检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：杨志明南京农业大学

学位级别：博士

保幼激素和蜕皮激素作为两类重要的内分泌激素,广泛参与节肢动物的生长发育和生殖等生命进程。在研究的最为系统的节肢动物昆虫中,其蜕皮、变态和繁殖主要由保幼激素III(juvenile hormone III,JH III)和20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdyson... 详细信息

保幼激素和蜕皮激素作为两类重要的内分泌激素,广泛参与节肢动物的生长发育和生殖等生命进程。在研究的最为系统的节肢动物昆虫中,其蜕皮、变态和繁殖主要由保幼激素III(juvenile hormone III,JH III)和20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)协同调控。JH III和20E的合成、转运、信号传递及代谢等在昆虫中已经有了大量的研究,特别是在以黑腹果蝇和冈比亚按蚊等为代表的模式昆虫中取得了显著的进展。同样作为节肢动物重要类群的蛛形纲动物,随着部分物种转录组或基因组测序工作的开展,其保幼激素和蜕皮激素的相关研究也取得了突出进展,主要集中在以二斑叶螨和肩突硬蜱为代表的蜱螨亚纲动物中,但是在蜘蛛亚纲动物中却鲜有报道。拟环纹豹蛛[Pardosa pseudoannulata(B?senberg&Strand,1906)]作为稻田生态系统中的优势天敌,以种群数量大、捕食能力强等特点,在稻田害虫(如稻飞虱、稻叶蝉等)的生物防治工作中起着重要作用。但是,关于拟环纹豹蛛保幼激素和蜕皮激素的合成及其在蜘蛛生长发育和生殖中的作用,以及激素类似物杀虫剂对蜘蛛的影响等相关研究却很少。本文以拟环纹豹蛛基因组数据为基础,以比较基因组分析、LC-MS/MS和RNAi等技术为手段,主要开展了以下的工作: 1、拟环纹豹蛛内源保幼激素的鉴定及其合成通路基因的分析。在拟环纹豹蛛基因组中鉴定到了除CYP15A1以外的保幼激素合成通路所有基因。采用LC-MS/MS技术,在拟环纹豹蛛中鉴定到了甲基法尼酯(methyl farnesoate,MF),且未检测到JH III。施加外源MF会显著延迟幼蛛的蜕皮、抑制保幼激素合成通路基因的表达,该结果表明,拟环纹豹蛛缺失CYP15A1,MF为内源活性保幼激素。在拟环纹豹蛛基因组中共鉴定到了8个保幼激素酸甲基转移酶(juvenile hormone acid methyltransferase,JHAMT)基因,它们具有S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的经典折叠结构和保守功能域,其中单独定位于13号染色体上的JHAMT-1与昆虫JHAMT氨基酸序列的相似度高于串联分布在1号染色体上的其余7个JHAMT。鉴定发现,其他蛛形纲生物的JHAMT基因也发生了不同程度的扩张,且总有一个JHAMT与昆虫的JHAMT聚类在一起,因此推测蛛形纲生物JHAMT基因的扩张事件发生在其与昆虫纲生物进化分离之后。在拟环纹豹蛛中,施加JHAMT的底物法尼酸,可以显著引起JHAMT-1、JHAMT-2和JHAMT-3的表达变化。干扰这3个JHAMT的表达会显著增加幼蛛的体重、加快幼蛛的蜕皮,该结果表明,JHAMT在拟环纹豹蛛的生长发育中发挥着重要作用。此外,采用苯氧威(5.95 g/L)处理拟环纹豹蛛,会显著延迟幼蛛的蜕皮、上调保幼激素合成通路基因的表达,该结果表明,保幼激素类似物杀虫剂会影响拟环纹豹蛛的生长发育。 2、拟环纹豹蛛内源蜕皮激素的鉴定及其合成通路基因的分析。在拟环纹豹蛛基因组中鉴定到了CYP307A1、CYP302A1、CYP315A1和CYP314A1等4个蜕皮激素合成通路Halloween基因,而未发现CYP306A1。采用LC-MS/MS技术,在拟环纹豹蛛中鉴定到了百日青蜕皮酮A(ponasterone A,PA),且未检测到20E。施加外源PA会显著加快幼蛛的蜕皮、提高幼蛛的蜕皮率、抑制Halloween基因的表达,该结果表明,拟环纹豹蛛缺失CYP306A1,PA为内源活性蜕皮激素。拟环纹豹蛛Halloween基因符合蜕皮激素合成通路基因的经典表达模式,即表达量随着二龄幼蛛的发育逐渐增加,在幼蛛蜕皮前表达丰度最高,蜕皮后随即下降。雌成蛛期的Halloween基因主要在卵巢中高表达。在拟环纹豹蛛中,分别干扰幼蛛和雌成蛛CYP307A1的表达均会显著抑制蜕皮激素合成通路下游Halloween基因的表达。同时,在幼蛛中,会显著延迟蜘蛛的蜕皮;在雌蛛中,发生了雌蛛食卵的现象,且大量的卵袋内是未发育的无效卵,该结果表明,CYP307A1在拟环纹豹蛛的生长发育和生殖中发挥着重要作用。此外,采用虫酰肼(5 g/L)处理拟环纹豹蛛,会显著加快幼蛛的蜕皮、抑制Halloween基因的表达,该结果表明,蜕皮激素类似物杀虫剂会影响拟环纹豹蛛的生长发育。 3、蜕皮激素受体和超气门蛋白在拟环纹豹蛛生长发育和生殖中的作用。在拟环纹豹蛛基因组中共鉴定到了23个核受体基因,包括1个蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)基因和2个超气门蛋白(ultraspiracle,USP)基因。龄期表达谱显示,EcR和USP-2在幼蛛中高表达,USP-1在卵和雌成蛛中高表达;EcR和2个USP在二龄幼蛛中的表达模式与Hallo

