检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：章昆扬州大学

学位级别：硕士

许多天然产物和药物都是手性含氧化合物,它们的合成通常依赖于已有官能团或氧化态的多步转化。而选择性C-H键氧化官能团化提供了一种不同的策略来获取这些分子,表现出高效的步骤、原子和氧化还原经济性。然而未活化的(sp3)C-H键氧化反... 详细信息

许多天然产物和药物都是手性含氧化合物,它们的合成通常依赖于已有官能团或氧化态的多步转化。而选择性C-H键氧化官能团化提供了一种不同的策略来获取这些分子,表现出高效的步骤、原子和氧化还原经济性。然而未活化的(sp3)C-H键氧化反应面临着:1)高键能带来的反应活性问题;2)分子中多个化学环境类似的C-H键所引起的化学、区域、立体选择性问题;3)多样化官能团与反应条件兼容性的问题。因此,C-H键的高度选择性氧化在化学上非常具有挑战性。化学策略通常依赖于分子内不同C-H键之间的反应差异或预先引入的导向基团来实现选择性,然而该策略不适用于链状脂肪酸。生物催化(酶)则采用了截然不同的策略:它们进化出底物结合通道,并将底物特定位点固定于反应中心,从而实现较好的区域和立体选择性控制。但是,未激活的脂肪族C-H键的对映选择性羟基化仍然没有太成功的结果。我课题组之前获得了专一催化脂肪族羧酸β位的区域和对映选择性的蛋白工程P450BSβ突变体酶(P450BSβ-L78A/Q85A/V170I/G290I),但是它所适底物极其局限于链长超过10个碳原子的脂肪酸(仅适用于7种底物),无法接受短链脂肪酸以及其它含有官能团的脂肪族羧酸化合物。为拓宽底物范围,我们选择催化效率低的辛酸为底物对P450BSβ酶进行定向进化,筛选到了高转化率和高β位选择性的P450BSβ-L78I/Q85H/G290I/突变体。该突变体将辛酸转化率从15%提高至90%,β位羟基化选择性由33%提高至86%。为探究该突变体酶的合成价值,我们对该酶进行了 0.5mmol制备级反应的底物研究,发现该酶摆脱了对烃链长度的依赖,能够催化C6-C20链长的脂肪酸,同时具有很好的官能团耐受性,展现了优越的反应活性以及高度的区域和对映选择性(Cβ/Cα大于20:1和大于99%的R-对映选择性)。为了进一步阐述该突变体蛋白的反应活性和选择性,我们解析了它与棕榈酸复合物的晶体结构。与野生型蛋白相比,三个氨基酸残基的改变使1)Cβ较Cα更加靠近活性中心;2)β位的pro(R)-H离Fe-O中心较pro(S)-H更近;3)突变体蛋白的反应腔小,更有利于催化短链的羧酸底物。因此该酶在实现高区域和对映选择性的同时,针对短链羧酸的反应活性得到了大大的提高。综上所述,我们对P450BSβ蛋白进行了定向进化改造,并成功应用于各种羧酸β位未活化C-H键的羟基化反应,取得了很好的反应活性、区域和对映选择性以及官能团耐受性。晶体结构分析从机理上阐明了氨基酸残基突变对反应活性和选择性的影响。该工作展现了生物催化在解决具有挑战性的化学反应问题中的潜能。

关键词： P450酶 β-羟基化定向进化脂肪族羧酸蛋白晶体结构

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NbREM1.1蛋白的结构生物学研究

NbREM1.1蛋白的结构生物学研究

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作者：黄晓婧福建师范大学

学位级别：硕士

Remorin（REM）蛋白家族是通过非传统的脂质结合的亲水性蛋白,目前只有在植物中鉴定到remorin蛋白,且大部分定位于植物细胞膜。现在对remorin蛋白家族结构与形态的研究主要是Group1的remorin蛋白。RSV-MP是由水稻条纹病毒（Rice stripe ... 详细信息

