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南京师大学报（自然科学版） 2012年第1期35卷 80-83页

作者：陈树桥陈勇周国勤唐春萍南京市水产科学研究所江苏南京210036 南京晓庄学院生物化工与环境工程学院江苏南京211171 江苏省产品质量监督检验研究院江苏南京210029

以蛋白水平为28%的配合饲料为对照组,添加0.50μg/g蜕皮激素的配合饲料为实验组,研究蜕皮激素对克氏原螯虾蜕皮和生长的影响.结果显示:与对照组相比,同样条件下实验组体重净增量提高了15.46%、特定增重率提高了12.08%、成活率提高了11.... 详细信息

以蛋白水平为28%的配合饲料为对照组,添加0.50μg/g蜕皮激素的配合饲料为实验组,研究蜕皮激素对克氏原螯虾蜕皮和生长的影响.结果显示:与对照组相比,同样条件下实验组体重净增量提高了15.46%、特定增重率提高了12.08%、成活率提高了11.63%、蜕皮率提高了50%、饲料系数降低了29.51%;实验组体长净增量提高了38.71%、特定增长率提高了51.61%,存在差异性显著(P<0.05).实验表明,在实际养殖过程中为了加快克氏原螯虾幼虾生长,可以在饲料中添加适量蜕皮激素.

关键词：克氏原螯虾蜕皮激素生长

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蜕皮激素引发的钙离子/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ信号转导途径以及蛋白激酶A信号转导途径对基因组转录的调控

蜕皮激素引发的钙离子/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ信号转导途径以...

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作者：荆玉谱山东大学

学位级别：博士

研究背景及存在的科学问题蜕皮激素(20-Hydroxyecdysone,20E)在昆虫蜕皮和变态中起主导作用。过去认为20E直接进入细胞启动基因转录,即基因组途径。近年的研究中发现细胞膜上存在响应蜕皮激素的G蛋白偶联受体(ErGPCRs),它们能介导20E引... 详细信息

研究背景及存在的科学问题蜕皮激素(20-Hydroxyecdysone,20E)在昆虫蜕皮和变态中起主导作用。过去认为20E直接进入细胞启动基因转录,即基因组途径。近年的研究中发现细胞膜上存在响应蜕皮激素的G蛋白偶联受体(ErGPCRs),它们能介导20E引发的细胞内Ca2+浓度的迅速升高,进而活化蛋白激酶C (PKC)信号转导途径,即非基因组途径。胞内Ca2+浓度升高后需要与胞内多种钙结合蛋白形成复合物来发挥作用,如钙调蛋白(calmodulin, CaM)。CaM可以结合4个Ca2+形成Ca2+/CaM活性复合物,进而结合钙离子/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ),使CaMKⅡ发生白磷酸修饰而活化。活化后的CaMKⅡ在细胞核内可以磷酸化转录因子或其他蛋白,从而调节基因转录。但CaMKⅡ在20E调控的Ca2+信号途径中的功能及作用机理尚不清楚。果蝇中的研究还发现细胞膜上的多巴胺/蜕皮激素受体(DmDopEcR)可以和20E结合并可以介导胞内cAMP浓度升高；蜕皮激素在30 s内诱导家蚕前丝腺细胞内cAMP浓度升高,表明20E可能诱导cAMP介导的非基因组信号途径。cAMP与依赖cAMP的蛋白激酶A (PKA)调节亚基(PKAR)结合,使其与催化亚基(PKAC)分离,进入细胞核,使环磷腺苷应答元件结合蛋白(CREB)磷酸化并结合到环磷腺苷应答元件(CRE)上,调控基因表达,即PKA信号转导通路。然而20E激发的cAMP信号转导途径及其在调节昆虫变态发育中的作用及机理并不清楚。本论文用鳞翅目昆虫棉铃虫作为实验材料,并利用棉铃虫表皮细胞系(HaEpi)平台,研究了CaMKⅡ在20E调控的Ca2+信号途径中的功能及作用机理、PKAC在20E调控的昆虫变态发育中的作用及机理。研究结果1.20E诱导CaMKⅡ磷酸化进而通过调节细胞核内EcRBl/USP1转录异源二聚体的形成来调控基因的启动。在棉铃虫蜕皮期和变态期CaMKⅡ表达量升高。在虫体中通过RNA干扰技术(RNAi)沉默CaMKⅡ导致20E诱导基因表达量下降,进而导致棉铃虫不能顺利完成变态。在HaEpi细胞系中,20E快速诱导CaMKⅡ第290位苏氨酸发生磷酸化,并使CaMKⅡ进入细胞核。GPCR抑制剂Suramin、磷脂酶C (PLC)抑制剂U73122以及1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R)抑制剂光溜海绵素(Xestospongin C, XeC)对20E诱导的细胞内Ca2+浓度升高及CaMKⅡ磷酸化有显著抑制作用。在细胞内沉默ErGPCRl、 ErGPCR2以及G蛋白alpha q (Gaq)也能抑制20E诱导的CaMKⅡ磷酸化。细胞核内的CaMKⅡ介导去乙酰化酶3(HDAC3)的磷酸化并出核,维持转录因子USP1第303位赖氨酸乙酰化,使其与EcRB1形成转录异源二聚体,并与蜕皮激素响应元件(EcRE)结合。以上结果说明,20E通过ErGPCRs-、Gαq-，PLC-介导Ca2+信号转导途径凋控CaMKⅡ磷酸化和核移位,进而调节USP1赖氨酸乙酰化并形成EcRB1/USP1异源二聚体,最终调控基因组途径的启动。2.20E引发细胞内PKA信号转导途径磷酸化CREB上调基因组转录途径。在棉铃虫幼虫通过RNAi沉默PKA催化亚基1(PKAC1),导致幼虫不能顺利完成化蛹,并且20E诱导基因的表达量下降。GPCR抑制剂Suramin、cAMP生成抑制剂盐酸布比卡因、以及沉默ErGPCR2都能抑制20E介导的PKAC1的磷酸化。PKAC1在细胞核内直接磷酸化CREB的第143位丝氨酸残基。20E可以诱导含有CRE及EcRE核心元件的pHR3-P-IE1-RFP-His质粒表达红色荧光蛋白。GPCR抑制剂Surami、PKA抑制剂H89、以及沉默ErGPCR1和ErGPCR2都能抑制20E对该RFP的上调表达。缺失质粒中的CRE后,20E诱导RFP表达的能力下降。20E诱导CREB磷酸化并结合到CRE上,沉默PKAC1后CREB不能磷酸化因而不能结合到CRE上。这些结果说明,20E通过ErGPCR2介导PKAC1磷酸化,进而使CREB发生磷酸化并结合到CRE元件上,增强20E诱导基因表达。结论及意义20E调控CaMKII氨基酸序列的第290位苏氨酸磷酸化并入核,催化HDAC3磷酸化并出核,从而维持USP1在303位赖氨酸的乙酰化修饰,与EcRB1结合形成EcRB1/USP1转录复合体并结合在EcRE上,启动基因转录。20E通过ErGPCR2介导PKAC1磷酸化,PKAC1直接磷酸化CREB中的第143位丝氨酸残基,使CREB与CRE结合,增强20E诱导基因表达。阐明了20E激发的Ca2+及cAMP增加引发的下游级联反应,丰富了类固醇激素的非基因组信号转导途径理论,为昆虫发育研究开