关键词：拟环纹豹蛛保幼激素蜕皮激素生长发育生殖

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保幼激素和蜕皮激素对家蚕翅原基生长分化的影响

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华南师范大学学报（自然科学版） 2017年第4期49卷 62-67页

作者：胡启豪刘学术马琼冯启理邓惠敏华南师范大学生命科学学院广州市昆虫发育调控与应用重点实验室广州510631

文中以家蚕翅原基为材料,通过制做离体石蜡切片的方法观察了翅原基从五龄幼虫第3天至蛹期0天的形态变化,并通过注射外源蜕皮激素活性物质20E和保幼激素类似物Methoprene探究了昆虫激素对家蚕翅原基生长分化的影响.结果显示,翅原基在幼... 详细信息

文中以家蚕翅原基为材料,通过制做离体石蜡切片的方法观察了翅原基从五龄幼虫第3天至蛹期0天的形态变化,并通过注射外源蜕皮激素活性物质20E和保幼激素类似物Methoprene探究了昆虫激素对家蚕翅原基生长分化的影响.结果显示,翅原基在幼虫阶段发育缓慢,从五龄幼虫第6天起生长分化逐渐加快,且翅原基的形态发生了显著变化,原本附着于翅原基腔口处且呈团状的造血器官逐渐分散至消失,而由气管组成的翅脉逐渐形成.外源激素处理结果显示,2μg的20E可促进翅原基的生长分化,而2μg的Methoprene抑制了翅原基的生长分化.上述结果说明蜕皮激素和保幼激素共同调控了翅原基的生长分化,并最终实现了翅原基的变态发育.

关键词：家蚕翅原基生长分化蜕皮激素保幼激素

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家蚕GMC氧化还原酶家族的鉴定和注释及蜕皮激素3位异构化途径相关基因的功能分析

家蚕GMC氧化还原酶家族的鉴定和注释及蜕皮激素3位异构化途径相关...

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作者：孙伟西南大学

学位级别：博士

GMC氧化还原酶家族(Glucose-Methanol-Choline oxidoreductase family)是生物体内众多氧化还原酶类的一种。该酶家族成员广泛地分布于多种生物体中,在生物体发育及代谢过程中发挥着重要的作用,如参与葡萄糖和胆碱代谢等。GMC氧化还原酶... 详细信息