Remorin（REM）蛋白家族是通过非传统的脂质结合的亲水性蛋白,目前只有在植物中鉴定到remorin蛋白,且大部分定位于植物细胞膜。现在对remorin蛋白家族结构与形态的研究主要是Group1的remorin蛋白。RSV-MP是由水稻条纹病毒（Rice stripe tenuivirus,RSV）RNA 4负义链编码的一个32.5 k Da的蛋白,主要定位在细胞壁及其周围,能与烟草和水稻中的REM1蛋白互作,协助病毒在细胞间进行运动。本研究利用大肠杆菌表达系统对本氏烟（Nicotiana benthamiana）来源的NbREM1.1截断体NbREM1.1（AA97-207）进行表达。NbREM1.1截断蛋白单独表达时,蛋白几乎不表达。基于RSV-MP与NbREM1.1蛋白在体内存在相互作用,我们尝试了RSV-MP与NbREM1.1截断蛋白进行共表达,发现即便RSV-MP没有可溶表达,但是NbREM1.1截断蛋白有明显表达。我们利用亲和层析和凝胶过滤的方法,纯化获得NbREM1.1截断蛋白。通过X-射线衍射收集数据,利用同晶置换的方法解析并进一步优化得到分辨率2.5?的NbREM1.1截断蛋白分子结构。NbREM1.1截断蛋白每一个晶胞中含有两个分子,为两条反向平行的α螺旋。为探究NbREM1.1蛋白与磷脂结合的可能模式,我们通过斑点杂交实验,验证了NbREM1.1具有基础的磷脂结合能力,结果显示纯化的重组带His标签的NbREM1.1和NbREM1.1-97-207AA都能与Ptd Ins（3,4,5）P3、Ptd Ins（4,5）P2、Ptd Ins（3,4）P2、Ptd Ins（3,5）P2、Ptd Ins（3）P、Ptd Ins（4）P和Ptd Ins（5）P特异性结合,由此推测细胞膜上的磷脂酰肌醇可协助细胞质中remorin蛋白定位于细胞膜。本研究利用X-射线衍射的方法成功解析了本氏烟来源的NbREM1.1截断蛋白三维结构。NbREM1.1截断蛋白的结构不仅丰富了remorin蛋白结构相关的知识体系,为深入研究和表征其他remorin家族成员提供了模型。同时也为应对植物感染RSV疾病设计与开发新型抑制剂提供理论基础。

关键词： NbREM1.1蛋白蛋白晶体结构斑点杂交 RSV-MP蛋白

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基于变形链球菌SMU.2055蛋白晶体结构的防龋小分子化合物的设计与筛选

基于变形链球菌SMU.2055蛋白晶体结构的防龋小分子化合物的设计与...

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2013年全国第四次牙体牙髓病学临床研讨会

作者：陈晓丹邵宏奎赵望泓南方医科大学口腔医学院

目的：针对变形链球菌UA159中SMU.2055蛋白晶体结构进行靶向防龋小分子化合物的设计与筛选.方法：获取靶蛋白—变形链球菌SMU.2055蛋白的三维晶体结构(RCSB ID code rcsb057127;PDB ID code 3LD2)，利用Libdock、Autodock两种程序，通... 详细信息

目的：针对变形链球菌UA159中SMU.2055蛋白晶体结构进行靶向防龋小分子化合物的设计与筛选.方法：获取靶蛋白—变形链球菌SMU.2055蛋白的三维晶体结构(RCSB ID code rcsb057127;PDB ID code 3LD2)，利用Libdock、Autodock两种程序，通过虚拟筛选和精细对接方式，建立与靶蛋白结构相匹配的抑制剂虚拟模型.结果：根据3LD2的晶体结构，通过Libdock、Autodock两种程序进行对比对接打分函数比较，筛选出与靶蛋白结构匹配度最高的五个化合物.结论：该五个化合物可考虑作为靶蛋白的有效配体或药物.Libdock、Autodock两种程序能很好模拟蛋白-抑制剂的结合模式，为基于蛋白结构的防龋新药设计提供了新的理论和方法基础，具有重要的理论研究意义和实用价值.

