物对黑须污蝇有显著的引诱和驱避活性,但不清楚其相应的嗅觉感受机制。因此,深入了解黑须污蝇的嗅觉感受机制,有助于更好地揭示黑须污蝇气味接收变化,为阴道蝇蛆病生物防控的研究提供新思路。本研究通过高通量测序展示黑须污蝇雌、雄性成蝇触角的转录组,对其嗅觉相关蛋白基因进行鉴定和功能分析,并对嗅觉感受过程中关键蛋白的表达模式和功能进行了系统深入的研究,希望从分子水平阐明嗅觉相关蛋白在其化学通讯过程中发挥的作用机制。本研究还对黑须污蝇排泄物进行了挥发性信息素的筛选和鉴定,通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测、气相色谱-触角电位联用(GC-EAD)检测、触角电位测定(EAG),确定了黑须污蝇对不同浓度二十烷均有触角电位反应。通过行为实验和诱捕实验,探索了不同浓度二十烷对黑须污蝇的影响。主要研究结果如下: 1.触角转录组高通量测序得到了 262628个转录本,并将其组装成153779个单基因。将组装结果在8个数据库进行对比,单基因经组装后在NCBI的NT数据库中注释到93604条,占比最高(60.87%)。在黑须污蝇触角中鉴定出昆虫嗅觉必需的化学感受受体118个,包括62个气味受体(包括一个Orco)、11个离子受体、16个味觉受体、24个气味结合蛋白、2个化学感受蛋白和2个感觉神经元膜蛋白。我们没有鉴定出任何气味降解酶基因,这表明它们在黑须污蝇中表达较低。根据TPM值,有13个编码气味结合蛋白转录本在黑须污蝇雄性触角中高表达,11个编码气味结合蛋白转录本在黑须污蝇雌性触角中高表达。荧光定量qRT-PCR实验验证了 OBPs在黑须污蝇雌性和雄性触角的表达量。 2.通过原核表达系统表达和纯化WangOBP42531和WangOBP39280两种重组蛋白,利用荧光竞争结合试验测定了两种重组蛋白与黑须污蝇5种信息素和双峰驼7种挥发性化合物的结合能力。结果显示:两种重组蛋白均能与荧光探针1-NPN有效结合,并且结合存在饱和效应。其中WangOBP42531对甲基庚烯酮、1-辛烯-3-醇、双戊烯、邻二甲苯、对乙基苯乙酮、苯乙酮、乙基苯等气味配体化合物具有较高的结合能力。而WangOBP39280对甲基庚烯酮、对乙基苯乙酮、苯乙酮具有强结合能力。分别以地中海实蝇气味结合蛋白CcapOBP22/CcapOBP69a和黑吹蝇一般气味结合蛋白28a为模板构建WangOBP42531和WangOBP39280蛋白的三维模型。 3.黑须污蝇的排泄物经过吸附处理后,GC-MS鉴定到二十烷这一种化合物。GC-EAD和EAG结果显示黑须污蝇对不同浓度二十烷均有触角电位反应;雌、雄黑须污蝇对不同浓度二十烷的EAG相对反应值无显著差异。行为实验和诱捕实验发现,二十烷能引起黑须污蝇行为反应;10-1μg/μL的二十烷对雌、雄黑须污蝇具有显著引诱性。

关键词：黑须污蝇气味结合蛋白原核表达荧光竞争结合实验信息素

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螟蛉盘绒茧蜂化学感受蛋白基因的克隆及功能研究

螟蛉盘绒茧蜂化学感受蛋白基因的克隆及功能研究

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作者：韩凯如西北农林科技大学

学位级别：硕士

螟蛉盘绒茧蜂（Cotesia ruficrus）是一种本土寄生蜂,对入侵害虫草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的发生为害有良好的控制作用,但该寄生蜂寻找寄主的分子机制尚未见报道。本研究在获得螟蛉盘绒茧蜂触角转录组候选嗅觉相关基因的基础... 详细信息

