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华东理工大学学报（自然科学版） 2020年第4期46卷 526-532页

作者：李冰丛自豪肖希勉武月铭刘润辉华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室超细材料制备与应用教育部重点实验室教育部医用生物材料工程研究中心材料科学与工程学院上海200237

为提高蛋白在冻干过程中的稳定性,采用双(三甲基硅基)氨基锂(LiHMDS)引发的超快速氨基酸环内酸酐(NCA)开环聚合方法,制备了聚L-赖氨酸(PLL)均聚物和聚L-谷氨酸(PLG)均聚物。以β-半乳糖苷酶(β-Gal)为模型蛋白检测氨基酸均聚物在冻干过... 详细信息

为提高蛋白在冻干过程中的稳定性,采用双(三甲基硅基)氨基锂(LiHMDS)引发的超快速氨基酸环内酸酐(NCA)开环聚合方法,制备了聚L-赖氨酸(PLL)均聚物和聚L-谷氨酸(PLG)均聚物。以β-半乳糖苷酶(β-Gal)为模型蛋白检测氨基酸均聚物在冻干过程中对蛋白的保护效果,结果表明两种氨基酸均聚物的共混物对蛋白有保护效果,冻干后未添加氨基酸共混物保护剂的蛋白活性仅剩38%,添加氨基酸共混物保护剂的蛋白活性明显提升到77%,表明氨基酸共聚物能够在冻干过程中保护蛋白,显著提高蛋白稳定性。本文方法操作简单,可快速合成氨基酸聚合物并高效筛选蛋白稳定剂。

关键词：氨基酸聚合物 NCA聚合蛋白稳定性半乳糖苷酶冻干

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DLFs转录因子蛋白稳定性及相关生物学功能的研究

DLFs转录因子蛋白稳定性及相关生物学功能的研究

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作者：刘宁华东师范大学

学位级别：博士

KLFs家族是一类高度保守的、含锌指结构的蛋白质,通过调节富含GC的启动子的表达,在细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、血管生成、淋巴管生成、个体发育、肿瘤生成及胚胎干细胞发育等过程中发挥着重要作用。目前已经发现17个家族成员,每个... 详细信息

KLFs家族是一类高度保守的、含锌指结构的蛋白质,通过调节富含GC的启动子的表达,在细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、血管生成、淋巴管生成、个体发育、肿瘤生成及胚胎干细胞发育等过程中发挥着重要作用。目前已经发现17个家族成员,每个成员在细胞中的生物学功能并不相同。越来越多的报道指出KLFs蛋白的表达异常与多种肿瘤的发生相关,但是具体的分子机制仍有待于进一步的研究。其中KLF2、KLF4、KLF5在生理及病理过程中如细胞增殖、干细胞自我更新与分化、脂肪细胞的分化及肿瘤的发生等过程中发挥着重要作用,近年来,KLF2、KLF4、KLF5已经成为了KLFs家族中的研究热点。已有文献报道KLF5在脂肪细胞分化、干细胞分化及自我更新中有十分重要的功能,而且能够促进许多肿瘤细胞如结肠癌、乳腺癌细胞的增殖并抑制细胞凋亡,被认为是一种致癌基因；KLF2在T淋巴细胞的迁移过程中起着重要的作用,还能够抑制脂肪细胞的分化,调节胚胎干细胞的自我更新；缺失KLF2、KLF4及KLF5,胚胎干细胞的全能性及自我更新的能力会丧失。因此研究它们在细胞内的稳定性对于维持机体正常的生物学功能有着重要的意义。然而到目前为止,关于KLFs的报道大多集中在其转录水平的调控研究,对其蛋白质水平的修饰及分子机制的研究报道较少。因此,研究KLFs家族蛋白稳定性及相关生物学功能对于理解肿瘤发生过程,胚胎个体发育及相关疾病的治疗都有着重要的意义。\n SCFFbw7是近年来报道的在肿瘤发生、细胞增殖及分化过程中起重要作用的泛素连接酶。SCFFbw7是由Fbw7、SKP1及CUL1蛋白组成的复合体,能够与底物特异的结合并通过泛素化依赖的蛋白酶体途径介导靶蛋白的降解。其中,Fbw7(又名FBXW7,CDC4,Sel10,Ago)是一个从酵母到哺乳动物中都高度保守的F-box蛋白,能够通过识别底物上保守的CPD降解信号肽:S/TPXXT/D/E来降解靶蛋白。越来越多的证据表明Fbw7是一个重要的肿瘤抑制因子,在细胞增殖、分化及生长过程中起着非常重要的作用。Fbw7能够降解许多与细胞生长及增殖密切相关的蛋白,比如c-Myc、Cyclin E、Notch及c-Jun等。在许多肿瘤如乳腺癌、肠癌、胃癌、肺癌等,Fbw7发生突变或缺失,导致一些癌蛋白如c-Mvc,c-Jun等在细胞内聚集而使细胞生长失控,最终促使肿瘤的形成。尽管近年来Fbw7作为肿瘤抑制因子的生物功能得到了广泛的研究,但其抑制肿瘤发生的具体分子机制及其新的生物学功能仍然有待于进一步研究。\n 在本论文中,我们运用生物信息学、细胞生物学、分子生物学的技术筛选鉴定了调控KLF5、KLF2蛋白降解的一种新的E3连接酶即肿瘤抑制因子Fbw7。本课题重点研究了KLF5蛋白稳定性,从生化、细胞、分子水平上研究了Fbw7调控KLF5蛋白降解的具体分子机制及新的生物学功能；同时也初步研究了Fbw7调控KLF2蛋白降解的分子机制。\n 本论文主要分成以下几部分:\n 一、Fbw7调控KLF5及KLF2蛋白的稳定性研究1.我们通过生物信息学的方法,运用Scansite软件对KLFs蛋白进行序列扫描,发现转录因子KLF2,KLF5含有典型的Fbw7降解信号肽CPD即S/TPXXT/D/E。提示我们,它们有可能被Fbw7降解。\n 2.研究外源的Fbw7对KLF5及KLF2蛋白水平的调控。我们在293T细胞中分别共表达KLF2、KLF4、KLF5及Fbw7、β-rrCP1、Fbw2、Fbw5、Fbw8等一系列E3泛素连接酶,利用Western Blot技术证明只有Fbw7能够明显抑制KLF2及KLF5蛋白水平的表达,对KLF4蛋白水平的影响较小。这种降解是剂量依赖的,且是能够被蛋白酶体抑制剂MG132所抑制的。而且我们还利用流式细胞仪的技术进一步验证了Fbw7确实能够降解KLF2、KLF5蛋白水平的表达,而且这种降解同样能够被MG132所抑制,提示Fbw7降解KLF2、KLF5可能是通过蛋白酶体途径降解。\n 3.研究内源的Fbw7对KLF5蛋白水平的调控。过表达Fbw7后,利用免疫荧光技术检测Hela细胞内源KLF5蛋白水平的变化。用siFbw7抑制Hela细胞内源Fbw7表达后,再用RT-PCR,Western Blot检测mRNA和蛋白水平上KLF5表达的变化,发现KLF5的mRNA水平没有什么变化,但是蛋白水平表达明显升高。利用Pulse chase同位素标记实验检测内源KLF5的半衰期,发现抑制内源Fbw7表达后,KLF5的半衰期明显延长。利用免疫荧光、Western Blot检测HCT116 Fbw7-/-,DLD1Fbw7-/-两种缺失细胞及HCT116,DLD1野生型细胞中的KLF5蛋白水平,发现缺失F