关键词：变形链球菌蛋白晶体结构药物设计与筛选

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Moenomycin合成途径中关键酶MoeN5和MoeGT1晶体学研究

Moenomycin合成途径中关键酶MoeN5和MoeGT1晶体学研究

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作者：张丽兰中国科学院大学

学位级别：博士

近年来，细菌抗药性问题引起人们的广泛关注，寻找新的抗生素变的非常重要和急迫。莫诺霉素(Moenomycin)是一类由多糖和磷酸脂链构成的抗生素，通过直接抑制细菌细胞壁上肽聚糖基转移酶(Peptidoglycan glycosyltransferases，PGTs)的活... 详细信息

近年来，细菌抗药性问题引起人们的广泛关注，寻找新的抗生素变的非常重要和急迫。莫诺霉素(Moenomycin)是一类由多糖和磷酸脂链构成的抗生素，通过直接抑制细菌细胞壁上肽聚糖基转移酶(Peptidoglycan glycosyltransferases，PGTs)的活性，使细菌细胞壁无法形成而死亡，是目前发现的唯一可直接作用于PGTs的天然产物，具有很强的抑菌和杀菌能力。Moenomycin长期运用于动物饲料添加剂的过程中发现动物体内无微生物对其产生抗药性，动物实验显示它的半数致死量是600-800mg/kg，具有低毒高效的特点。但是，Moenomycin从发现至今一直没有被用于临床，是因为它有很差的药代动力学特性，半衰期长，水中溶解度低，不易被生物体吸收利用。所以改造Moenomycin及其衍生物使其成为可被人类利用的有效抗生素是Moenomycin未来研究的目标。　　本课题研究的两个酶MoeGT1和MoeN5是Moenomycin生成途径中的两个关键蛋白。MoeGT1是一种糖基转移酶(Glycotransferase，GTs)，它的作用是以Moenomycin合成途径中的第一个酶MoeO5的产物2-(Z，E)-法尼基-3-磷酸甘油(2-(Z，E)-Farnesyl-3-phosphoglycerate，FPG）为底物，转移UDP-半乳糖醛酸(UDP-galacturonic acid,UDP-GalUA)的半乳糖到FPG的磷酸基的过程。Moenomycin的结构共有五个糖基，在与PGTs结合时起到定位的作用，而MoeGT1是合成这些糖的第一个糖的反应，也是最关键的一个糖。MoeN5是一种异戊烯基转移酶(Prenyltransferase，PTs)，它的作用是在MoeO5和MoeGT1的基础上，经过一些酶的修饰反应，以3-糖基-FPG和牻牛儿焦磷酸(geranyl pyrophosphate，GPP)为底物，形成C25的Moenomycin中间体的反应，有研究表明，Moenomycin的碳链长短与其抗菌效果成正相关。所以解析MoeGT1和MoeN5的蛋白结构，研究其作用机理，对改造Moenomycin，研发可被机体利用的抗生素具有重要意义。　　MoeN5以头-碰-中的方式反应，形成一个甲基化的C25的产物，在目前已解析的异戊烯基转移酶中，尚无类似的结构被报道，与其结构最相似的为头-碰-尾式的双牻牛儿焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPs)，相似度只有16％。在本课题研究初期，通过硒代培养的方法引入重原子，使用单波长异常衍射的方法（Single-wavelength anomalous diffraction，SAD）解析了MoeN5的初级结构，但是因为晶体分辨率差，电子云密度图不完整，只能看到大致的构象，无法解释蛋白与底物及底物类似物的作用。本论文尝试了MoeN5与不同的蛋白融合表达并共结晶，最后在MoeN5的C末端融合有DNA结合蛋白Sso7d时经过镍柱亲和层析和脱盐柱层析两步纯化得到纯度较高的可用于结晶的蛋白，本论文中命名这个融合蛋白为M-SSO-C。对这个蛋白进行结晶初筛得到了一个结晶条件PEG/Ion screen45(20％PEG3350，0.2M Li3-citrate，pH8.1)，对这个晶体条件进行优化，得到结晶的最佳条件为25％PEG3350，0.2M Li3-citrate，0.3M NaCl，pH8.1。对优化好的晶体在台湾同步辐射中心进行X光晶体衍射收集数据，抗冻剂条件为0.3M Li3-citrate，0.4M NaCl，27％PEG3350，5％glycerol，pH8.1，收集到一组分辨率为2.21(A)，空间群为C222的数据，并以已经解析的没有融合Sso7d的MoeN5的结构为模板，使用分子置换(Molecular replacement，MR)的方法解析出融合蛋白M-SSO-C的蛋白结构。使用晶体浸泡小分子的方法解析了M-SSO-C与MoeN5的底物GPP和3-糖基-FPG的两个类似物FQ1和FQ2的复合体结构，也解析了与带有麦芽糖基的十二烷基麦芽糖(n-Dodecyl maltoside，DDM)，十烷基麦芽糖(n-Decyl maltoside，DM)，十一烷基麦芽糖(n-Undecyl maltoside，UM)和带有葡萄糖基的辛烷基葡萄糖(n-Octyl glucoside，OG)，壬烷基葡萄糖(n-Nonyl glucosideNG)的复合体结构。其中与NG和DDM的复合体数据为I222空间群。　　MoeN5结晶状态下以二聚体状态存在，每个单体由12个α螺旋构成，依次命名为A-L，二聚体主要以E，F，G三个螺旋相互作用