螟蛉盘绒茧蜂（Cotesia ruficrus）是一种本土寄生蜂,对入侵害虫草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的发生为害有良好的控制作用,但该寄生蜂寻找寄主的分子机制尚未见报道。本研究在获得螟蛉盘绒茧蜂触角转录组候选嗅觉相关基因的基础上,对3个化学感受蛋白基因CrufCSP1、CrufCSP2和CrufCSP3进行了克隆测序、生物信息学和表达模式分析;然后通过荧光竞争结合和分子对接实验,研究了CrufCSP1和CrufCSP3蛋白与寄主挥发物的结合特性。其中,重点以触角高表达的CrufCSP3为对象,通过氨基酸定点突变和RNA干扰技术明确了该蛋白在嗅觉过程中发挥的功能。取得主要研究结果如下: 1.螟蛉盘绒茧蜂CrufCSPs基因克隆及表达分析选择3个CrufCSPs（CrufCSP1、CrufCSP2、CrufCSP3）基因进行克隆并测序验证其完整编码序列。螟蛉盘绒茧蜂3个CrufCSPs基因序列大小为249-360bp,编码82-119个氨基酸残基。时空表达分析表明,CrufCSP3在触角中的相对表达量显著高于其他组织的表达量,CrufCSP2在腹部中显著上调表达,而CrufCSP1表达的部位比较广泛,除了在翅中高表达外,在触角、足、腹部和胸部中也有较高的表达量;此外,3个CrufCSPs在成虫不同发育阶段表达模式均有差异,说明每个CrufCSPs具有不同的生理功能。 2.螟蛉盘绒茧蜂CrufCSPs的表达纯化及其与配基的结合特性通过大肠杆菌原核表达系统,对嗅觉感器中高表达的CrufCSP1和CrufCSP3进行了蛋白表达。选择1-NPN作为荧光探针,通过荧光竞争结合实验分析CrufCSP1和CrufCSP3与34种寄主挥发物的亲和性。结果显示,重组CrufCSP1与2-羟基-5-甲基苯乙酮、N,N-二甲基辛酰胺、己醛、苯甲醛和辛醛等7种物质均具有强结合能力。重组CrufCSP3与庚醇、1-碘十二烷、十二醛、2-羟基-5-甲基苯乙酮、对甲基苯甲醛和顺-3-己烯-1-醇具有较好结合能力。构建CrufCSP1和CrufCSP3蛋白的三维模型,通过分子对接验证了蛋白与各自配体的结合能及相互作用力,其中Phe24、Asp25、Thr53、Lys81四个氨基酸残基在CrufCSP1与配体结合过程中发挥关键作用;CrufCSP3中4个氨基酸残基Glu20、Lys86、Asn98和Arg118在对接过程中能通过与配体形成氢键稳定形成复合物结构。 3.螟蛉盘绒茧蜂CrufCSP3与配体的结合机制根据分子对接结果,推测氢键是CrufCSP3结合庚醇、2-羟基-5-甲基苯乙酮,1-碘十二烷、十二醛和对甲基苯甲醛的主要作用力,据此设计并成功表达4个突变蛋白CrufCSP3E20A、CrufCSP3K86A、CrufCSP3N98A和CrufCSP3R118A。荧光竞争结合表明,与突变前的CrufCSP3相比,CrufCSP3E20A和CrufCSP3K86A与对甲基苯甲醛的结合力有所降低,CrufCSP3K86A失去了与庚醇和2-羟基-5-甲基苯乙酮的结合能力,CrufCSP3N98A失去了与十二醛和2-羟基-5-甲基苯乙酮的结合能力。以上结果说明,关键氨基酸的改变可改变CrufCSP3与化合物的结合。通过触角电位实验,发现庚醇、2-羟基-5-甲基苯乙酮,1-碘十二烷、十二醛和对甲基苯甲醛这5种化合物均能引起螟蛉盘绒茧蜂的触角电位反应值,表明这五种化合物是螟蛉盘绒茧蜂潜在的行为活性物质。 4.螟蛉盘绒茧蜂CrufCSP3的功能验证利用RNAi研究了CrufCSP3的嗅觉功能,触角电位实验发现与注射ds GFP的螟蛉盘绒茧蜂相比,注射dsCrufCSP3的雄蜂和雌蜂对寄主挥发物（庚醇、2-羟基-5-甲基苯乙酮和对甲基苯甲醛）在浓度为100μg/μL时EAG反应值显著降低。行为学实验表明,上述三种寄主挥发物对注射dsCrufCSP3的雄、雌蜂吸引力降低,并且CrufCSP3表达量的降低导致雌蜂对草地贪夜蛾幼虫的寄生率下降19.36%。以上结果表明CrufCSP3可直接参与螟蛉盘绒茧蜂对寄主识别的过程中。综上,本研究成功筛选出庚醇、2-羟基-5-甲基苯乙酮和对甲基苯甲醛三种行为活性物质,并对CrufCSP3的嗅觉功能进行了验证。研究结果为深入揭示螟蛉盘绒茧蜂的寄主选择机制提供了重要的理论依据,也为进一步探讨CSPs基因在其他寄生性昆虫中的功能奠定了基础。