关键词： DLFs转录因子 KLFs家族蛋白稳定性 SCFFbw7 泛素连接酶结肠癌肿瘤发生

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骨架蛋白IQGAP1与AurorA-A激酶相互作用并增强其蛋白稳定性

骨架蛋白IQGAP1与AurorA-A激酶相互作用并增强其蛋白稳定性

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作者：尹宁北京协和医学院中国医学科学院北京协和医学院清华大学医学部中国医学科学院

学位级别：博士

IQGAP1是一种进化保守的多结构域蛋白，它是到目前为止IQGAP(IQ-domainGTPase-activatingprotein)蛋白家族三个成员IQGAP1、IQGAP2和IQGAP3中被研究的最多也是最深入的一员，IQGAP1于1994年首次被克隆出。其独特的分子结构赋予了IQGAP1... 详细信息

IQGAP1是一种进化保守的多结构域蛋白，它是到目前为止IQGAP(IQ-domainGTPase-activatingprotein)蛋白家族三个成员IQGAP1、IQGAP2和IQGAP3中被研究的最多也是最深入的一员，IQGAP1于1994年首次被克隆出。其独特的分子结构赋予了IQGAP1多种功能，从而使其成为细胞黏附、细胞迁移、细胞外信号转导及细胞分裂等多种功能活动的重要调控分子。研究发现，许多人类组织中都能检测到骨架蛋白IQGAP1的表达。在细胞中，IQGAP1能通过与多种细胞信号通路中重要蛋白分子相互作用，这些相互作用使得IQGAP1能够参与调控许多细胞内及细胞外事件。目前越来越多的研究发现，IQGAP1在肿瘤的发生发展中扮演着越来越重要的角色。因此，IQGAP1对肿瘤的研究具有十分重要的意义。<br>　　本研究中，我们在肿瘤细胞内发现了一个新的可以与IQGAP1相结合的蛋白分子-Aurora-A。Aurora-A定位于人类染色体20q13，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族-Aurora家族的成员之一，到目前为止该蛋白激酶家族共分为三类：Aurora-A、Aurora-B和***丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族在中心体成熟、分离，双极纺锤体组装，染色体分离和胞质分裂过程中都发挥重要作用。Aurora-A作为一个重要的癌基因，其编码的蛋白在多种人类肿瘤中都存在过表达的现象，如结肠癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌以及食管癌等。我们验通过体外实验研究发现，GST-Aurora-A融合蛋白可以结合细胞内源性IQGAP1蛋白。同时免疫共沉淀实验也发现在HeLa细胞中，内源性Aurora-A与IQGAP1蛋白也可以相互作用。在乳腺癌MCF-7细胞中瞬时过表达IQGAP1可以引起Aurora-A蛋白水平的增高和激酶活性的增加。进一步的研究还发现，在IQGAP1过表达的细胞中，Aurora-A蛋白的半衰期延长、稳定性增加、其与后期促进复合体(theanaphasepromotingcomplex/cyclosome)中的各个组成蛋白(APC2、CDC27和CDH1)之间的相互作用也明显减弱。与此同时瞬时特异性敲降MCF-7细胞内源性IQGAP1的表达可以有效的降低细胞内Aurora-A的蛋白水平。但是通过逆转录PCR以及实时荧光定量PCR实验研究发现，特异性敲降细胞内IQGAP1并不能引起Aurora-AmRNA水平的变化。这一结果提示，IQGAP1对Aurora-A的调控主要体现在转录后水平。由于过表达IQGAP1可以增强肿瘤细胞的增殖能力，因此本实验利用Aurora-AsiRNA特异性敲降IQGAP1过表达MCF-7细胞中内源性Aurora-A发现，Aurora-AsiRNA可以有效的抑制由IQGAP1过表达引起的细胞增殖。此结果提示我们，IQGAP1有可能通过影响细胞内Aurora-A的水平和活性，参与调控肿瘤细胞的增殖。<br>　　综上所述，IQGAP1可以通过调节细胞内Aurora-A的蛋白稳定性及激酶活性，参与细胞增殖，从而影响肿瘤的发生发展。<br>　　真核细胞中细胞分裂周期是一个严格调控、高度有序的过程，细胞的有丝分裂对肿瘤细胞的扩增起着关键的调节作用，有丝分裂的偏差会导致基因组不稳定，从而引发肿瘤。Aurora激酶家族又被称作极光激酶家族，是一组调控细胞有丝分裂的丝/苏氨酸蛋白激酶，包括三个成员：AuroraA、B、C。在低等生物（酵母）在进化早期就独立出来，因此它们仅有一个Aurora基因。较高等的动物细胞由于基因复制的结果，它们有Aurora-A和Aurora-B两个同源基因。脊椎动物的Aurora-A和Aurora-B可能来自于无脊椎动物的Aurora-A复制后的独立进化。哺乳动物Aurora-B在进化中可能发生了重组或复制，衍生出Aurora-C。Aurora激酶三亚群在结构上具有高度保守性，其蛋白质的一级结构含有两个结构域，C末端结构即催化区和N末端即可变区，其中人类Aurora-A和Aurora-B催化区的氨基酸序列保守性达到71％，然而它们三者的N末端即可变区却不相同。这种催化区结构的保守性表明Aurora激酶的底物在结构上具有特异性，而且催化区的晶体结构也已完全揭示，为研究其特异性底物和调控物提供了条件。Aurora-A蛋白激酶在中心体复制、两极纺锤体的形成、染色体的重排和染色体检查点的监测等重要的有丝分裂事件中发挥着至关重要的作用。本文就近年来有关Aurora-A蛋白激酶的研究进展进行综述。

关键词： Aurora-A激酶骨架蛋白蛋白稳定性肿瘤细胞

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利用还原剂预处理提高药物蛋白稳定性

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生物工程学报 2008年第12期24卷 2142-2143页

作者： Lin Zhang Murray Moo-Young C. Perry Chou Department of Chemical Engineering University of Waterloo Waterloo Ontario N2L 3G1 Canada

开发蛋白药的一个主要问题是蛋白质的不稳定性。本研究利用对蛋白质进行还原剂预处理的策略,提高了具有潜在治疗活性的重组人胞外域CD83蛋白的稳定性。在生理条件下,蛋白治疗产品易于变性,形成聚集和沉淀,并最终被降解。由此证明还原剂... 详细信息

开发蛋白药的一个主要问题是蛋白质的不稳定性。本研究利用对蛋白质进行还原剂预处理的策略,提高了具有潜在治疗活性的重组人胞外域CD83蛋白的稳定性。在生理条件下,蛋白治疗产品易于变性,形成聚集和沉淀,并最终被降解。由此证明还原剂预处理可以有效改善蛋白质的稳定性。

关键词：降解蛋白稳定性人胞外域的CD83蛋白还原剂预处理

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PROX1通过上调HIF-1α的表达及蛋白稳定性促进肝癌的转移

PROX1通过上调HIF-1α的表达及蛋白稳定性促进肝癌的转移

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作者：刘艳丰复旦大学

学位级别：博士

原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,在恶性肿瘤相关死亡率中位居第三位。由于肿瘤的侵袭、频繁的肝内播散和肝外转移导致肝癌的预后很差。目前肝癌侵袭和转移的分子机制仍然不太清楚,它的阐明是改... 详细信息