关键词：抗生素莫诺霉素合成途径 MoeN5酶 MoeGT1酶蛋白晶体结构

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Bax蛋白结构及相关共晶结构研究进展

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国际生物医学工程杂志 2018年第2期41卷 187-191页

作者：侯沁莲董辉杜利清中国医学科学院北京协和医学院放射医学研究所天津300192

细胞凋亡包含多种信号通路途径,其中内在信号通路为线粒体凋亡途径,是由信号分子引起Bax等促凋亡因子活化转移至线粒体外膜形成蛋白性孔道,改变线粒体膜通透性,释放细胞色素C,激活下游caspase-9而诱导凋亡起始.针对相应使用小分子起始... 详细信息

细胞凋亡包含多种信号通路途径,其中内在信号通路为线粒体凋亡途径,是由信号分子引起Bax等促凋亡因子活化转移至线粒体外膜形成蛋白性孔道,改变线粒体膜通透性,释放细胞色素C,激活下游caspase-9而诱导凋亡起始.针对相应使用小分子起始凋亡研究Bax结构在凋亡中结构的具体变化,结果发现,Bax蛋白结构C端S184附近有一疏水口袋结构,可结合某些小分子物质特异性去除磷酸化S184,调节Bax蛋白促进凋亡活性.目前,Bax蛋白核磁结构已获得,晶体结构未见.其与Bcl-2家族中其他蛋白形成共晶结构已有析出,可用于研究蛋白间的相互作用,了解凋亡时异源二聚体形成中具体结构、位点等的变化.旨在通过Bax核磁结构解析Bax蛋白,得到诱导细胞凋亡中位点变化从而促进凋亡起始.

关键词： Bax蛋白 Bax蛋白结构蛋白晶体结构

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苯醌还原酶Ⅱ型与天然类黄酮化合物Apigenin复合物的蛋白晶体结构研究

苯醌还原酶Ⅱ型与天然类黄酮化合物Apigenin复合物的蛋白晶体结构...

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第十三届中国科协年会生物医药博士论坛

作者：李亚卓刘昌孝天津药物研究院释药技术与药代动力学国家重点实验室英国诺丁汉大学药学院

苯醌还原酶Ⅱ型于1961年发现,之后其序列、组织分布和生理功能被广泛研究。传统观点认为,因其序列和结构与苯醌还原酶Ⅰ型十分类似,Ⅱ型酶具有与Ⅰ型酶类似的催化苯醌类化合物双电子还原反应而发挥脱毒、保护机体的作用。但是该观点近... 详细信息

苯醌还原酶Ⅱ型于1961年发现,之后其序列、组织分布和生理功能被广泛研究。传统观点认为,因其序列和结构与苯醌还原酶Ⅰ型十分类似,Ⅱ型酶具有与Ⅰ型酶类似的催化苯醌类化合物双电子还原反应而发挥脱毒、保护机体的作用。但是该观点近期受到了实验观察的挑战,研究发现,苯醌还原酶Ⅱ型也有可能激活醌类化合物,产生自由基而损伤机体。尽管对于Ⅱ型酶的研究十分广泛深入,而对于Ⅱ型酶,特别是其复合物结构的认识却非常有限。本文致力于苯醌还原酶Ⅱ型复合物结构探索,揭示小分子配基与酶结合模式和关键位点,进而为计算机高通量对接筛选小分子化合物库发现候选药物提供有效的结构信息。

关键词：苯醌还原酶Ⅱ型蛋白晶体结构

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调控水稻光敏不育基因的pms3的RNA二级结构测定和RPA3017蛋白的晶体结构研究

调控水稻光敏不育基因的pms3的RNA二级结构测定和RPA3017蛋白的晶...