关键词：螟蛉盘绒茧蜂化学感受蛋白荧光竞争结合实验分子对接定点突变 RNA干扰生物防治

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两种熊蜂嗅觉蛋白OBPs和ORs的功能分析

两种熊蜂嗅觉蛋白OBPs和ORs的功能分析

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作者：吴娅华中师范大学

学位级别：硕士

传粉昆虫与开花植物在协同进化过程中形成了互相适应的化学生态策略,开花植物释放的花香物质能够引起多种访花昆虫的授粉行为,其中膜翅目蜂类在植物传粉中扮演着十分重要的角色,低海拔地区传粉蜂类主要以蜜蜂类群为主,而在中高海拔地区... 详细信息

传粉昆虫与开花植物在协同进化过程中形成了互相适应的化学生态策略,开花植物释放的花香物质能够引起多种访花昆虫的授粉行为,其中膜翅目蜂类在植物传粉中扮演着十分重要的角色,低海拔地区传粉蜂类主要以蜜蜂类群为主,而在中高海拔地区则多见熊蜂类群访花授粉。蜂类在识别花香气味分子进行访花授粉过程中主要依赖其敏锐的嗅觉系统,目前对于中华蜜蜂和意大利蜜蜂两种蜂类的嗅觉分子机理相关研究已较为深入,但对于中高海拔地区不同熊蜂授粉的化学感受调控机制了解则较少。本研究以国内外商业化应用最广的北美熊蜂和欧洲熊蜂作为研究对象,对两种熊蜂多种气味结合蛋白OBPs和气味受体ORs的嗅觉生理功能进行了初步探索,主要研究结果如下: （1）熊蜂嗅觉蛋白OBPs和ORs的系统进化分析和序列比对基于北美熊蜂和欧洲熊蜂基因组和转录组数据,筛选出嗅觉蛋白OBPs和ORs分别与中华蜜蜂和意大利蜜蜂相应蛋白进行了系统进化分析,结果显示北美熊蜂、欧洲熊蜂、中蜂和意蜂的OBP1、OBP5、OBP10、OBP11、OR1a、OR1b、OR9a、OR14、OR35、ORco分别聚为一支,其蛋白序列一致性均高达80%以上,序列分析结果表明上述嗅觉蛋白可能在膜翅目蜂类嗅觉蛋白系统进化上均分别具有较高保守性,暗示其可能结合结构相同或者相近的花香气味分子配体化合物,在熊蜂和蜜蜂类群中发挥类似的嗅觉生理功能。（2）熊蜂嗅觉蛋白OBPs原核表达纯化及配体结合特性分析通过原核表达纯化获得多种北美熊蜂和欧洲熊蜂OBPs重组蛋白,与20种农林蜜源植物花挥发物的荧光竞争结合特性分析发现:Bimp OBP5与挥发物的结合效果最好,属于广谱结合蛋白,其中与β-Ionone、β-phellandrene和β-Ocimene结合较好,Ki值均小于20μM;两种熊蜂的OBP11与Geraniol、2-Nonanone和β-Ionone具有较好的亲和力;北美熊蜂OBP1以及两种熊蜂的OBP10与候选挥发物的结合能力稍弱;此外,两种熊蜂的六个OBPs蛋白都对β-Ionone具有最强的结合活性。