原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,在恶性肿瘤相关死亡率中位居第三位。由于肿瘤的侵袭、频繁的肝内播散和肝外转移导致肝癌的预后很差。目前肝癌侵袭和转移的分子机制仍然不太清楚,它的阐明是改善肝癌预后及治疗的基础。上皮细胞间质转化(Epithelial-Mesenchymal-Transition, EMT)在包括肝癌在内的多种癌症的发生和转移中起着重要的作用。EMT是上皮细胞失去极性和丧失细胞之间的粘附而转化为间质细胞表型的过程。肿瘤细胞周围的微环境可以启动和控制上皮细胞间质转化的过程。在癌症中上皮细胞问质转化的引发的主要原因之一是通过缺氧依赖或非缺氧依赖来方式激活缺氧诱导因子1(HIF-1)的信号通路。实体瘤微环境通常伴随着缺氧,缺氧可以促进肿瘤细胞的侵袭和转移,缺氧程度一般跟肿瘤的恶性程度相关。HIF-1是组成型表达的HIF-1 β亚基和缺氧调节HIF-1 α亚基组成的异二聚体。绝大多数肝癌患者中HIF-1 α都是高表达的,HIF-1 α的高表达跟肝癌的侵袭和淋巴结转移相关。同源异型蛋白PROX1在多种组织和器官的发育中起着决定性的作用。PROX1基因敲除小鼠的肝脏、胰腺和淋巴组织明显异常。PROX1在胚胎期肝脏的发育中对于肝实质细胞的迁移是必须的,提示PROX1对于肝脏的早期形成有着重要的作用。PROX1在癌症发生中的作用被广泛报道,目前报道PROXl的蛋白表达水平与神经胶质瘤的恶性等级成正相关。PROX1蛋白水平的高表达同样与结肠癌差的临床结果相关。PROX1被认为对结肠癌的引发不起作用,但是在促进癌症从良性到高度的恶性表型的过程中起着重要性的作用。PROX1与肝癌之间的关系相当的模糊不清。我们首次报道了PROX1在肝癌转移中的作用。在本研究工作中,我们发现原发性肝癌组织中PROX1蛋白的高表达跟术后肝癌病人的生存率差和早期复发呈正相关。在体外实验中,knockdown PROX1抑制肝癌细胞的迁移和侵袭,体内裸鼠实验发现knockdown PROX1抑制肝癌的肺转移,然后在肝癌细胞上过表达PROX1则促进肝癌细胞的迁移和侵袭,裸鼠实验中PROX1促进肝癌的淋巴结转移。PROX1主要通过上调缺氧诱导因子1α (HIF-1α)的转录水平和招募组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)阻止HIF-1α的乙酰化来保护HIF-1α蛋白的稳定性来实现其促转移活性,它最终导致肝癌细胞发生上皮细胞间质转化(EMT)。我们进一步证实联合使用PROX1和HDAC1对于肝癌病人的术后生存和早期复发有更好的预测价值。结论：PROX1是促进肝癌转移的一个关键分子。

关键词：原发性肝癌 PROX1 HDAC1 HIF-1α 乙酰化修饰蛋白稳定性

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乙酰化修饰调控BmSP3蛋白稳定性及分子机制的研究

乙酰化修饰调控BmSP3蛋白稳定性及分子机制的研究

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作者：孙子涵浙江理工大学

学位级别：硕士

乙酰化是一种重要的、可逆的蛋白质翻译后修饰。乙酰化修饰可通过改变蛋白质功能调节基因表达,越来越多物种中乙酰化被大量鉴定。家蚕,属鳞翅目泌丝昆虫,是以桑叶为食料的吐丝结茧的经济昆虫之一,具有十分丰富的价值。前期研究中,通过na... 详细信息