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作者：杨雪菲华中农业大学

学位级别：硕士

农垦58S为光温敏雄性核不育水稻品种,其在长日高温下不育、在短日低温下可育,是水稻育种中两系法的重要种质资源。前人已对控制这种光敏感核不育的基因进行了遗传定位与分析,研究发现pms3是直接导致农垦58S与农垦58育性分离的基因,分离... 详细信息

农垦58S为光温敏雄性核不育水稻品种,其在长日高温下不育、在短日低温下可育,是水稻育种中两系法的重要种质资源。前人已对控制这种光敏感核不育的基因进行了遗传定位与分析,研究发现pms3是直接导致农垦58S与农垦58育性分离的基因,分离克隆后对其进行初步功能研究发现pms3的候选基因transcript-1不编码蛋白质而是转录成为long non-coding RNA(lnc RNA),在58S与58N中仅有一个SNP的差别。pms3的trascript-1转录出的RNA并不翻译蛋白质,所以研究其发挥功能的机理可以通过研究其作为mi RNA对下游的核酸或蛋白质互作起到的调控育性的作用,或者依靠研究其作为lnc RNA折叠出二级结构然后与蛋白质相互作用从而发挥的功能。RNA的二级结构可以利用软件预测和实验探测两种方法来研究,本研究用了多种预测RNA二级结构的软件,对transcript-1的全长以及截短部分结构进行了预测,并且在实验方法上用引物扩增法分析二羟基酰化(SHAPE)以及其他化学方法测定transcript-1转录的lnc RNA的二级结构,试图分析结构对其功能发挥的作用,以及其在SNP周围以及mi RNA识别位点和剪切位点处的结构特点。微生物系统中信号的传导主要由双组分体系(Two-component system,TCS)来介导的。它可以引起细胞内对各种环境信号产生响应。双组分体系中的第二个原件是一个反应调节因子(Response Regulator,RR)这个调节因子含有一个保守的天冬氨酸残基,另一个原件是组氨酸激酶(Histidine Kinase,HK),当组氨酸激酶自磷酸化后可以将磷酸基团传递到反应调节因子的天冬氨酸上。光合细菌沼泽红假单胞菌(***)可以在低光强下进行光合作用,这一行为受到了两个串联的红光感受器细菌光敏色素Rp Bph P2和Rp Bphp3的调控。Rp Bph P2和Rp Bphp3感受到红光信号之后,C端的HK结构域就会进行自磷酸化,然后将磷酸基团进一步传递给反应调节因子RPA3017进而来调控下游的细胞内响应活动。同时RPA3017还与编码调控光合作用的LH4复合体的基因puc BAd串联,LH4复合体的产生受到红光信号的调控,因此与RPA3017的调控有密不可分的关系。为了在分子层面上理解磷酸基团是如何在Rp Bph P2/Rp Bphp3和RPA3017之间传递的,解析了RPA3017的晶体结构,分辨率为1.8?。RPA3017拥有Rossmann折叠,形成经典的Che Y型RR的(β/α)5结构。基于结构的解析以及同源建模,进一步鉴定了RPA3017接收磷酸基团的天冬氨酸Asp70附近表面的结构,这一部分直接与其上游互作蛋白Rp Bph P2和Rp Bph P3的HK结构域接触。这一结果为双组分系统中的两个组分之间的是如何在分子水平上特异性识别互作的提供了结构学的理论依据。

关键词：水稻光敏雄性不育 long non-coding RNA RNA二级结构双组分系统反应调节因子蛋白晶体结构

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植物辅抑制因子TPL/TPR蛋白结构与EAR基序相互作用分子机理研究