（3）熊蜂嗅觉蛋白OBPs与配体的分子对接分析利用意蜂ASP1和ASP5蛋白为模板构建了两种熊蜂嗅觉蛋白OBPs的三维模式图,选择与OBPs蛋白亲和力较高的挥发物进行分子对接,结果表明两种熊蜂的嗅觉蛋白与烯烃类化合物仅存在疏水作用力,而与醇类、酯类和醛类化合物之间还能形成氢键,其中氢键位点包括有北美熊蜂OBP1的Phe115和Val117、OBP5的Thr59和Phe122、两种熊蜂OBP10的Tyr126和Phe128以及两种熊蜂OBP11的Ile118位,推测这些位点可能是熊蜂嗅觉蛋白与花香物质结合的关键氨基酸位点。（4）熊蜂嗅觉蛋白定点突变、原核表达及配体结合实验将北美熊蜂OBP1的Phe115和Val117、OBP5的Thr59和Phe122以及两种熊蜂OBP11的Ile118位氨基酸位点都突变成丙氨酸,体外诱导纯化表达重组蛋白后进行荧光竞争结合特性分析。实验证据表明突变后的蛋白与蜜源植物花挥发物的结合能力均不同程度地下降,Bimp OBP11-Ile118Ala与之前结合较好的6种花挥发物甚至表现为不结合。由此可见,上述嗅觉蛋白的氨基酸位点在熊蜂访花授粉过程中与花香物质结合发挥着关键的作用。（5）熊蜂嗅觉蛋白ORs的理化特性和亚细胞定位分析利用生物信息学对北美熊蜂和欧洲熊蜂的OR1a、OR1b和ORco蛋白的理化性质进行分析,发现六个蛋白均为稳定的脂溶性蛋白,无信号肽结构,含有一个昆虫嗅觉受体ORs的保守结构域7tm-6 superfamily。将欧洲熊蜂的气味受体OR1a、OR1b和ORco分别构建真核表达载体后转染至Sf9细胞中表明了Bter ORco、Bter OR1a和Bter OR1b的重组蛋白表达可能主要定位在细胞膜上。综上所述,两种熊蜂气味结合蛋白OBPs均能不同程度地结合多种农林蜜源植物花挥发物,在熊蜂访花授粉过程中发挥了重要功能,其中Bimp OBP1-Phe115和Val117、Bimp OBP5-Thr59和Phe122、两种熊蜂OBP11的Ile118是熊蜂识别蜜源植物的关键氨基酸位点,研究结果为两种熊蜂定位蜜源植物提供了实验数据支撑,一定程度上揭示了两种熊蜂识别蜜源植物花挥发物的嗅觉分子机理。

关键词：北美熊蜂欧洲熊蜂蜜源植物花挥发物嗅觉蛋白荧光竞争结合实验定点突变细胞定位

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基于PDB卷曲库研究二点委夜蛾普通气味结合蛋白与辛硫磷/毒死蜱的作用机制

基于PDB卷曲库研究二点委夜蛾普通气味结合蛋白与辛硫磷/毒死蜱的...