GMC氧化还原酶家族(Glucose-Methanol-Choline oxidoreductase family)是生物体内众多氧化还原酶类的一种。该酶家族成员广泛地分布于多种生物体中,在生物体发育及代谢过程中发挥着重要的作用,如参与葡萄糖和胆碱代谢等。GMC氧化还原酶家族在昆虫基因组中是一个较大的家族,并且在不同昆虫中具有一定的保守性。尽管如此,昆虫中GMC氧化还原酶的功能研究仍然较少。本研究以家蚕为模式,研究了家蚕GMC氧化还原酶的进化历程和表达特征,并探究了GMC基因在家蚕抵抗病原微生物过程中的作用。蜕皮激素氧化酶(Ecdysone Oxidase,EO)属于GMC氧化还原酶家族,是蜕皮激素3位异构化途径上的限速酶。蜕皮激素3位异构化途径在很多昆虫,尤其是鳞翅目昆虫体内均有发现。蜕皮激素的代谢对于保持昆虫体内蜕皮激素正确的滴度变化致关重要。蜕皮激素3位异构化途径在这个过程中究竟有多大作用还未有研究。本研究从家蚕中克隆了蜕皮激素3位异构化途径上的两个关键基因—EO和3DE-3a-reducase的候选基因。通过真核表达表达出候选蛋白,酶活测定证实了他们的活性,并通过实验验证了这两个基因在家蚕食桑期和变态期的功能。所取得研究结果如下： 1.家蚕基因组中GMC氧化还原酶家族的鉴定及注释本研究在家蚕基因组中鉴定出43个GMC基因,该数目在现今已测基因组的昆虫中是最多的。同其它昆虫中相似,家蚕flotillin-2基因第二内含子里有一个高度保守的GMC基因簇,串联排布着15个GMC基因。然而在这个保守的GMC基因簇外,家蚕GMC基因经历了一个大的扩增。系统发生分析表明家蚕GMCB亚家族包含22个基因,其中有18个位于保守的GMC基因簇外,我们称之为家蚕扩增基因(Silkworm Expansion genes, SEs)。家蚕GMCB亚家族成员的扩增是导致家蚕GMC氧化还原酶基因数目较大的主要原因。GMCβ亚家族中有18个基因(SEs)散在地分布在基因组中,相对进化速率分析表明SEs的进化速率显著快于保守的GMC基因簇内的GMCB亚家族成员,这种快速的进化速率暗示了它们功能的分化。 2.家蚕基因组中GMC氧化还原酶基因的表达及其在免疫体系中的作用利用RT-PCR的方法分析GMC基因,尤其是GMCβ亚家族基因在家蚕组织和时期的表达。结果表明家蚕GMCβ亚家族成员在组织和时期的表达模式多有不同,即使在系统发生树上聚类在一起的基因的表达模式也有差异,暗示了GMCβ亚家族成员在进化过程中有了功能的分化。利用病原菌感染家蚕后制备的基因芯片的数据,分析了家蚕GMC基因的表达变化。结果发现在病原微生物感染后,有16个GMC基因的表达上调,有意思的是在这16个基因中,有14个属于GMCB亚家族。进一步的实验证实干涉其中三个上调表达的基因(BmGMC1, BmGMC12和BmGMCJ33)能显著降低家蚕对病原微生物的抵抗能力,说明家蚕GMCβ亚家族的扩增和家蚕抵抗外源微生物的侵染有关。 3.家蚕蜕皮激素氧化酶和3DE-3a-还原酶的鉴定利用海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis) EO和3DE-3α-reducase基因编码的氨基酸序列,分别在家蚕中鉴定出了这两个基因的候选。通过RACE技术获得了候选基因的全长序列。在毕赤酵母中异源表达两个候选基因,我们检测表达的蛋白分别具有EO和3DE-3α-reducase活性。表达分析表明BmEO基因只在中肠表达,蛋白质定位于中肠杯状细胞细胞质内。家蚕Bm3DE-3α-reducase基因在中肠和马氏管中均有表达,表达的蛋白位于中肠杯状细胞细胞质及马氏管主细胞内。时期表达分析,这两个基因均从家蚕5龄开始时表达,在食桑期有持续表达,并在变态期高量表达。结果表明这两个基因的表达与蜕皮激素滴度变化是相关的。4.家蚕蜕皮激素氧化酶和3DE-3a-还原酶的功能研究家蚕BmEO和Bm3DE-3α-reducase基因在食桑期和变态期均有表达,暗示了蜕皮激素3位异构化途径在家蚕这两个时期都会起作用。利用RNA干涉等实验来证实蜕皮激素3位异构化途径在这两个时期的作用。在食桑期,我们发现家蚕会通过该途径来降解桑叶中的植源性蜕皮激素,而当该途径异常时,家蚕会启动或增强另一个蜕皮激素代谢途径——cyp18α1基因参与的C26位的羟基化及氧化途径来降解植源性蜕皮激素,说明家蚕在降解植源性蜕皮激素的过程中具有一定的冗余性。在变态期,分别降低EO和3DE-3α-reducase基因表达后,家蚕体内蜕皮激素的滴度较高,受蜕皮激素响应的核受体基因表达异常,并且家蚕在上蔟期和蛹期的死亡率显著升高,说明蜕皮激素3位异构化途径对于家蚕的变态发育是十分重要的。从本研究所得到的结果,我们发现GMC氧化还原酶家族基因在进化过