植物辅抑制因子TPL/TPR蛋白结构与EAR基序相互作用分子机理研究

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作者：马洪磊中国科学院上海药物研究所

学位级别：博士

TOPLESS(TPL)和TOPLESS-related蛋白(TPL/TPR)是一类保守的植物转录辅抑制因子家族蛋白,它们与酵母中Tup1,昆虫的Groucho,以及哺乳动物TLE(transducin-like enhancer of split)等转录辅抑制因子同源。在植物中,TPL/TPR转录辅抑制因子通过与乙烯反应因子相关的反应抑制基序(EAR基序)相互作用而调节植物体广泛的生理活动,包括发育,应激反应以及信号通路调节等一系列生理生化过程。一直以来,人们对转录辅抑制因子TPL/TPR与EAR基序相互作用机制非常感兴趣,但是这种相互作用的机制一直没有得到阐述。本研究确定了TPL家族辅抑制因子保守N末端,即TOPLESS结构域(TPD),能够与EAR基序相互作用。为了了解TPD结构域与EAR基序相互作用机制,我们解析了水稻Apo TPR2 TPD(OsTPR2 TPD)以及该蛋白与拟南芥茉莉酮酯酸信号通路(JAZ)中接头蛋白NINAJ蛋白多肽(NINJA多肽),植物生长激素反应因子(Auxin)1AA1、IAA10蛋白多肽(IAA1,IAA10多肽)复合物的晶体结构。这三种多肽包含标准Lx Lx L类型EAR基序,是抑制因子蛋白与辅抑制因子TPL/TPR蛋白相互作用关键蛋白基序。生理活性状态下,OsTPR2 TPD蛋白是四聚体。TPD单体是由九个α螺旋组成,TPD单体分子通过螺旋间相互作用形成两个界面,界面2由螺旋α6、α7、α8构成,以一种新的折叠方式形成二聚体;界面1由蛋白N末端和C末端构成,N端有锌指结构,界面1介导二聚体二聚化组成TPD类似拉伸圆盘四聚体生理活性结构。这三种Lx LxL类型EAR基序与OsTPR2 TPD结合模式相同,以疏水键为主要相互作用结合TPD单体CTLH口袋(α5、α6、α7、α8组成)。序列分析和基于结构突变分析揭示了这种EAR基序结合模式非常保守,可能是EAR基序结合辅抑制因子一般结合模式。该复合物结构解析为LxLx L类型EAR基序抑制因子和辅抑制因子相互作用提供了一个通用机制。D53蛋白是独角金内酯信号通路中转录抑制因子,D53蛋白与转录辅抑制因子TPL/TPR相互作用,并且这种相互作用在植物发育和激素的信号传导中发挥重要的作用。D53属于新发现蛋白,对其研究处于初级阶段。氨基酸序列分析预测D53蛋白有三个可能的Lx Lx L类型EAR基序,而通过实验验证只有第二个EAR基序与TPL/TPR TPD蛋白相互作用,其他两个EAR基序与TPL/TPR TPD蛋白无相互作用,我们把能与TPL/TPR TPD蛋白相互作用D53蛋白EAR基序命名为D53多肽。D53多肽也是一种Lx Lx L类型EAR基序,我们解析了OsTPR2TPD蛋白和D53多肽复合物晶体结构。通过结构分析,D53多肽EAR基序结合四聚体OsTPR2 TPD每个单体疏水性口袋,与JAZ和Auxin信号通路中NINJA、IAA1、IAA10多肽EAR基序有相同的结合模式;但是D53多肽与OsTPR2 TPD复合物结构显示,D53多肽与TPD还有新的相互作用位点。新作用位点在靠近OsTPR2 TPD蛋白的锌指结构附近,即OsTPR2 TPD蛋白LisH基序(α1、α2、α9组成),D53多肽两个结合位点介导OsTPR2 TPD蛋白四聚体之间的相互作用。通过大量结构分析和突变分析证实了D53多肽EAR基序与OsTPR2 TPD有两个不同的结合位点,两个作用位点的生理学意义是介导了OsTPR2 TPD蛋白的四聚体的寡聚化。此外,我们还证实了OsTPR2 TPD蛋白能与核小体存在相互作用,相互作用的位点是核小体组蛋白H3和H4的尾部多肽。D53多肽能促进OsTPR2 TPD蛋白的寡聚,而OsTPR2 TPD蛋白寡聚能够稳定与核小体之间的相互作用。D53多肽EAR基序与OsTPR2 TPD蛋白复合物晶体结构的解析,为我们提供了辅抑制因子TPL/TPR与抑制因子新的结合模式,即通过介导OsTPR2TPD蛋白之间的寡聚化来稳定OsTPR2 TPD蛋白与核小体相互作用,重构染色质。D53蛋白有可能在介导TPL/TPR染色质重构以及基因沉默方面发挥重要的作用。D53蛋白这一功能的发现加深了我们对基因调节方面的理解。