关键词：棉铃虫蜕皮激素钙离子信号通路磷酸化赖氨酸乙酰化非基因组途径基因组途径

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蜕皮激素激活AMPK和PP2A而抑制IIS--TORC1信号以延缓昆虫生长

蜕皮激素激活AMPK和PP2A而抑制IIS--TORC1信号以延缓昆虫生长

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作者：袁冬伟中国科学院大学

学位级别：博士

动物个体大小的最终确定在发育生物学上一直以来都是一个大难题。在昆虫中，蜕皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和胰岛素/类胰岛素样肽信号通路(Insulin/lnsulin-like growth factor signaling，IIs)分别司职昆虫生长周期和生长速率的... 详细信息

动物个体大小的最终确定在发育生物学上一直以来都是一个大难题。在昆虫中，蜕皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和胰岛素/类胰岛素样肽信号通路(Insulin/lnsulin-like growth factor signaling，IIs)分别司职昆虫生长周期和生长速率的调节，二者一起最终决定了昆虫个体的大小。20E通过调控昆虫的蜕皮和变态过程来影响个体生长发育。IIS是调控昆虫个体生长发育的重要信号，在昆虫中通过激发雷帕霉素靶蛋白复合体1（target of rapamycin complex1，TORC1）的多级磷酸化反应调节个体大小。前期研究显示在果蝇脂肪体细胞中超表达蜕皮激素受体EcR的显性失活形式而阻碍20E信号可以诱导脂肪体细胞中的IIS信号上升，同时抑制细胞自噬的发生，表明20E通过拮抗IIS调节生长速率，但其潜在的分子机制尚不清楚。AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是参与传递能量信号调控细胞生长的关键因子。20E不能引起SNF4Aγ(AMPK同源基因)突变体果蝇脂肪体中细胞自噬的发生。而在哺乳动物中，AMPK可以通过激活蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase2A，PP2A)抑制蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，又称AKT)的活性从而减弱ns信号。这表明20E有可能是通过激活AMPK的活性抑制IIS信号，继而调节昆虫的个体生长。　　本文以家蚕和果蝇为研究对象，探究20E通过AMPK-PP2A抑制IIS信号调节昆虫生长的分子机制和信号通路。本研究分别利用AMPK激活剂和抑制剂等药物处理家蚕调节其AMPK活性;利用免疫蛋白印迹实验在磷酸化水平分析IIS-TORC1活性;同时采用果蝇遗传学手段GAL4/UAS系统特异性地在果蝇脂肪体中超表达和降低AMPK或PP2A活性;利用flp-out技术分析表征P13K活性的tGPH变化水平，综合表征AMPK、PP2A和IIS-TORC1信号通路的关系。实验结果如下:　　1.在家蚕和果蝇幼虫脂肪体的发育变化中，相对于幼虫摄食期，AMPK的活性和表达水平在变态时期明显升高。在家蚕幼虫体内注射AMPK激活剂后发现AMPK被激活后会抑制IIS-TORC1信号通路。通过遗传学手段操作在果蝇体内使AMPK持续激活后检测IIS-TORC1信号活性，结果与家蚕相类似。体外的细胞实验也进一步验证了活化的AMPK对于IIS-TORC1信号通路的抑制。　　***2A在果蝇脂肪体的发育变化与AMPK的起伏相吻合，且PP2A的活性在AMPK被激活后有所上升。通过遗传学手段操作使AMPK持续激活形式和PP2A显性失活形式共表达，发现PP2A被抑制后AMPK无法再压制IIS-TORC1信号通路活性，表明AMPK通过PP2A抑制IIS-TORC1信号通路。　　3.在家蚕和果蝇中，20E通过AMPK和PP2A在脂肪体中拮抗IIS-TORC1并抑制其生长速度。在家蚕蜕皮或果蝇化蛹过程中，高水平的20E分别从转录水平和磷酸化水平这两个方面来激活AMPK。AMPK作为一种营养信号传感器，可以维持昆虫脂肪体内的能量平衡。AMPK继而激活PP2A，进一步去磷酸化胰岛素受体（insulin receptor，InR）和AKT，从而抑制IIS-TORC1信号。20E对于AMPK的激活在本质上是产生营养胁迫，即诱发饥饿效果。　　***或PP2A的激活会影响虫体能量的转变和调度。在家蚕幼虫体内注射AMPK激活剂导致幼虫生长缓慢，而在果蝇脂肪体中超表达AMPK或PP2A也可延缓幼虫的生长。　　本文通过研究AMPK-PP2A在20E以及IIS-TORC1信号通路中的桥梁作用，有助于理解激素和营养形成的信号调控网络如何调控昆虫的生长发育。在昆虫生长发育过程中，胰岛素和营养信号与20E信号相互拮抗，导致昆虫生长和蜕皮周期性地发生，这也进一步解释了昆虫“蜕皮时不摄食，摄食时不蜕皮”的重要生物学意义。