乙酰化是一种重要的、可逆的蛋白质翻译后修饰。乙酰化修饰可通过改变蛋白质功能调节基因表达,越来越多物种中乙酰化被大量鉴定。家蚕,属鳞翅目泌丝昆虫,是以桑叶为食料的吐丝结茧的经济昆虫之一,具有十分丰富的价值。前期研究中,通过nano-HPLC/MS/MS分析了家蚕的乙酰化组。鉴定发现,家蚕体内卵黄蛋白、载脂蛋白含有大量乙酰化修饰位点,这两类蛋白构成了家蚕脂肪体组织。鉴定结果中还发现,家蚕血淋巴储藏类蛋白家族中SP3蛋白(BmSP3)也存在高度乙酰化。本研究主要鉴定了BmSP3蛋白的乙酰化修饰,证实乙酰化修饰可提高细胞内BmSP3蛋白的稳定性。这为乙酰化修饰广泛的参与调控家蚕体内营养贮存与利用提供新的功能依据。首先开展BmSP3蛋白乙酰化修饰鉴定,进行了BmSP3蛋白的生物学信息分析,包括BmSP3蛋白氨基酸组分、跨膜性、疏水性、二级结构及其高级结构。然后根据基因库中编码BmSP3蛋白的基因序列(Gen Bank登录号:JQ043182),设计其上下游引物,PCR扩增BmSP3基因ORF片段,使用了BmN细胞的总RNA逆转录形成的c DNA作为扩增模板,再将PCR产物与真核瞬时表达载体pIEx-1-GFP连接,成功构建了重组载体pIEx-1-GFP-His-SP3,转染家蚕BmN细胞,过表达BmSP3蛋白,WB检测到BmSP3蛋白在真核细胞中表达良好;同时,使用6x His抗体免疫共沉淀融合蛋白His-SP3蛋白,应用乙酰化抗体WB检测表明,BmSP3蛋白存在乙酰化。随后研究了乙酰化修饰对BmSP3蛋白的表达影响。BmN细胞过表达BmSP3蛋白,使用去乙酰转移酶抑制剂Cocktail处理细胞,上调胞内的乙酰化水平,结果导致BmSP3蛋白的表达显著增加;乙酰转移酶抑制剂A485和C646处理细胞后下调胞内乙酰化水平,BmSP3蛋白的表达量随乙酰化水平下调而下调。进一步免疫共沉淀获得His-SP3蛋白,乙酰化抗体WB检测结果发现,Cocktail处理细胞明显上调了胞内His-SP3蛋白的乙酰化水平。这表明BmSP3乙酰化水平与其蛋白表达呈正相关。使用Cocktail、A485和C646处理过表达BmSP3蛋白的家蚕细胞,分别上调或下调胞内蛋白的乙酰化水平,RT-q PCR检测发现BmSP3基因的m RNA水平无显著变化,这表明BmSP3蛋白的乙酰化修饰在转录后水平上调控其蛋白的表达。接下来开展了乙酰化修饰对BmSP3蛋白稳定性的影响的研究。BmN细胞过表达BmSP3蛋白后,使用Cocktail处理细胞增加BmSP3蛋白的乙酰化水平,然后分别用蛋白合成抑制剂CHX和蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,检测BmSP3蛋白表达水平。结果表明,CHX处理细胞阻断了蛋白合成途径后,与对照组相比,Cocktail处理使得BmSP3蛋白的降解趋势幅度平缓,且有上升趋势;同时MG132处理细胞阻断蛋白酶体降解途径后,与对照组相比,Cocktail处理细胞可导致BmSP3蛋白表达的上升趋势更显著,这表明BmSP3蛋白的乙酰化修饰提高了BmSP3蛋白的稳定性,且与蛋白酶体的降解途径相关。最后开展了家蚕乙酰转移酶CBP(BmCBP)蛋白催化BmSP3的乙酰化研究。根据编码家蚕BmCBP蛋白的基因序列(Gen Bank号:XM＿038015130),成功合成了BmCBP基因的dsRNA。RNAi方法干扰BmCBP蛋白表达后,发现组蛋白H3的蛋白水平无变化,而组蛋白H3赖氨酸27(H3K27)位点的乙酰化水平显著降低,这表明BmCBP-dsRNA可通过RNA干扰敲低BmCBP蛋白表达,从而降低BmCBP已知底物组蛋白H3K27的乙酰化水平。将BmCBP-dsRNA和重组质粒pIEx-1-GFP-His-SP3共转染BmN细胞,免疫共沉淀融合蛋白His-SP3,乙酰化抗体WB检测发现,随着BmCBP蛋白的敲低,BmSP3蛋白的乙酰化水平也下调,同时发现其泛素化水也显著提升。这表明乙酰转移酶BmCBP可催化BmSP3蛋白的乙酰化修饰,同时乙酰化修饰和其泛素化修饰存在竞争。进一步采用BmCBPdsRNA下调胞内BmCBP的表达,同时采用BmCBP蛋白小分子抑制剂A485处理BmN细胞抑制其乙酰转移酶活,WB检测表明,两者都可以导致胞内BmSP3蛋白的表达下调。综上所述,家蚕乙酰转移酶BmCBP可以催化BmSP3蛋白的乙酰化修饰,通过催化乙酰化修饰在翻译后水平上调BmSP3蛋白的表达,增强其蛋白的稳定性;同时BmCPB催化的BmSP3蛋白乙酰化可以竞争性抑制其泛素化,因此,BmCPB催化的乙酰化修饰可能通过抑制泛素介导的蛋白酶体降解途径来提高BmSP3蛋白的稳定性和胞内的累积。

关键词：家蚕乙酰化修饰营养贮藏蛋白 BmSP3 蛋白稳定性

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EGFR调控肿瘤脂肪酸代谢的分子机制及其异构体EGFRvA蛋白稳定性的研究

EGFR调控肿瘤脂肪酸代谢的分子机制及其异构体EGFRvA蛋白稳定性的...

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作者：宋菲上海交通大学

学位级别：硕士

表皮生长因子受体EGFR(Epidermal growth factor receptor)是很重要的致癌驱动基因,在很多种肿瘤的发生发展中都起着重要的作用。由于EGFR调控的下游信号通路十分广泛,其表达与肿瘤细胞增殖加快、侵袭迁移能力增强等很多恶性特征都息息... 详细信息