关键词： TOPLESS和TOPLESS-related(TPL/TPR蛋白) 转录辅抑制因子 OsTPR2 TPD 蛋白晶体结构 LxLxL EAR基序 NINJA,IAA1,IAA10多肽 D53多肽核小体组蛋白H3和H4 染色质重构

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人源20S蛋白酶体激活因子REGγ结构与功能研究

人源20S蛋白酶体激活因子REGγ结构与功能研究

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作者：李平南开大学

学位级别：博士

蛋白酶体是普遍存在于古菌，真核生物以及一些细菌中的一种降解蛋白质的复合物，在细胞的生命活动中起着重要的作用。目前关于蛋白酶体激活机制的研究主要包括两个方面:泛素化及ATP依赖的蛋白酶体激活途径;非泛素化及ATP依赖的蛋白酶体... 详细信息

蛋白酶体是普遍存在于古菌，真核生物以及一些细菌中的一种降解蛋白质的复合物，在细胞的生命活动中起着重要的作用。目前关于蛋白酶体激活机制的研究主要包括两个方面:泛素化及ATP依赖的蛋白酶体激活途径;非泛素化及ATP依赖的蛋白酶体激活途径。　　Smurf1与Smurf2是泛素-蛋白酶体途径中的一种泛素连接酶E3，属于C2-WW-HECT家族的泛素连接酶，在蛋白质泛素化中起着重要的作用，同时在骨的分化以及RhoA信号转导中也起着关键的作用。Smurf2中的C2结构域与HECT结构域通过分子内的相互作用而抑制其自身的连接酶活性，但是关于Smurf1-C2结构域的功能还不是很清楚。因此本论文通过结构生物学对Smurf1-C2结构域进行研究，为以后更深入了解其重要功能奠定了基础。　　REG家族是一种不依赖于泛素化及ATP激活蛋白酶体酶活性的蛋白酶体激活因子，通过结合到桶状蛋白酶体的末端来激活其特异的蛋白酶活性。其中REGγ只能特异性的激活蛋白酶体降解碱性氨基酸形成的肽键，而且是目前发现的唯一一种能激活蛋白酶体降解完整蛋白（如p21，SRC-3）的激活因子。所研究的Smurf1蛋白是最近被报道通过REGγ-蛋白酶体途径进行降解的。同时REGγ在细胞周期，细胞凋亡，病毒感染，癌症的发生及其他人类疾病中都起着重要的作用。因此通过结构生物学的手段对REGγ进行研究，进而揭示出REGγ激活蛋白酶体的重要机制。　　本论文的第一部分的研究内容是对Smurf1-C2结构域进行了晶体学及细胞功能学的研究，通过X射线衍射获得并解析了分辨率为2(A)的Smurf1-C2三维结构。其空间结构由典型的反平行β片层组成，并结合有两个硫酸根离子以及一个氯离子，通过对顶端硫酸根结合位点的分析，发现两个重要的氨基酸残基:K28与K85。继而通过定点突变及细胞定位实验证明:Smurf1-C2结构域对于Smurf1在细胞中的定位起着非常重要的作用，并非像Smurf2-C2对Smurf2-HECT的分子内自抑制作用;同时证明Smurf1-C2与细胞膜的结合方式是非钙离子依赖型的。　　本论文的第二部分的研究内容为解析了分辨率为3(A)的REGγ七聚体的结构，同时解析了突变体REGγ-linker的结构，即用人工六肽(GAVSAG)来取代REGγ蛋白序列中60位到107位的氨基酸残基。通过对REGγ-linker结构分析，蛋白酶体的激活实验以及细胞定位实验表明:60位到107位柔性区不影响REGγ的空间结构及对蛋白酶体酶活性的激活，但使RE研的定位从细胞核中转移到了细胞质中，揭示出该区域含有核定位信号。　　本论文的第三部分的研究内容是对突变体REGγ-linker(K188E)结构进行了解析，通过对其结构分析以及与REGγ结构的比对发现蛋白酶体激活区域(143位到152位氨基酸残基)和结合蛋白酶体的C末端均发生了重要的构象变化:E链和D链中150位的甘氨酸构象都发生了改变。通过定点突变及蛋白酶体激活实验证明，150位的甘氨酸以及148位的谷氨酸在REGγ激活蛋白酶体酶活性中起着非常关键的作用，同时研究还进一步揭示出REGγ具有不同于低等生物中蛋白酶体激活因子PA26激活蛋白酶体的机制。　　本论文的研究结果为以后关于Smurf1在细胞生命活动中的功能研究提供了理论基础，同时为研究REGγ激活蛋白酶体酶活性的详细机制以及REGγ在细胞中重要的生物学功能提供了结构上重要的依据。