关键词：昆虫生理学蜕皮激素蛋白磷酸酶2A 胰岛素/类胰岛素样肽信号通路生长速率

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蜕皮激素诱导棉铃虫血细胞外突的分子机制

蜕皮激素诱导棉铃虫血细胞外突的分子机制

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作者：郜慧博河南大学

学位级别：硕士

细胞外突(cell protrusions)根据形状分为片状伪足、丝状伪足等,常见于细胞迁移和吞噬。在细胞迁移和吞噬过程中,细胞通过成核促进因子如WAVE、WASP等激活肌动蛋白成核复合物Arp2/3或formins,生成网状或丝状肌动蛋白并引起肌动蛋白聚合... 详细信息

细胞外突(cell protrusions)根据形状分为片状伪足、丝状伪足等,常见于细胞迁移和吞噬。在细胞迁移和吞噬过程中,细胞通过成核促进因子如WAVE、WASP等激活肌动蛋白成核复合物Arp2/3或formins,生成网状或丝状肌动蛋白并引起肌动蛋白聚合,以此提供细胞外突的力。研究发现,除了肌动蛋白聚合通路外,细胞外突还能够被网格蛋白重链(Clathrin heavy chain,CHC)抑制。网格蛋白在胞吞作用中研究较为广泛,但其在外突机制的研究比较少。有报道认为蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)能够促进昆虫免疫细胞的吞噬作用并加速血细胞运动,但其中的分子机制未知。棉铃虫(Helicoverpa armigera)是一种代表性的重要农业害虫,本论文研究以棉铃虫为材料,探究20E诱导细胞外突的分子机制。在本研究中,首先使用20E处理棉铃虫6龄早期幼虫,通过电镜对血细胞形态进行观察,发现20E处理后的血细胞产生外突,而未经20E处理的血细胞没有此现象。随后运用荧光显微镜观察,结果表明F-actin的表型与细胞形态一致,表现为向外突出,据此初步认为20E能够促进血细胞外突。在此基础上,使用RNAi沉默血细胞中的CHC和网格蛋白轻链(Clathrin light chain,CLC)基因,在无20E诱导情况下,CHC RNAi引起血细胞F-actin聚集并明显向外突出,进一步的20E处理显著增加外突的长度,表明CHC抑制细胞外突。相反,CLC RNAi导致20E诱导的外突显著减少,同时黏着斑增加,表明CLC起促进细胞外突的作用。因此,网格蛋白在20E诱导的血细胞外突过程中发挥重要功能,且CLC和CHC的作用方式不同。肌动蛋白的组装受到成核蛋白Arp2/3复合物的催化,并由此实现细胞形态及运动的快速变化,暗示20E诱导的棉铃虫血细胞外突可能也与Arp2/3有关。通过原核表达,分别制备出棉铃虫CLC、CHC和Arp2/3的多克隆抗体,Western blot检测了CLC、CHC和Arp2/3在蛋白水平上的表达模式,结果发现CLC在6龄幼虫蜕皮后12h最低,随后不断上升,72h达到最高,与20E滴度的变化正相关;而CHC及Arp2/3则与之不同。20E诱导实验进一步说明了20E能够诱导CLC的表达。棉铃虫体内20E处理,对血细胞CLC及Arp2/3进行免疫共沉淀的实验结果发现,20E诱导CLC与Arp2/3相互作用。当20E滴度降低时,血细胞未发生外突现象,且CLC与Arp2/3的相互作用下降直至消失。使用免疫组化技术对CLC和Arp2/3进行亚细胞定位,相比于对照组,20E处理后的血细胞中CLC及Arp2/3向细胞膜表面聚集,并且高度重合。本论文研究表明,20E能够通过网格蛋白调节棉铃虫血细胞的外突。在这个过程中,网格蛋白的轻链(CLC)与重链(CHC)承担着不同的功能,即20E通过CLC促进细胞外突,CLC在20E的作用下与成核蛋白Arp2/3结合,共同调节血细胞形变,形成细胞外突。