表皮生长因子受体EGFR(Epidermal growth factor receptor)是很重要的致癌驱动基因,在很多种肿瘤的发生发展中都起着重要的作用。由于EGFR调控的下游信号通路十分广泛,其表达与肿瘤细胞增殖加快、侵袭迁移能力增强等很多恶性特征都息息相关。肿瘤细胞异常的脂代谢使得胞内单不饱和脂肪酸MUFA(monounsaturated fatty acids)的合成加快。那么,EGFR是否对脂代谢,特别是MUFA的合成发挥调控作用呢?本课题的研究表明EGFR可以和单不饱和脂肪酸合成中的关键限速酶SCD1(stearoyl-Co A desaturase-1)结合并通过磷酸化SCD1的第55位酪氨酸(Y55)位点增强其蛋白稳定性,从而提高胞内单不饱和脂肪酸的水平来促进肿瘤细胞增殖,而且EGFR激活介导的细胞增殖也依赖于SCD1的酶活。非小细胞肺癌临床样本的分析结果表明EGFR激活、SCD1蛋白Y55位点的磷酸化以及SCD1蛋白表达之间存在一定的临床相关性;而SCD1蛋白Y55位点的磷酸化可以作为非小细胞肺癌患者预后较差、生存期较短的一个独立判断因素。综上所述,本课题发现了一种EGFR调控MUFA合成的新途径,即通过磷酸化SCD1蛋白Y55位点增强其稳定性从而上调胞内MUFA水平并促进肿瘤细胞增殖。本课题组之前的研究发现了一种新的表皮生长因子异构体并命名为EGFRv A,和EGFR相比,EGFRv A更加能够促进肿瘤细胞的侵袭迁移能力,而我们并不能完全理解关于EGFRv A的相关作用机理。本课题的研究表明EGFRv A蛋白比EGFR蛋白更加稳定,其可能原因为EGFRv A与E3泛素连接酶c-Cbl的结合能力减弱,C端磷酸位点可以通过和接头蛋白Grb2结合进而间接的使得EGFRv A结合上c-Cbl,研究发现缺失C端磷酸化位点使得EGFRv A无法和Grb2结合,导致其与c-Cbl的结合能力减弱,不易进入蛋白降解途径,蛋白稳定性增强,这可能也是EGFRv A更加促进肿瘤细胞恶性发展的原因。

关键词：表皮生长因子脂肪酸去饱和酶-1 单不饱和脂肪酸酪氨酸磷酸化表皮生长因子异构体表皮生长因子 E3泛素连接酶蛋白稳定性

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寡雄腐霉NLP功能及蛋白稳定性的初步研究

寡雄腐霉NLP功能及蛋白稳定性的初步研究

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作者：李佳露南京农业大学

学位级别：硕士

寡雄腐霉（Pythium oligandrum）属卵菌门（Oomycetes）腐霉属（Pythium）,是一种非致病卵菌,不仅可以能够定殖在多种重要农作物根系周围,具有诱导植物免疫和拮抗病原菌的作用,还可以重寄生土壤中多种病原真菌和卵菌,具有极大的生防价... 详细信息

寡雄腐霉（Pythium oligandrum）属卵菌门（Oomycetes）腐霉属（Pythium）,是一种非致病卵菌,不仅可以能够定殖在多种重要农作物根系周围,具有诱导植物免疫和拮抗病原菌的作用,还可以重寄生土壤中多种病原真菌和卵菌,具有极大的生防价值。因此,解析寡雄腐霉具体诱抗机制,有助于推进植物病害绿色防控进程。寡雄腐霉的MAMPs（microbe-associated molecular patterns）能诱导植物基础抗性的产生,从而提高抵抗外界病原菌侵染的能力。目前在寡雄腐霉中发现的可充当MAMPs激活免疫的有:oligandrins、D型细胞壁蛋白和NLP（Nep1-like proteins）。其中,NLP作为一类广泛分布在多种微生物中的胞外蛋白,已有研究证实其在植物病原微生物侵染和定殖过程中发挥着重要作用,但对于其在具有生防作用的寡雄腐霉中的功能仍然缺乏足够研究。