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作者：朱瑞淮北师范大学

学位级别：硕士

昆虫嗅觉感受系统中的气味结合蛋白（Odorant-binding protein,OBPs）被发现其能通过结合杀虫剂增强昆虫的抗药性,且二点委夜蛾普通气味结合蛋白（General odorant-binding proteins,GOBPs）与常规杀虫剂辛硫磷（Phoxim）和毒死蜱（Chlo... 详细信息

昆虫嗅觉感受系统中的气味结合蛋白（Odorant-binding protein,OBPs）被发现其能通过结合杀虫剂增强昆虫的抗药性,且二点委夜蛾普通气味结合蛋白（General odorant-binding proteins,GOBPs）与常规杀虫剂辛硫磷（Phoxim）和毒死蜱（Chlorpyrifos）具有较强结合能力。二点委夜蛾(Athetis lepigone M（?）schler)是我国北方夏玉米产区多发性害虫,过度依赖化学杀虫剂防治容易引起昆虫抗药性,且会导致环境污染。本研究采用RSFF2C力场结合生物信息和分子生物学方法探索二点委夜蛾AlepGOBPs与辛硫磷和毒死蜱的动态结合机制,以及位点变异导致其抗药性改变的变化规律,为筛选低成本、高选择性的环境友好型农药分子提供重要理论指导和实验依据。首先以AlepGOBP2-Phoxim/Chlorpyrifos为例,分别选择AMBER-ff99SB力场和RSFF2C力场,对两个复合物形成稳定的动态平衡过程进行模拟,结果表明基于PDB卷曲库发展的RSFF2C力场对该蛋白复合物体系能更高效地平衡稳定,且在该力场下复合物体系的动力学和热力学特征也表现出更高的准确性和重复性,这为从原子层面设计针对OBPs关键靶点的高效害虫行为调控剂提供可靠的理论计算依据。对AlepGOBP2-Phoxim/Chlorpyrifos复合物体系的动力学特征和热力学性质分析发现两个杀虫剂能稳定结合在由关键残基Phe12、Ile52、Ile94、和Phe118等形成的AlepGOBP2结合疏水空腔内,且这些非极性氨基酸所参与形成的疏水相互作用是促进AlepGOBP2识别结合两个杀虫剂分子的主要驱动力。尤其热点残基Phe12侧链中的苯环除了参与疏水和烷基-π相互作用的形成,还与配体上的磷原子、苯环或吡啶环形成阳离子-π和π-π堆积作用。该位点在AlepGOBP2-Phoxim复合物的结合自由能(（35）Gbind)和丙氨酸扫描突变能(ΔΔGmut)分别高达-6.31和6.40 k J·mol-1;在AlepGOBP2-Chlorpyrifos体系中也高达-8.83和5.98k J·mol-1。这表明该热点残基Phe12对于AlepGOBP2与辛硫磷/毒死蜱的识别结合至关重要。通过定点突变和荧光竞争结合实验发现突变体F12A、Ile52、I94A和F118A对Phoxim和Chlorpyrifos结合能力相较于野生型均有所下降,其中F12A和I94A与Chlorpyrifos的结合能力与野生型结合能力的P值均小于0.05达到显著水平。对AlepGOBP1-Phoxim/Chlorpyrifos复合物体系构象转变的平衡过程分析发现Phe12、Phe36、Ile52、Ile94、和Phe118等非极性氨基酸对复合物体系结合的也是通过疏水作用实现。其中Phe12侧链中的苯环除了参与的烷基-π和疏水相互作用的形成,还与配体的苯环或吡啶环有π-π堆积相互作用。该关键位点AlepGOBP1-Phoxim中复合物体系结合自由能(（35）Gbind)和丙氨酸扫描突变能(ΔΔGmut)值分别达到-7.59和3.85 k J·mol-1;而在AlepGOBP1-Chlorpyrifos中达到-11.16和8.23 k J·mol-1。这表明关键残基Phe12也是促进上述AlepGOBP1两个复合物体系结合的重要热点。此外残基Phe36的侧链苯环与毒死蜱具有烷基-π、π-σ、阳离子-π和π-π堆积相互作用,且其结合自由能和突变能分别到达-9.02和7.02 k J·mol-1;而残基Phe36与辛硫磷仅有范德华作用、疏水和π-π堆积相互作用,且其结合自由能和突变能均未达到或超过截断值。这表明该位点可作为对AlepGOBP1与毒死蜱的识别结合影响干扰剂的潜在设计靶点,而对AlepGOBP1-Phoxim体系的结合可能具有潜在贡献。通过荧光竞争结合实验发现仅F12A和I94A与辛硫磷的结合能力有所下降,且F12A的结合能力与野生型结合能力的P值小于0.05达到显著水平,其它实验组的结合能力与野生型相比均有不同程度的提升。这是由于AlepGOBP1的C末端螺旋会发生解螺旋,特别是关键位点突变会导致蛋白质结构松弛螺旋完全解开,从而导致实验中突变体蛋白对毒死蜱和辛硫磷的结合能力反而增强。本文通过计算和实验结合的方法发现AlepGOBPs中关键非极性残基所形成的烷基-π和疏水等相互作用力是其与杀虫剂分子稳定结合的主要驱动力,特别是Phe12和Ile94这两个热点残基在AlepGOBPs与辛硫磷/毒死蜱的结合发挥显著的促进作用并与抗性产生相关。这为阐明GOBPs与杀虫剂辛硫磷/毒死蜱相互作用的分子机制以及针对GOBPs关键靶点设计开发高