关键词：蜕皮激素网格蛋白肌动蛋白细胞外突血细胞

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蜕皮激素治疗马肠胃蝇幼虫病的研究

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黑龙江畜牧兽医 1995年第4期 28-30页

作者：王建明张贵英都娟杨金龙园经国刘海平河北农业技术师范学院昌黎066600

对利用蜕皮激素消灭马肠胃蝇幼虫的方法进行了研究。结果表明,利用蜕皮激素消灭马肠胃蝇幼虫具有效果好,用量少,成本低等优点。

关键词：蜕皮激素肠胃蝇幼虫马病

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复凝聚法制备昆虫蜕皮激素微胶囊及其性能

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化工进展 2010年第9期29卷 1730-1736页

作者：李鹤迟德富宇佳关桦楠东北林业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150040

以明胶(GE)和阿拉伯胶(AG)为壁材,采用复凝聚法制备昆虫β-蜕皮激素微胶囊。通过正交实验获得微胶囊的最佳制备工艺条件。利用扫描电子显微镜和光学显微镜对β-蜕皮激素微胶囊形貌进行表征。研究了β-蜕皮激素微胶囊的释放行为和光稳定... 详细信息

以明胶(GE)和阿拉伯胶(AG)为壁材,采用复凝聚法制备昆虫β-蜕皮激素微胶囊。通过正交实验获得微胶囊的最佳制备工艺条件。利用扫描电子显微镜和光学显微镜对β-蜕皮激素微胶囊形貌进行表征。研究了β-蜕皮激素微胶囊的释放行为和光稳定性。结果表明:壁材质量分数为3%,芯壁材质量比为1:1,前期pH值为4.6,后期pH值为8.0为最佳工艺条件。在此条件下,可形成壁膜光滑,大小均匀的球形微胶囊,其平均粒径大小为5μm,载药量与包覆率分别达到68.5%和63.4%。微胶囊能够明显延长蜕皮激素的释放时间及增强蜕皮激素的光稳定性。

关键词：复凝聚法微胶囊蜕皮激素可控缓释光稳定性

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蜕皮激素重编程糖代谢和氨基酸代谢调控昆虫的变态发育

蜕皮激素重编程糖代谢和氨基酸代谢调控昆虫的变态发育

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作者：王晓培山东大学

学位级别：博士

研究背景与科学问题完全变态昆虫一生经历卵、幼虫、蛹和成虫四个发育时期,在幼虫期通过取食促进生长发育,在变态发育期(从末龄幼虫经历蛹到成虫羽化)停止取食,通过分解幼虫组织-自噬来维持生命和成虫组织发育。蜕皮激素(此文指20-羟基... 详细信息