关键词：家蚕 GMC氧化还原酶家族蜕皮激素变态蜕皮激素氧化酶 3DE-3a-还原酶

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桔小实蝇蜕皮激素合成和信号通路基因调控与功能研究

桔小实蝇蜕皮激素合成和信号通路基因调控与功能研究

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作者：丛林西南大学

学位级别：博士

桔小实蝇Bactrocera dorsalis (Hendel)隶属于双翅目Diptera,实蝇科Tephritidae,是一种在世界范围内广泛分布的重要农业害虫。桔小实蝇成虫产卵于果皮内,幼虫孵化后在果实内取食危害,严重降低果实经济和食用价值;加之其成虫寄主范围广... 详细信息

桔小实蝇Bactrocera dorsalis (Hendel)隶属于双翅目Diptera,实蝇科Tephritidae,是一种在世界范围内广泛分布的重要农业害虫。桔小实蝇成虫产卵于果皮内,幼虫孵化后在果实内取食危害,严重降低果实经济和食用价值;加之其成虫寄主范围广、适应性和繁殖力以及扩散能力强等特点,该虫被许多国家列为检疫对象,成为国际贸易的技术壁垒。与其他昆虫一样,桔小实蝇不能依赖自身物质从头合成蜕皮激素,只能是将其取食获得的植物甾醇或动物胆固醇进行一系列相应的代谢而产生。负责该过程的是一类名为‘’Halloween gene"的P450多功能氧化酶,将植物甾醇最终氧化成为最具生物活性的20-羟基蜕皮酮(20E),调控昆虫胚胎发育、幼虫生长与变态、蛹期形态建成以及成虫交配繁殖等整个过程。合成的20E可诱导蜕皮激素受体EcR表达,当EcR达到一定阈值后,与其配体USP形成功能性的EcR/USP异二聚体。随后,再与20E进行结合,形成20E-EcR/USP复合体,起始20E信号传递,并介导产生一系列早期和晚期级联反应,最终影响细胞的增殖、分化,甚至程序性死亡。随着RNAi技术的出现与成熟,基因功能的研究进入一个崭新的阶段。借助该技术,可以重新发现基因新功能、探索未知基因功能,是生物反应、药物筛选、疾病治疗、害虫防治等研究的有力手段,极大地加快了分子生物学研究步伐,具有广阔的应用前景。本学位论文以柑桔重要害虫桔小实蝇为研究对象,利用RT-PCR和RACE技术,克隆获得桔小实蝇蜕皮激素合成和信号通路基因全长序列,对其特征序列进行注释并确定其系统发育关系;在此基础上运用qPCR技术分析这些基因在桔小实蝇胚后发育各阶段和幼虫不同组织中的表达及分布情况;同时,结合生测试验,明确幼虫在饥饿胁迫条件下的生物学变化和上述基因转录水平情况,明确桔小实蝇的应激响应机制,为其综合防治提供依据。昆虫生长发育是受激素严格控制的过程,在农业生产中常用激素类似物质来干扰害虫的正常生长,从而达到控害的目的。因此,本研究还利用微量注射技术,研究外源20E对桔小实蝇幼虫发育、变态及蜕皮激素合成和信号通路基因表达的影响。最后,利用RNAi技术明确桔小实蝇蜕皮激素受体BdEcR-B1在幼虫阶段的20E信号传导中的作用。加深桔小实蝇变态发育的分子调节和作用机制的研究,尤其是对蜕皮激素合成和信号传导通路对其发育变态的分子调控模式,及其在逆境胁迫条件下的应激响应机制,将有助于明确各基因在通路中的功能及其调节方式,为转基因技术在害虫控制中的应用提供潜在作用靶标,同时为新型农药开发提供理论依据。本研究主要研究结果如下： 1桔小实蝇蜕皮激素合成与信号通路基因克隆与序列分析基于对桔小实蝇转录组数据分析的基础上,利用RT-PCR和RACE技术,克隆获得了桔小实蝇蜕皮激素合成和信号通路上7个基因的cDNA全长序列,并完成在GenBank登录,其基因名称和登录号分别为BdCyp302α1(JQ027284)、 BdCyp315α1(KC515377)、BdCyp314α1(JQ229645)、BdEcR-B1(JQ034623)、 BdE75(KC515378)、BdL63(KC515379)和BdTaiman (JQ266268)。利用分子生物学软件对上述基因进行分析,明确其开放阅读框ORF、氨基酸序列、理化性质、跨膜结构域等,并对其保守结构域进行了鉴定和详细注释。分析发现,桔小实蝇蜕皮激素合成通路基因BdCyp302α1、BdCyp315α1和BdCyp314α1均属于"Halloween"基因家族,具有细胞色素氧化酶P450所特有签名序列：Helix-I、 Helix-K、底物识别性位点和血红蛋白结合位点等结构。桔小实蝇的BdCyp302α1和BdCyp314α1属于线粒体型,而BdCyp315α1属于微粒体细胞色素氧化酶。在蜕皮激素信号通路基因的研究中发现,桔小实蝇BdEcR-B1具有典型核受体保守结构域和微结构域,如DNA结合域和配体结构域等结构,双翅目昆虫EcR-B1亚型所特有的K/RRRW、S-rich、DL-rich、EESST/SEVV/TSS等特征基序。与BdEcR-B1相同,BdE75同属于核受体基因家族,具有其典型的配体结合域以及DNA结合域,其内含量2个C4锌指结构,在蜕皮激素信号通路上起初级响应元件的作用。BdL63序列N端具有cyclin-dependent kinase结构。BdTaiman属于p160核受体共激活子家族,具有basic helix-loop-helix (bHLH)结构域及乙酰化典型结构基序LxxLL。 2桔小实蝇蜕皮激素合成与信号通路基因的表达模式分析 2.1桔小实蝇蜕皮激素合成与信号通路基因在不同发育阶段的表达模式在成功建立桔