关键词：蛋白酶体细胞定位蛋白晶体结构激活机制信号转导

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人类分泌蛋白SI-CLP的功能和结构研究

人类分泌蛋白SI-CLP的功能和结构研究

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作者：孟赓北京大学

学位级别：博士

人类分泌蛋白SI-CLP（Stabilin-1 Interacting Chitinase-Like Protein）是最新发现的类几丁质酶家族成员，包含一个Glyco-18蛋白结构域。SI-CLP的分泌是通过与内吞受体stabilin-1相互作用而介导的。已有的研究表明，SI-CLP在巨噬细胞... 详细信息

人类分泌蛋白SI-CLP（Stabilin-1 Interacting Chitinase-Like Protein）是最新发现的类几丁质酶家族成员，包含一个Glyco-18蛋白结构域。SI-CLP的分泌是通过与内吞受体stabilin-1相互作用而介导的。已有的研究表明，SI-CLP在巨噬细胞和中性粒细胞中是高表达的，并且SI-CLP的表达受到二型辅助性T细胞分泌的细胞因子白细胞介素4和糖皮质激素的上调。这些证据表明人类分泌蛋白SI-CLP可作为临床糖皮质激素治疗过程中产生副作用的标志性蛋白分子，并且可能参与到固有免疫性疾病发生和调节过程中。　　但是在过去的研究中，对于SI-CLP与固有免疫性疾病的关系以及和固有免疫之间的关系依然没有得到阐述，有待于深入研究。　　本论文的研究发现，SI-CLP蛋白在骨关节炎和风湿性关节炎病人的关节渗出液中有较高的表达。在诱导关节炎大鼠模型中，重组SI-CLP蛋白注射能够显著的加重了大鼠关节炎的发生症状。进一步RT-PCR以及ELISA实验证据结果表明，SI-CLP能够特异性的与巨噬细胞作用，并且会促进炎症细胞因子白细胞介素1beta的高表达。本文的研究表明，分泌蛋白SI-CLP通过对巨噬细胞的特异性作用，提高了炎症因子的表达，进而加重了关节炎的炎症反应。　　为了进一步解释SI-CLP的功能，本文利用X射线晶体学的方法解析了SI-CLP的晶体结构。SI-CLP的结构呈典型的类磷酸丙糖异构酶（Triose-phosphate isomerase）桶装结构，并且在蛋白表面有一个特殊的窄沟。通过和其他类几丁质酶蛋白进行结构比对发现SI-CLP的窄沟更加开放。本研究通过等离子表面共振（SPR）的方法的方法检测了SI-CLP对不同单糖结合活性的强弱，结果表明，氨基葡萄糖和氨基半乳糖结合活性最强。随后本文使用ITC的方法检测了SI-CLP对葡萄糖胺三聚糖、乙酰葡萄糖胺三聚糖、乙酰葡萄糖胺四聚糖和乙酰葡萄糖胺五聚糖的结合常数。通过比较我们发现SI-CLP对乙酰葡萄糖胺四聚糖的结合最强。LPS是革兰氏阴性菌细胞外膜的主要成分，它可以非特异性地激活机体免疫的淋巴细胞和巨噬细胞，由于LPS的组成部分包括一个多糖核心，因此本文检测了SI-CLP与LPS的结合情况。结果表明SI-CLP能够与LPS结合，并且进一步研究发现SI-CLP可以通过结合LPS而来抑制LPS引起的炎症反应。　　综上所述，本文的研究证明了SI-CLP在固有免疫性炎症和LPS诱导的炎症过程中具有的免疫调节作用，初步解释了SI-CLP在固有免疫性疾病和在病原入侵诱导的炎症反应中的生物学功能。

关键词：分泌蛋白关节炎固有免疫蛋白晶体结构糖结合

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