研究背景与科学问题完全变态昆虫一生经历卵、幼虫、蛹和成虫四个发育时期,在幼虫期通过取食促进生长发育,在变态发育期(从末龄幼虫经历蛹到成虫羽化)停止取食,通过分解幼虫组织-自噬来维持生命和成虫组织发育。蜕皮激素(此文指20-羟基蜕皮酮,20-hydroxyecdysone,20E)是调控昆虫变态发育的重要激素。变态期20E滴度增加,拮抗胰岛素信号通路,抑制摄食行为,使昆虫体内的代谢发生巨大变化,从摄取食物获取能量转变为通过分解幼虫组织获取能量,涉及基因转录变化及代谢产物变化,其调控机制尚不清楚,代谢产物与组织重塑的关系也少见报道。本论文以重大农业害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera)为研究模型,研究20E调控昆虫变态发育期代谢重编程的分子机制,包括研究20E对Krüppel样转录因子(krüppel-likefactor,KLF)的表达调控及其在自噬和糖异生中的作用;通过代谢组学研究20E调控氨基酸代谢重编程的分子机制。研究结果通过检测KLF15在棉铃虫生长发育过程中的表达变化,发现KLF15主要是在变态期的脂肪体中高表达,20E通过EcR促进Klf15的转录。通过观察脂肪体形态以及虫体敲降实验,证明KLF15对于变态期脂肪体分解至关重要,KLF15促进糖异生、自噬和凋亡相关基因的表达。敲降自噬相关基因8(autophagy related gene 8,Atg8)后,脂肪体的分解受到抑制,生糖底物包括游离脂肪酸、甘油和游离氨基酸的含量下降,葡萄糖水平下降,说明KLF15促进自噬,为糖异生提供底物。通过软件分析,发现在Atg8和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase,Pepck)的启动子序列中有KLF15的结合位点(CACCC,KLF bs),20E诱导KLF15结合Atg8和Pepck启动子中的KLF bs从而促进其转录,重编程糖代谢,使糖代谢从取食期的糖酵解为主转变为变态期的糖异生为主。通过检测与葡萄糖生成相关的代谢物以及代谢途径中的关键限速酶,发现糖代谢相关的基因表达发生了显著变化,从取食期的糖酵解基因、糖原和海藻糖合成酶基因高表达转变为变态期的糖异生基因、糖原和海藻糖分解酶基因高表达,导致蛹期血淋巴葡萄糖水平升高。研究表明20E通过KLF15整合促进变态期幼虫组织的自噬和糖异生。通过测定幼虫生长期(6th-24h)、游走期(6th-96h)和蛹期(P6)的血淋巴代谢组,发现血淋巴中的代谢产物在棉铃虫发育过程中发生显著变化,其中,精氨酸、α-酮戊二酸和谷氨酸被鉴定为幼虫生长期、游走期和蛹期的标志代谢物。实验证明精氨酸促进幼虫细胞增殖,α-酮戊二酸促进幼虫细胞自噬,谷氨酸促进成虫细胞增殖。在变态期,20E通过抑制精胺琥珀酸合酶(argininosuccinate,Ass)的表达,抑制精氨酸合成,并且,20E通过促进精氨酸酶(arginase,Arg)的表达,促进精氨酸分解,从而使血淋巴中的精氨酸在进入游走期后含量较取食期大幅下降。而谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)在取食期和游走期的中肠中高表达,促进取食期从食物中获得的谷氨酸转变为α-酮戊二酸,从而使α-酮戊二酸含量在游走期升高。进入蛹期后,,-酮戊二酸在另一种谷氨酸脱氢酶(glutamatedehydrogenase-like,GDH-like)的作用下转变为谷氨酸,加之变态期细胞自噬产生的游离氨基酸也转变为谷氨酸,从而使血淋巴中的谷氨酸在蛹期大量增加,成为成虫发育的主要能量物质。在幼虫停止取食进入变态期后,20E通过调控不同代谢途径中关键基因的表达从而重编程氨基酸代谢支持棉铃虫的变态发育。结论一、蜕皮激素通过KLF15整合促进自噬和糖异生从而维持昆虫变态发育中葡萄糖稳态1.20E通过EcR促进Klf15的表达。***15通过结合Atg8启动子区域的KLF bs促进Atg8的转录,促进脂肪体的自噬和凋亡。3.变态期幼虫组织发生自噬与凋亡为糖异生提供底物。4.棉铃虫变态发育过程中,20E通过KLF15调控糖代谢基因表达重编程糖代谢。二、蜕皮激素重编程氨基酸代谢支持昆虫的变态发育1.棉铃虫生长发育过程中体内的代谢产物会发生变化。2.精氨酸、α-酮戊二酸和谷氨酸分别在幼虫取食期、游走期和蛹期富集,是幼虫取食期、游走期和蛹期的标志代谢物。精氨酸在幼虫期促进幼虫生长和增殖,α-酮戊二酸在游走期促进幼虫自噬,谷氨酸在蛹期促进成虫生长和增殖。3.20E通过抑制Ass的表达、促进Arg的表达降低变态期精氨酸的水平。4.在取食期和游走期中肠中高表达的Gdh会促进谷氨酸转变为α-酮戊二酸。α-酮戊二酸通过在蛹期脂肪体中高表达的Gdh-like转变为谷氨酸。5.自噬可以产生多种游离氨基酸并

关键词：蜕皮激素代谢组织重塑转录因子KLF15 精氨酸 α-酮戊二酸谷氨酸

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蜕皮激素信号通路相关功能基因在凡纳滨对虾蜕皮的分子机制初步研究

蜕皮激素信号通路相关功能基因在凡纳滨对虾蜕皮的分子机制初步研...

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作者：王成桂广东海洋大学

学位级别：博士

蜕皮是凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）整个生命周期中一个重要的生理过程,这一过程受外部环境因素影响,同时也受体内神经系统和内分泌系统的协同调控。蜕皮是以蜕皮激素合成为核心的蜕皮激素信号通路上下各基因级联调控的过程,如... 详细信息