关键词：分子动力学模拟普通气味结合蛋白荧光竞争结合实验点突变

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连翘脂苷A对乙酰胆碱酯酶的抑制作用

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中华中医药学刊 2022年第3期40卷 178-181,272页

作者：邓培渊袁伟陈龙欣杨莹莹郑州师范学院郑州市生物物种资源研究重点实验室河南郑州450044 华北水利水电大学环境与市政工程学院河南郑州450045

连翘脂苷A(forsythiaside A,FTA)是连翘的主要活性成分,对阿尔茨海默症有一定的疗效。运用荧光竞争结合实验、分子对接、分子动力学模拟和丙氨酸突变扫描等方法分析了连翘脂苷A对乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)的抑制作用和... 详细信息

连翘脂苷A(forsythiaside A,FTA)是连翘的主要活性成分,对阿尔茨海默症有一定的疗效。运用荧光竞争结合实验、分子对接、分子动力学模拟和丙氨酸突变扫描等方法分析了连翘脂苷A对乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)的抑制作用和结合模式。结果显示:连翘脂苷A对AChE有一定抑制作用IC_(50)值为1.11×10^(-7)mol/L,解离常数Ki值为5.5×10^(-8)mol/L,连翘脂苷A经由H键作用结合于AChE的CAS区,两者结合自由能为-98.20 kJ/mol,静电作用力是结合的主要驱动力,Ser200,Phe120和Ser205为两者结合的关键氨基酸。

关键词：连翘脂苷A 乙酰胆碱酯酶荧光竞争结合实验分子动力学丙氨酸突变扫描

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桃蛀螟性信息素结合蛋白CpunPBP3的表达模式及性信息素结合特性

引用

昆虫学报 2021年第3期64卷 318-326页

作者：陈秋应杨喜游东蕊杨沐徐志峰肖伟西南大学植物保护学院昆虫学及害虫控制工程重点实验室重庆400715 西南大学农业科学研究院重庆400715

【目的】本研究旨在对桃蛀螟Conogethes punctiferalis性信息素结合蛋白CpunPBP3进行鉴定和定性分析,完善对桃蛀螟性信息素感受机制的理解。【方法】扩增、分析桃蛀螟CpunPBP3的cDNA序列,并与其他草螟科昆虫的同源蛋白氨基酸序列进行比... 详细信息