关键词：桔小实蝇蜕皮激素合成通路信号通路 qPCR RNAi

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新入侵害虫蔗扁蛾蛹期蜕皮激素的定性定量分析

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科学通报 2006年第8期51卷 919-922页

作者：王方海张古忍温瑞贞何国锋中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室昆虫学研究所广州510275

利用液相色谱和放射免疫分析法对新入侵害虫蔗扁蛾Opogona sacchari(Bojer)蛹内的蜕皮激素进行了定性和定量分析,以期明确蔗扁蛾蛹内蜕皮激素的主要组分及动态变化规律．蔗扁蛾蛹期的蜕皮激素种类主要是20-羟基蜕皮激素．无论雄蛹还是雌... 详细信息

利用液相色谱和放射免疫分析法对新入侵害虫蔗扁蛾Opogona sacchari(Bojer)蛹内的蜕皮激素进行了定性和定量分析,以期明确蔗扁蛾蛹内蜕皮激素的主要组分及动态变化规律．蔗扁蛾蛹期的蜕皮激素种类主要是20-羟基蜕皮激素．无论雄蛹还是雌蛹,整个蛹期蜕皮激素含量起初逐渐升高,达到一个明显的峰值(每蛹80 ng左右)后则逐渐下降,至蛹后期的几天里,蜕皮激素含量相对水平较低,为每蛹30 ng左右．雄蛹的峰值只出现在第3天,而雌蛹的峰植较为平缓,横跨在第2～4天间．特定蛹期(第1,2,4,5,6天),雌蛹蜕皮激素含量明显高于雄蛹．同时发现,蛹期4 d后,后半蛹的蜕皮激素含量均明显高于前半蛹．

关键词：蔗扁蛾蜕皮激素蛹

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Bt抗性小菜蛾蜕皮激素20E含量升高的分子机制研究

Bt抗性小菜蛾蜕皮激素20E含量升高的分子机制研究

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作者：程周强湖南农业大学

学位级别：硕士

小菜蛾Plutella xylostella(L.)是危害十字花科作物的世界性害虫,全球每年因其造成的经济损失高达40–50亿美元。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)属于革兰氏阳性细菌,其在产胞过程中形成的多种蛋白晶体对昆虫具有高效和专一... 详细信息