蜕皮是凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）整个生命周期中一个重要的生理过程,这一过程受外部环境因素影响,同时也受体内神经系统和内分泌系统的协同调控。蜕皮是以蜕皮激素合成为核心的蜕皮激素信号通路上下各基因级联调控的过程,如在昆虫纲动物中蜕皮激素信号通路上游高血糖激素（CHH）家族神经肽抑制蜕皮激素的合成,而蜕皮激素信号通路下游基因羽化激素（EH）和蜕皮触发激素（ETH）受蜕皮激素调控可以触发蜕皮行为的发生。与节肢动物门昆虫纲动物相比,甲壳动物蜕皮信号通路各个基因的研究很不全面,大多数借鉴于昆虫等动物,特别是蜕皮激素信号通路相关功能基因在蜕皮过程的调控机制有待更深入的探究。本论文以凡纳滨对虾CHH、EH和ETH为研究对象,运用原核表达系统制备体外重组蛋白和结合RNAi等技术,分析比较转录组数据,通过体内注射和体外组织孵育实验,研究CHH影响蜕皮激素合成,而EH和ETH在蜕皮激素的调控下参与对虾蜕皮,同时确认了ETH通过其受体协同参与对虾蜕皮调控。研究围绕蜕皮激素,旨在阐明蜕皮激素信号通路上下游相关功能基因参与调控凡纳滨对虾蜕皮的分子机制。研究的初步结果如下:1、LvCHH-L通过抑制蜕皮激素合成调控凡纳滨对虾蜕皮分子克隆和生信分析显示LvCHH-L具有典型的CHH I型家族神经肽的结构特征,在成熟肽和信号肽之间存在CPRP结构,成熟肽存在6个保守的半胱氨酸残基。眼柄组织是蜕皮间期对虾LvCHH-L表达的主要部位（P<0.05）,在蜕皮间期LvCHH-L转录水平显著最高（P<0.05）,并随蜕皮临近而逐步降低转录水平。抑制LvCHH-L转录水平显著加速了对虾蜕皮和提高蜕皮率（P<0.05）;连续抑制LvCHH-L转录水平显著增加了对虾体重（P<0.05）,加快了对虾生长;注射ds LvCHH-L显著升高了蜕皮激素合成途径催化酶NVD和SAD的转录水平以及蜕皮激素受体Ec R的转录水平（P<0.05）;干扰LvCHH-L的转录提高了对虾血淋巴蜕皮激素浓度,促使对虾提前蜕皮。结果表明LvCHH-L抑制蜕皮激素的合成,从而参与调控凡纳滨对虾蜕皮。2、饲料中添加蜕皮激素的凡纳滨对虾比较转录组分析投喂不同蜕皮激素含量的饲料（0、200、400和800 mg/kg）养殖凡纳滨对虾两个月后,对凡纳滨对虾肝胰脏和肠组织进行了比较转录组分析,分别获得了大小为39361266～45214394等24个高质量读数数据库,经过比对到凡纳滨对虾基因组和未比对到的读数进行新基因的预测,共得到32623个转录本,其中最短的为57 bp,最长的为40511 bp,GO数据库富集到的转录本65140次,KEGG数据库富集到的转录本12394次。差异基因分析结果表明蜕皮信号通路的关键基因EH、ETH、几丁质合酶（CHS）、HR38、几丁质酶（CHITINASE）和维甲类X受体（RXR）在肝胰脏800mg/kg实验组中显著上调（P<0.05）;肠组织800 mg/kg实验组中细胞色素P450酶系在KEGG差异通路有显著富集;INSIG-SREBP-SCAP信号通路中SREBP基因随蜕皮激素含量增加表达量下调。蜕皮信号通路中,从蜕皮激素合成的原材料胆固醇的调控蛋白结合原件SREBP,广泛参与蜕皮激素合成途径的细胞色素P450酶系,以及蜕皮信号通路下游基因都在不同蜕皮激素含量饲料投喂组表达有显著差异。通过本研究的转录组数据分析,挖掘了受蜕皮激素调控的对凡纳滨对虾蜕皮生长关键的信号通路和基因。3、LvEH参与凡纳滨对虾蜕皮调控由转录组数据筛选到LvEH基因是凡纳滨对虾蜕皮激素信号通路关键功能基因,生信分析显示LvEH基因ORF长249 bp,编码26个氨基酸形成的信号肽和56个氨基酸形成的成熟肽,成熟肽内含可以形成分子内稳定二硫键的6个半胱氨酸残基。在蜕皮间期凡纳滨对虾鳃、表皮以及脑是LvEH基因主要表达部位,在对虾幼体由无节幼体变态为蚤状幼体过程中,LvEH基因转录水平高,LvEH基因在蜕皮间期转录水平最低（P<0.05）,并随蜕皮来临逐步升高。运用原核表达技术成功制备了分子量为26.8k Da的重组蛋白r LvEH,结合RNAi技术研究LvEH对对虾蜕皮的调控。蜕皮激素体外孵育实验表明一定范围内增加蜕皮激素浓度显著促进了LvEH的表达（P<0.05）;干扰LvEH的转录,显著延缓了对虾蜕皮（P<0.05）,但是通过共注射ds LvEH和r LvEH对对虾的蜕皮率无显著影响（P>0.05）;注射r LvEH加快了对虾生长,而注射ds LvEH明显延缓了对虾生长;LvEH对下游基因LvETH、LvETHR、Lv Burs和LvCCAP表达有显著的促进作用（P<0.05）。结果表明,LvEH受蜕皮激素调控,并影响下游基因的表达而参与凡纳滨对虾蜕皮调控。4、Lv

关键词：凡纳滨对虾蜕皮激素 CHH 羽化激素(EH) 蜕皮触发激素(ETH)

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蜕皮激素调节菜青虫滞育的分子机制研究

蜕皮激素调节菜青虫滞育的分子机制研究

引用

作者：廖靖贵州大学

学位级别：硕士

菜青虫Pieris rapae被认为是全球最具破坏性的农业害虫之一,严重影响各种十字花科蔬菜作物的质量和产量,给农业造成了巨大的经济损失。菜青虫具有滞育特性,滞育使其具有高度的环境胁迫抗性,是菜青虫越冬存活的关键,直接影响次年的种群... 详细信息