【目的】本研究旨在对桃蛀螟Conogethes punctiferalis性信息素结合蛋白CpunPBP3进行鉴定和定性分析,完善对桃蛀螟性信息素感受机制的理解。【方法】扩增、分析桃蛀螟CpunPBP3的cDNA序列,并与其他草螟科昆虫的同源蛋白氨基酸序列进行比较。利用qRT-PCR测定桃蛀螟不同日龄雄成虫触角中CpunPBP3的表达量变化,以及该基因表达的昼夜波动;以性信息素反-10-十六碳烯醛(E 10-16∶Ald)(150 ng)和顺-10-十六碳烯醛(Z 10-16∶Ald)(6 ng)对雄成虫进行诱导,并检测诱导后24 h内不同时间节点时触角中CpunPBP3的表达量。构建重组表达载体pET-30a(+)/CpunPBP 3,通过大肠杆菌Escherichia coli表达获得重组蛋白,并通过荧光竞争实验检测纯化重组蛋白CpunPBP3与上述2种性信息素成分的结合能力。【结果】系统发育分析结果显示,CpunPBP 3与已经鉴定的桃蛀螟PBP基因CpunPBP 2和CpunPBP 5分布在不同分支中,但与其他昆虫物种的PBP基因亲缘关系较近;qRT-PCR结果表明,雄成虫触角中CpunPBP3的表达量在羽化后0-8 d呈先升高后下降的趋势,24 h光周期内17∶00时的表达量显著高于1∶00时的,其余时间节点间的表达量无显著差异;150 ng的E 10-16∶Ald诱导3和6 h后的表达量显著下降,6 ng的Z 10-16∶Ald诱导6和24 h后的表达量显著增加。荧光竞争结合实验结果表明,CpunPBP3重组蛋白与性信息素E 10-16∶Ald和Z 10-16∶Ald均有强结合能力,K i值分别为9.267和8.656μmol/L。【结论】本研究明确了CpunPBP3的核苷酸和氨基酸序列及其表达模式,能够响应性信息素的诱导而表达,而且CpunPBP3重组蛋白能够很好地结合性信息素,表明CpunPBP3是桃蛀螟的一条性信息素结合蛋白。

关键词：桃蛀螟性信息素结合蛋白表达模式昼夜节律原核表达荧光竞争结合实验

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中华蜜蜂气味结合蛋白AcerOBP14的表达及配体结合特性分析

引用

昆虫学报 2021年第2期64卷 178-186页

作者：彭竹黄丽赵淑果吕建华赵慧婷山西农业大学生命科学学院山西太谷030801

【目的】气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)在昆虫寄主定位、产卵地选择等行为中发挥着重要作用,明确中华蜜蜂Apis cerana cerana AcerOBP14与配体的结合特性有助于阐明中华蜜蜂嗅觉识别的分子机制。【方法】通过qRT-PCR测定... 详细信息

【目的】气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)在昆虫寄主定位、产卵地选择等行为中发挥着重要作用,明确中华蜜蜂Apis cerana cerana AcerOBP14与配体的结合特性有助于阐明中华蜜蜂嗅觉识别的分子机制。【方法】通过qRT-PCR测定OBP14在20日龄中华蜜蜂成年工蜂、20日龄中华蜜蜂成年雄蜂、中华蜜蜂采粉蜂和意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica采粉蜂触角中的表达量。构建原核表达载体pET28a/AcerOBP 14,表达并分离纯化重组蛋白AcerOBP14。利用荧光竞争结合实验检测AcerOBP14与37种气味配体化合物的结合特性。【结果】qRT-PCR分析发现,OBP14在中华蜜蜂采粉蜂触角中的表达量极显著高于20日龄中华蜜蜂成年工蜂和雄蜂以及意大利蜜蜂采粉蜂中的。荧光竞争结合实验表明,AcerOBP14与蜂王信息素、告警信息素、那氏信息素及多种植物挥发物都具有结合能力,其中与β-罗勒烯的结合能力最强,解离常数Ki=0.297μmol/L。【结论】AcerOBP14的配体结合谱较宽,暗示其可能参与了中华蜜蜂的多种生理行为反应,且在中华蜜蜂的采粉行为中发挥着重要作用。

关键词：中华蜜蜂气味结合蛋白蛋白纯化气味化合物荧光竞争结合实验

来源：评论

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