前期研究发现,寡雄腐霉基因组编码的14个NLP（PyolNLP1～14）中,PyolNLP3～7可在本氏烟叶片上引起细胞坏死,并具有抑制疫霉菌侵染的能力。然而,PyolNLP诱导的植物免疫是否依赖于其诱导坏死活性还不清楚。此外,具有诱抗活性的寡雄腐霉NLP蛋白可作为一类潜在的免疫诱抗蛋白,为此本研究对其蛋白稳定性进行了一系列研究和评估。本研究主要取得的结果如下: PyolNLPs诱导细胞坏死的关键氨基酸位点鉴定:根据进化关系,PyolNLPs可分为4组,其中可诱导细胞坏死的PyolNLP3～7与不引起细胞坏死的PyolNLP8同属于Group 1,且进化关系较近。为了鉴定PyolNLPs中引起细胞坏死的关键氨基酸位点,本研究将PyolNLP3～7与PyolNLP8进行多序列比对,初步选出4个在PyolNLP3～7与PyolNLP8的差异氨基酸位点。同时,有报道显示果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum）NLPPcc蛋白保守“GHRHDWE”序列中,D和E两个位点与诱导坏死活性相关。因此,本研究利用overlap-PCR法逐个将上述候选位点突变为A,获得相关突变序列后,将其在本氏烟中进行瞬时表达观察和统计突变序列引起细胞坏死的情况。结果显示,D和E的突变使PyolNLP3/5/6完全丧失诱导叶片坏死活性;使PyolNLP4/7丧失部分诱导坏死活性。G或F的突变,使PyolNLP3～7完全丧失诱导坏死活性。I的突变使PyolNLP3/5/6完全丧失诱导叶片坏死活性;但对PyolNLP4/7无影响。V/M的突变对PyolNLP3～7的诱导坏死活性均无影响。以上结果表明Group 1e亚组中PyolNLP3/5/6诱导坏死的关键位点是D、E、G、I和F;Group 1a中PyolNLP4/7诱导坏死的关键位点是G和F,相关位点是D和E。这说明Group 1中不同亚组的NLP引起细胞坏死的关键氨基酸位点与进化相关。 PyolNLP诱导坏死活性与其增强植物抗性能力的关联分析:前期发现PyolNLP5具有增强茄科植物对疫霉菌抗性的能力,而其保守的nlp24在其中是必需的。为进一步探究PyolNLP5诱导叶片坏死和诱导抗性间的关系,本研究将丧失了诱导烟草坏死的PyolNLP5和PyolNLP5在本氏烟叶片上进行瞬时表达,随后进行辣椒疫霉LT263和烟草疫霉025的接种实验,。结果显示,不引起细胞坏死的PyolNLP5D127A、PyolNLP5可抑制辣椒疫霉和烟草疫霉对烟草的侵染能力。进一步对相关序列在烟草叶片中HO的积累情况进行观察,发现PyolNLP5和PyolNLP5不会诱导叶片中HO的积累。上述研究表明,PyolNLP5增强植物对疫霉菌抗性的能力和其诱导坏死活性之间无关。寡雄腐霉诱抗蛋白稳定性的相关研究:除PyolNLP5和PyolNLP7外,实验室前期还从寡雄腐霉和缠器腐霉中筛选鉴定到了具有诱抗活性的POD8、PPOD2和PPOD3等elicitin-like家族的蛋白。为评估上述候选诱抗蛋白成为植物免疫诱抗剂的潜力,我们从原核表达体系的优化和在不同条件下的稳定性两方面开展研究。首先,本研究从诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度三个条件入手,以上述候选诱抗蛋白以及前人报道的Oli-D2、POD1两个同属elicitin-like家族的诱抗蛋白为研究对象,对其原核表达条件进行了优化。通过考马斯亮蓝染色结果及蛋白条带的相对灰度值分析,发现在18℃、IPTG终浓度为0.1-0.2 m M、诱导14～18 h的诱导条件下,可获得较高的蛋白量。其次,我们研究了温度和p H条件对这7个重组蛋白稳定性的影响。本研究通过不同p H、温度处理,以其诱导叶片坏死的情况为指标进行研究。结果显示,Oli-D2、POD1、POD8、PPOD2和PPOD3