菜青虫Pieris rapae被认为是全球最具破坏性的农业害虫之一,严重影响各种十字花科蔬菜作物的质量和产量,给农业造成了巨大的经济损失。菜青虫具有滞育特性,滞育使其具有高度的环境胁迫抗性,是菜青虫越冬存活的关键,直接影响次年的种群密度。因此,基于滞育调节的害虫管理策略可能是一种有效的防治措施。然而,目前对于菜青虫滞育的调控机制还知之甚少。因此,本论文以菜青虫滞育为模型,以激素为切入点,综合运用RNA-Seq、q PCR、RNAi和抑制剂处理等技术手段,初步揭示了蜕皮激素调节菜青虫滞育的分子机制。主要研究结果如下: 1.筛选鉴定调节菜青虫滞育的激素对引导菜青虫滞育的环境因素研究发现,在人工气候培养箱内,其幼虫在温度17℃,长光照(L:D=14 h:10 h)条件下形成非滞育蛹,而在短光照(L:D=10 h:14h)条件下形成滞育型蛹,其滞育率可达98%。对蛹的历期进行统计,结果表明非滞育型的蛹期平均约为2周,而滞育型蛹的历期则在2个月以上。为明确激素对菜青虫滞育调节作用,首先对滞育和非滞育血淋巴中的蜕皮激素和保幼激素的滴度进行测定,结果表明相对于非滞育蛹,滞育蛹血淋巴中的蜕皮激素滴度处于一个较低的水平,而保幼激素滴度则无显著差异,当在滞育蛹中注射外源蜕皮激素后,蛹滞育被打破。以上结果说明蜕皮激素是调节菜青虫蛹滞育的主要激素。为明确滞育蛹血淋巴中蜕皮激素滴度下调的原因,利用q PCR调查了蜕皮激素合成和代谢途径关键基因的相对表达量。结果表明,滞育型蛹中促前胸腺激素PTTH基因的表达显著低于非滞育型蛹。蜕皮激素合成相关基因Nvd、Spo、Phm、Dib、Sad、Sha则有着不同的表达模式,其中Nvd、Spo、Phm、Dib总体在滞育蛹中有着相对较低的表达水平;Sad除在蛹6天滞育显著低于非滞育,其余时间点无明显差异;Sha则在滞育蛹中有着较高的表达水平。此外,蜕皮激素代谢途径基因CYP18a1在滞育蛹中的表达也均高于非滞育。这些结果表明滞育中低水平的蜕皮激素滴度主要与合成分泌途径中PTTH、Nvd、Spo、Phm基因的低表达有关,此外还与代谢途径CYP18a1基因的高表达有关。 2.基于转录组学筛选蜕皮激素调节滞育的下游基因本研究首先利用RNA-Seq技术构建了菜青虫滞育连续3个生理阶段(即滞育诱导和准备期、起始期、维持期)以及同步的非滞育时期的转录组数据文库,相较于非滞育,在滞育三个阶段分别鉴定到了759、1045和4721个差异表达基因(DEGs)。GO富集分析表明,这些DEGs主要参与有机酸代谢过程、DNA修饰和角质层的结构成分等过程。进一步进行KEGG富集分析表明,这些差异基因富集在过氧化物酶体、昆虫激素生物合成、长寿调节途径、不饱和脂肪酸的生物合成、PPAR信号通路等。对滞育和非滞育的差异表达基因进行时序分析,共确定了1717个显著的时序差异表达基因,它们被映射到AMPK、Fox O、m TOR和TGF-β等信号通路。此外,利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)鉴定到HDAC11、METLL16D、Dyw和GST等可能作为调节滞育的hub基因。对差异基因进行转录因子分析发现,蜕皮激素下游核受体基因HR3作为转录因子在3个生理阶段均差异表达。与此同时,利用RNA-Seq技术对蜕皮激素注射后下游差异基因进行了筛选。结果表明,滞育蛹注射蜕皮激素后,分别有1180个基因上调表达和2200个基因下调表达。GO富集分析发现上调的基因主要参与细胞分裂、转录因子结合、转录调节活性、ATP结合过程,而下调的基因主要参与神经递质受体活性,G蛋白偶联受体活性和谷氨酸受体活性、几丁质合成、角质层的结构成分。此外,它们还富集在长寿调节途径、PPAR、不饱和脂肪酸的生物合成等KEGG信号通路。将蜕皮激素注射转录组与滞育、非滞育的转录组数据进行联合分析,核受体基因HR3、表观遗传因子HDAC11、生物钟基因Dyw、溶酶体跨膜蛋白SLC46A3、整合素Integrin、两个胰岛素信号通路重要基因Fox O和S6K、3个抗氧化酶基因GST、CAT、SOD和多个脂质代谢关联基因SLOIVL、SCD和FAR等被鉴定为蜕皮激素调节菜青虫滞育的下游基因。 3.验证蜕皮激素下游关键基因对菜青虫滞育的影响为明确上述靶基因对滞育的影响,本研究选择了几个关键的基因进行了验证。q PCR结果表明核受体基因HR3在滞育蛹中处于较低表达水平,注射蜕皮激素后HR3显著上调;当利用RNAi敲低HR3的表达时,导致了非滞育蛹发育延迟约3天,表明蜕皮激素/HR3途径是调节菜青虫滞育的重要途径。胰岛素通路的关键基因Fox O在滞育蛹中高水平表达,注射蜕皮激素后其表达被抑制;另一个关键基因S6K滞育蛹中处于较低表达水平,注射蜕皮激素提高了S6K的表达水平;