小菜蛾Plutella xylostella(L.)是危害十字花科作物的世界性害虫,全球每年因其造成的经济损失高达40–50亿美元。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)属于革兰氏阳性细菌,其在产胞过程中形成的多种蛋白晶体对昆虫具有高效和专一的杀虫活性。然而,由于Bt生物制剂和转Bt作物大量使用与种植,导致多种昆虫对其产生抗性。小菜蛾是第一个被报道在田间对Bt制剂产生抗性的昆虫,因此小菜蛾是研究昆虫Bt抗性分子机制的良好模式昆虫。本实验室前期研究发现,小菜蛾Bt抗性种群中蜕皮激素(20E)含量升高激活有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号途径,反式调控小菜蛾Bt毒素中肠受体和非受体基因的表达,从而导致小菜蛾对Bt Cry1Ac毒素产生高抗性。然而小菜蛾Bt抗性种群中20E含量升高的分子机制尚不清楚。本研究利用昆虫毒理学、分子生物学、生物化学和分子遗传学进一步探究小菜蛾20E含量上升的分子机制。研究发现,小菜蛾Bt抗性种群幼虫中肠蜕皮激素氧化酶基因PxEO表达量显著下调,功能试验确定其下调导致小菜蛾幼虫体内20E含量升高,从而导致小菜蛾对Bt产生高抗性。研究结果为揭示昆虫Bt抗性分子机制和开发新型Bt相关生物产品提供重要的理论基础。主要研究内容和结论如下:(1)小菜蛾PxEO基因的克隆与分析。通过Gen Bank、小菜蛾基因组和转录组数据库检索获得小菜蛾蜕皮激素氧化酶PxEO基因序列。利用PCR克隆技术获得全长序列。对小菜蛾Bt敏抗性种群大量克隆子测序未发现PxEO基因在Bt抗性种群发生稳定的突变。(2)小菜蛾PxEO基因表达量降低与Bt抗性相关。通过实时荧光定量检测发现在小菜蛾Bt抗性种群中肠组织PxEO基因表达量显著降低。Bt Cry1Ac原毒素诱导处理小菜蛾DBM1Ac-S种群幼虫发现PxEO基因表达量显著降低。RNAi沉默小菜蛾DBM1Ac-S种群幼虫PxEO基因和20E处理均降低幼虫对Bt Cry1Ac原毒素的敏感性。遗传连锁试验证明小菜蛾PxEO基因表达量降低与Bt抗性连锁。(3)小菜蛾PxEO基因与20E相关。通过检测小菜蛾DBM1Ac-S种群3龄幼虫到蛹期的PxEO基因表达量和20E滴度变化,发现两者基本呈现相反的变化趋势。此外RNA干扰沉默DBM1Ac-S种群PxEO基因表达导致小菜蛾幼虫20E滴度上升,而注射20E后显著增加PxEO基因的表达量。总之,本研究鉴定了小菜蛾蜕皮激素氧化酶基因PxEO序列,并阐明小菜蛾Bt抗性种群中PxEO基因表达量降低是导致20E含量升高和Bt抗性的重要原因。因此,该研究进一步揭示了小菜蛾Bt抗性的分子机制。

关键词：小菜蛾苏云金芽胞杆菌蜕皮激素蜕皮激素氧化酶 Bt抗性机制

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ABA对悬浮培养匍枝筋骨草蜕皮激素的影响

ABA对悬浮培养匍枝筋骨草蜕皮激素的影响

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作者：杨月月东北林业大学

学位级别：硕士

本文实验在匍枝筋骨草悬浮培养体系建立的基础上进行研究,分别向已培养7d的体系中添加不同浓度的脱落酸(ABA),根据悬浮细胞的生长状况、生物量以及蜕皮激素含量,筛选出最适宜添加浓度;分析ABA对匍枝筋骨草悬浮细胞内防御酶活性的影响、... 详细信息

本文实验在匍枝筋骨草悬浮培养体系建立的基础上进行研究,分别向已培养7d的体系中添加不同浓度的脱落酸(ABA),根据悬浮细胞的生长状况、生物量以及蜕皮激素含量,筛选出最适宜添加浓度;分析ABA对匍枝筋骨草悬浮细胞内防御酶活性的影响、细胞内源激素以及中间产物的含量变化;并利用Illumina技术进行了转录组测序分析,了解匍枝筋骨草悬浮细包经ABA处理后的差异基因表达情况。通过生理生化实验以及ABA对匍枝筋骨草悬浮细胞分子应答情况,探讨匍枝筋骨草悬浮细胞生长的影响。结果表明:添加0.15mg/L ABA后细胞在未褐化期,培养液中糖的消耗量增加,蜕皮激素(20E)及蜕皮激素合成途径中间产物甲羟戊酸和角鲨烯的含量均有所上升;添加ABA后细胞内防御酶CAT、POD、SOD活性上升;添加ABA后细胞内的ZR、IAA、GA3含量呈下降趋势,而ABA含量呈升高趋势;经ABA处理后匍枝筋骨草细胞共154个基因表达有显著差异,上调表达的基因有99个,下调表达的基因有55个。与蜕皮激素合成相关的ko00900萜类合成主干通路有6个基因差异表达,ko00100甾体合成通路有4个基因差异表达,ko00140甾体激素生物合成通路有6个基因差异表达:在添加ABA后的第4d时悬浮细胞出现了褐化现象;

关键词：匍枝筋骨草脱落酸蜕皮激素转录组差异基因

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G蛋白偶联受体倡导的蜕皮激素非基因组途径和保幼激素抑制变态的分子机理

G蛋白偶联受体倡导的蜕皮激素非基因组途径和保幼激素抑制变态的...