关键词：寡雄腐霉 NPP1-like家族原核表达优化蛋白稳定性

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Ncoa3的蛋白稳定性及亚细胞定位研究

Ncoa3的蛋白稳定性及亚细胞定位研究

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作者：张延芹南开大学

学位级别：硕士

Ncoa3(nuclear receptor coactivator3)Ncoa3是p160蛋白家族的一员，它是一种核受体辅激活因子，能和包括核受体在内的多种转录因子结合，在转录因子对靶基因的调控中发挥桥梁作用。同时，Ncoa3也有组蛋白乙酰转移酶活性，可以促进基因... 详细信息

Ncoa3(nuclear receptor coactivator3)Ncoa3是p160蛋白家族的一员，它是一种核受体辅激活因子，能和包括核受体在内的多种转录因子结合，在转录因子对靶基因的调控中发挥桥梁作用。同时，Ncoa3也有组蛋白乙酰转移酶活性，可以促进基因转录。Ncoa3在许多生理过程中起重要作用，如乳腺组织发育，体细胞生长，雌性生殖功能，以及干细胞多能性的维持等。Ncoa3在许多肿瘤细胞过表达，促进了许多病理状态的发生。Ncoa3的转录辅激活活性被许多翻译后修饰调控，比如磷酸化，甲基化，乙酰化，苏木素化，泛素化等，许多修饰影响了蛋白质的稳定性，使它能通过泛素依赖途径或者非泛素依赖途径进行降解。而且Ncoa3在细胞核和细胞质之间的穿梭，调控了它的亚细胞定位及功能。\n 本课题所做的研究从其蛋白稳定性及亚细胞定位两方面入手。一方面为找出未知的蛋白稳定性调控因素，我们构建了Ncoa3删除突变体，通过westernblotting检测等实验方法发现肽段614-740的删除使蛋白稳定性明显升高;之后通过构建Luciferase融合蛋白结合定点突变等实验手段鉴定出此序列中K639和K673两个位点可以调控蛋白稳定性。另一方面，本实验室先前数据显示删除了核定位信号的Ncoa3仍具有转录辅激活活性，暗示了存在其他影响蛋白质入核的因素，我们通过构建删除突变体，构建GFP融合蛋白进行追踪观察发现肽段46-613能够促进蛋白在微管组织中心富集，但是这种富集是否促进的蛋白质入核及其详细的调控机制还需要进一步探究。

关键词：蛋白稳定性亚细胞定位核受体辅激活因子调控机制转录因子

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乙酰化修饰调控家蚕SP1蛋白稳定性及分子机制的研究

乙酰化修饰调控家蚕SP1蛋白稳定性及分子机制的研究

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作者：马亚飞浙江理工大学

学位级别：硕士

蛋白质的乙酰化修饰是一种重要的、高度保守且可逆的蛋白质翻译后修饰,最初是在组蛋白中发现,它是由组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰转移酶(HDACs)催化调控。组蛋白的乙酰化修饰是生物体生命活动中一种重要的调节方式,在真核生物... 详细信息