关键词：菜青虫滞育转录组蜕皮激素 RNAi 脂质代谢抗氧化酶

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蜕皮激素和保幼激素对家蚕丝腺凋亡基因表达调控的研究

蜕皮激素和保幼激素对家蚕丝腺凋亡基因表达调控的研究

引用

作者：张柠浙江农林大学

学位级别：硕士

保幼激素(Juvenile hormone,JH)和蜕皮激素(Molting hormone,MH)共同影响着家蚕的蜕皮和化蛹。家蚕的幼虫时期一般发育五个龄期并蜕皮四次,五龄第七天结束时进入吐丝期,这时家蚕会停止进食开始吐丝进行化蛹的准备,48 h内它将用丝将自己... 详细信息

保幼激素(Juvenile hormone,JH)和蜕皮激素(Molting hormone,MH)共同影响着家蚕的蜕皮和化蛹。家蚕的幼虫时期一般发育五个龄期并蜕皮四次,五龄第七天结束时进入吐丝期,这时家蚕会停止进食开始吐丝进行化蛹的准备,48 h内它将用丝将自己包裹起来进入化蛹阶段。在家蚕蜕皮时期JH含量降低,MH含量增加,两者通过协同作用完成了家蚕的蜕皮过程;在化蛹阶段JH彻底消失,而MH浓度激增促进家蚕幼虫器官快速凋亡,从而完成幼虫-蛹的转变。前期的实验我们对五龄中期的家蚕进行了蜕皮激素的饲喂处理,发现Bm30kc6、Bm Fadd、Bm Daxx及Bm Dredd四个基因均出现了一定特征性的变化,说明了这四个基因都与家蚕丝腺的凋亡有着极为重要的联系,并推测他们都属于蜕皮激素的下游靶基因。本实验使用不同浓度的保幼激素、蜕皮激素、不同浓度组合的混合激素和不同饲养温度对五龄中、后期家蚕进行处理,实验结果确认Bm30kc6、Bm Fadd、Bm Daxx及Bm Dredd四个基因,均影响蚕-蛹变态期细胞凋亡,主要研究内容如下:1.检测了家蚕五龄中、后期四个凋亡相关基因的表达量。结果发现:Bm30kc6基因和Bm Daxx基因具有大致相同的表达规律,从进入到五龄中期开始,两个基因表达量开始逐渐上升,分别在五龄第五天和第六天到达第一个峰值,随后下降。在进入到吐丝期以后,开始大量表达,达到第二个峰值。对于Bm Fadd和Bm Dredd基因来说,在进入到五龄中期以后,基因表达量开始缓慢上升,中间并没有太大的变化。进入到吐丝期以后,基因表达量开始迅速上升,在吐丝24 h以后达到峰值。2.五龄中期不同浓度蜕皮激素处理家蚕能够显著缩短其五龄发育时间。实验表明:在蜕皮激素处理后的短时间内,四种凋亡基因均受到促进作用。以Bm30kc6基因为例,本应出现在五龄第五天的峰值被提前到了五龄第三天12 h。因此家蚕提前吐丝,丝腺提前凋亡,导致了五龄时间的大幅缩短。在对五龄家蚕后期处理后,Bm30kc6基因的表达量被严重抑制,但其余三种促凋亡基因大量表达,表达峰值均被提前,其中低浓度组和中浓度组的表达峰值被提前到了五龄第七天,高浓度组则被提前到了五龄第六天12 h。由于丝腺的快速凋亡,使得家蚕提前进入到了变态时期,提前化蛹。3.五龄中期不同浓度保幼激素处理家蚕能够显著延长其五龄发育时间。实验表明:较高浓度的保幼激素能够使家蚕丝腺细胞存活的时间延长。外源的保幼激素注射到家蚕体内后,影响了家蚕体内分泌器官的活性,改变了其自身激素的分泌状态,家蚕为了维持体内激素相对稳定,大量分泌蜕皮激素。五龄后期保幼激素处理后的幼虫甚至可能更早地进入吐丝期。4.五龄中期不同浓度组合的混合激素处理家蚕能够显著缩短或延长其五龄发育的时长。通过实验我们发现两者存在着十分复杂的相互作用,当蜕皮激素浓度高于保幼激素时,可以使家蚕的五龄经过缩短;当两者浓度相同或保幼激素浓度高于蜕皮激素时,家蚕的五龄经过却延长。蜕皮激素能够将凋亡基因表达的峰值提前,促使家蚕提前吐丝结茧。而当保幼激素浓度较高时,使幼虫时期丝腺等组织仍能维持自身的形态和功能,所以延长了五龄的时长。5.据前人报道:在低温条件下家蚕体内保幼激素分泌较多,蜕皮激素较少;高温条件下蜕皮激素分泌较多,保幼激素较少。检测相关目的基因发现:以上因素导致了在低温条件下Bm30kc6基因的表达峰值被延后,Bm Daxx和Bm Dredd基因也同时被显著抑制,不能触发家蚕丝腺大面积凋亡的进行,因此五龄发育时间被延长。而在高温条件下Bm30kc6基因表达的峰值被提前,Bm Fadd、Bm Daxx及Bm Dredd基因表达量也同时升高。使得家蚕丝腺快速凋亡,缩短了五龄发育的经过。

关键词：家蚕后部丝腺蜕皮激素保幼激素凋亡相关基因

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