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作者：蔡美娟山东大学

学位级别：博士

研究背景及存在的科学问题：\n 昆虫的生长和变态主要由蜕皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(juvenilehormone，JH)调控。在幼虫生长期高滴度JH存在的条件下，20E滴度增加调控幼虫不同龄期间的蜕皮。在末龄幼虫转变为成虫... 详细信息

研究背景及存在的科学问题：\n 昆虫的生长和变态主要由蜕皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(juvenilehormone，JH)调控。在幼虫生长期高滴度JH存在的条件下，20E滴度增加调控幼虫不同龄期间的蜕皮。在末龄幼虫转变为成虫的变态期，JH滴度下降或消失，20E起始变态。20E的主要功能是促进蜕皮与变态，而JH主要维持幼虫状态。二者在体内的滴度比例交互变化，功能既拮抗又统一，协同调控昆虫发育。由于20E是小分子脂溶性激素，早期研究认为20E通过渗透进入细胞膜，与胞内受体ecdysonereceptor(EcR)结合，在热休克蛋白帮助下与超气门蛋白ultraspiracle(USP)形成EcR-USP转录复合体，结合在DNA启动子上，启动下游基因转录，实现蜕皮与变态，即20E基因组途径。目前已有一些研究报道20E能够通过细胞膜上的G蛋白偶联受体(GPCRs)引起Ca2+信号增强，蛋白快速移位和磷酸化，环腺苷酸水平升高等细胞快速应答反应，这暗示20E存在非基因组途径。JH也是小分子脂类激素，研究认为JH也是通过渗透进入细胞内，结合胞内受体methoprene-tolerant(Met)调控基因转录。\n 20E和JH通过调控不同的基因转录控制昆虫的生长和变态。研究报道绝缘小体蛋白modifierofmdg4[mod(mdg4)]通过与转录因子SuppressorofHairy-wing[Su(Hw)]形成绝缘小体来调控基因转录及细胞凋亡。变态期昆虫的中肠在20E调控下发生程序性细胞死亡(PCD)，mod(mdg4)是否参与调控昆虫变态期组织PCD相关基因表达还没有报道。GPCRs是最大的膜蛋白家族，它们参与调控激素、神经递质等激活的细胞生理反应。在果蝇中发现多巴胺GPCR受体可以结合蜕皮激素，家蚕丝腺中GPCR参与了蜕皮激素调控的程序性细胞死亡，但蜕皮激素的GPCR受体及介导的信号途径少有报道。Broad(Br)是一种重要的转录因子，20E调控Br高表达起始变态。在幼虫生长期，JH通过抑制Br表达来抑制20E途径，但给幼虫注射JH却能够上调Br表达并抑制变态过程，JH调控Br表达的分子机制尚未阐明。另外Br蛋白本身的稳定性问题也研究甚少。本论文选择mod(mdg4)、GPCRs和Br作为靶标基因，研究蜕皮激素的非基因组途径及保幼激素抑制变态的分子机理，丰富激素调控昆虫发育的理论知识，为害虫控治提供靶标基因。\n 研究结果与结论：\n ***(mdg4)1A蛋白参与激素调控的中肠程序性细胞死亡\n Mod(mdg4)1A在变态期的表皮、中肠和脂肪体中高表达，并定位于变态期幼虫中肠。当mod(mdg4)1A被干扰后，幼虫变态过程被延迟，中肠PCD被抑制，促进PCD和变态发生的相关基因的转录被显著抑制。20E并不通过经典的EcRB1-USP1基因组途径上调mod(mdg4)1a表达，而Methoprene可以通过JH核受体Met1上调mod(mdg4)1a表达。20E和methoprene可以分别上调mod(mdg4)1a表达，但叠加却抑制mod(mdg4)1a表达。结论:mod(mdg4)1A在20E和JH调控下通过调控基因网络的转录水平参与中肠PCD和变态。\n 2.G蛋白偶联受体ErGPCR在细胞膜上参与蜕皮激素介导的信号途径\n ErGPCR在幼虫的蜕皮期和变态期高表达。当虫体注射dsErGPCR后，幼虫-蛹的转变和20E应答基因的转录均被抑制，而细胞系过表达ErGPCR增强20E应答基因表达。沉默ErGPCR能够抑制胞内Ca2+浓度增加并抑制20E诱导的Calponin快速入核和磷酸化。T型电压门控钙离子通道抑制剂和经典瞬时受体电压钙离子通道抑制剂能够抑制20E诱导的胞内Ca2+浓度升高，并抑制基因表达和蛋白质磷酸化。N末端缺失的ErGPCR突变体定位于细胞质并不能增强20E相关基因转录。ErGPCR不能与20E类似物[3H]IPonA结合。20E可以通过ErGPCR调控EcRB1-USP1基因组途径，也可以通过ErGPCR而不通过EcRB1-USP1调控mod(mdg4)1A表达。结论:20E通过ErGPCR调控Calponin快速入核和磷酸化，诱导胞内Ca2+浓度升高，调控20E应答基因表达并参与幼虫-蛹的转变过程。\n ***通过调控新型BroadⅡ磷酸化抑制变态\n 本研究从棉铃虫中发现一种新型Br蛋白BroadⅡ(BrZ-Ⅱ)。虫体干扰BrZ-Ⅱ后，幼虫的变态过程和20E应答基因的转录均被显著抑制。在幼虫生长时期，BrZ-Ⅱ表达量比较低并处于磷酸化状态;而在变态时期，BrZ-Ⅱ保持高表达的非磷酸化状态。G蛋白偶联受体，磷脂