蛋白质的乙酰化修饰是一种重要的、高度保守且可逆的蛋白质翻译后修饰,最初是在组蛋白中发现,它是由组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰转移酶(HDACs)催化调控。组蛋白的乙酰化修饰是生物体生命活动中一种重要的调节方式,在真核生物的基因转录调控中发挥着关键作用。随着对组蛋白乙酰化的广泛研究深入,人们发现在组蛋白之外,非组蛋白也存在乙酰化修饰。前期研究中,本课题组通过nano-HPLC/MS/MS技术鉴定了家蚕的营养储藏类蛋白中有大量的乙酰化修饰位点,同时发现乙酰化修饰可以调控多个家蚕的营养储藏类蛋白的稳定性,其中包括SP2、Bm Apo Lp-II、Bm Apo Lp-III和Bm30K-3等。本论文基于前期基础,开展乙酰化修饰对家蚕SP1(Storage protein 1)蛋白稳定性机制的研究,进一步证实乙酰化修饰调控参与家蚕营养储藏与利用的机制。首先进行家蚕SP1蛋白表达、抗体制备和乙酰化修饰鉴定。以提取的家蚕总RNA为模板,利用逆转录PCR技术扩增出家蚕SP1的ORF片段,酶切回收产物分别连接到原核表达载体p ET-28a(+)、真核表达载体p IEx-1-GFP上,构建原核表达载体p ET-28a(+)-SP1和真核表达载体p IEx-1-GFP-SP1。将鉴定正确的p ET-28a(+)-SP1菌液进行培养并诱导蛋白表达,重组蛋白纯化后通过免疫注射大白兔获得家蚕SP1蛋白的多克隆抗体,通过ELISA和Western Blotting检测制备的家蚕SP1蛋白兔多克隆抗体效价在1:16000以上,且具有较高特异性。另外,将真核表达载体p IEx-1-GFP-SP1转染进家蚕Bm N细胞,转染48 h后收取蛋白样品,用6×His抗体检测家蚕SP1蛋白成功表达;通过6×His单抗免疫共沉淀获得融合表达SP1蛋白,泛乙酰化抗体WB检测表明家蚕SP1蛋白具有较高的乙酰化水平。其次开展乙酰化修饰对家蚕SP1蛋白表达影响研究。用去乙酰化酶抑制剂Cocktail和乙酰化酶抑制剂C646、A485分别处理转染了p IEx-1-GFP-SP1质粒的Bm N细胞。结果发现,当用去乙酰化酶抑制剂Cocktail上调蛋白乙酰化,与共表达的GFP蛋白相比,家蚕SP1蛋白的表达水平随Cocktail剂量的增加呈现明显的上升趋势,与之相反,用乙酰化酶抑制剂C646、A485下调蛋白乙酰化水平,则会降低家蚕SP1蛋白的表达水平,并且与药物用量呈现一种负相关关系。同时,用制备的家蚕SP1兔多克隆抗体检测Cocktail、C646、A485处理对家蚕Bm N细胞内源性SP1蛋白表达的影响,其结果与过表达SP1蛋白的趋势一致,表明乙酰化水平的上调或下调进而可以提高或降低家蚕SP1蛋白的表达水平和细胞含量,通过RT-q PCR技术检测发现,经Cocktail、C646、A485处理细胞后,SP1基因的转录水平并无发生明显改变,表明乙酰化修饰在翻译后修饰水平上调家蚕SP1蛋白的表达和细胞含量。最后开展乙酰化修饰对家蚕SP1蛋白稳定性影响及其机制研究。用蛋白合成抑制剂CHX和蛋白酶体抑制剂MG132分别处理Bm N细胞,同时Cocktail处理研究乙酰化修饰对家蚕SP1蛋白胞内降解与累积的影响。与对照组相比,发现CHX阻断蛋白合成途径时,Cocktail处理后家蚕SP1蛋白的降解曲线较为平缓,并呈一定的上升趋势;而用MG132阻断蛋白酶体降解途径后,经Cocktail处理的家蚕SP1蛋白含量明显高于对照组,表明在上调乙酰化水平后,家蚕SP1蛋白胞内稳定性得以提升,和蛋白酶体降解途径有关。为了研究乙酰化修饰提升家蚕SP1蛋白稳定性的作用机制,将家蚕泛素蛋白与SP1蛋白的过表达载体共转染分别用Cocktail、C646和A485处理的家蚕Bm N细胞,通过免疫共沉淀方法获得真核表达的His-SP1融合蛋白,WB检测结果显示,用Cocktail处理后蛋白的泛素化水平呈下调趋势,而用C646、A485处理后蛋白的泛素化水平呈明显上调趋势,说明家蚕SP1蛋白乙酰化水平的上调可以导致泛素化水平的下调,表明家蚕SP1蛋白的乙酰化修饰与其泛素化存在竞争。综合上述结果表明,家蚕SP1蛋白乙酰化修饰通过竞争其泛素化修饰,抑制泛素化修饰介导的蛋白酶体降解途径,进而提高SP1蛋白在细胞中的稳定性和累积。以上结果进一步表明乙酰化修饰通过调控家蚕营养储藏蛋白的稳定性来调节家蚕的营养储存和利用,有望发现家蚕中一种新的营养储藏和利用的调控机制。

关键词：家蚕营养储藏蛋白 SP1 乙酰化修饰泛素化修饰蛋白稳定性

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