关键词：棉铃虫蜕皮激素保幼激素细胞程序性死亡 G蛋白偶联受体分子机理

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沙葱萤叶甲对蜕皮激素响应的转录组分析

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环境昆虫学报 2023年第1期45卷 155-162页

作者：姚知含李玲庞保平单艳敏季彦华刘东力内蒙古农业大学草原昆虫研究中心呼和浩特010020 内蒙古林业和草原有害生物防治检疫总站呼和浩特010051

为建立沙葱萤叶甲Gauleruca daurica成虫对蜕皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)响应的转录组数据库,挖掘对20E响应的基因以及代谢和信号通路,并在转录组水平探讨20E调控生殖滞育的分子机制,本研究采用Illumina HiSeqTM4000高通量测序平台... 详细信息

为建立沙葱萤叶甲Gauleruca daurica成虫对蜕皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)响应的转录组数据库,挖掘对20E响应的基因以及代谢和信号通路,并在转录组水平探讨20E调控生殖滞育的分子机制,本研究采用Illumina HiSeqTM4000高通量测序平台对20E及二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)处理后的沙葱萤叶甲成虫进行了转录组测序,共获得80 313个unigene;与阴性对照DMSO相比,共获得201个差异表达基因,其中106个上调、95个下调。GO和KEGG富集分析表明,多数差异表达功能基因富集于各种代谢通路,其中核黄素代谢(riboflavin metabolism)、溶酶体(lysosome)和泛酸与乙酰辅酶A合成(pantothenate and CoA biosynthesis)通路显著富集(q<0.05)。结果表明,20E可能通过影响多种代谢通路调控沙葱萤叶甲的生殖滞育。

关键词：沙葱萤叶甲转录组蜕皮激素生殖滞育代谢通路

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周期蛋白依赖的激酶10、磷脂酶C伽马1及热休克蛋白90在昆虫蜕皮激素信号转导途径中的功能研究

周期蛋白依赖的激酶10、磷脂酶C伽马1及热休克蛋白90在昆虫蜕皮激...

引用

作者：刘文山东大学

学位级别：博士

研究背景由于昆虫个体发育阶段明显分为蜕皮和变态,所以科学家将其作为研究多细胞生物发育转变分子机理的理想模式系统。自从Stefan Kopec对舞毒蛾变态发育的研究开始(Kopec,1926),近一个世纪以来,科学家一直对昆虫内分泌的研究保持着... 详细信息

研究背景由于昆虫个体发育阶段明显分为蜕皮和变态,所以科学家将其作为研究多细胞生物发育转变分子机理的理想模式系统。自从Stefan Kopec对舞毒蛾变态发育的研究开始(Kopec,1926),近一个世纪以来,科学家一直对昆虫内分泌的研究保持着浓厚的兴趣。由于在舞毒蛾中的开拓性研究,导致了包括神经内分泌细胞(Kopec,1922)等一系列新颖概念的提出,从而大大促进了现代内分泌学的发展。近年来,由于分子生物学等各项技术的快速发展,科学家对昆虫蜕皮和变态这两个重要发育转变的分子机理有了更加深刻的认识。研究发现,这些发育转变受到昆虫内分泌系统严格的调控,而控制蜕皮和变态的激素主要是蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)和保幼激素(juvenile hormone, JH)。本领域存在的科学问题和研究意义在JH存在下,20E诱导昆虫在幼虫期的多次蜕皮；而当JH滴度下降时,20E促进昆虫从幼虫到蛹的变态发育。因此,20E和JH信号通路通过复杂的相互作用共同调控昆虫的发育,但是其分子机理还有待于进一步的研究。在20E信号通路中,20E诱导核受体EcR/USP的形成及共激活子的募集,从而形成具有DNA结合活性的转录复合体,最终调节基因转录。越来越多的研究表明,除了经典的核受体途径,在20E信号转导通路中还存在一种细胞膜介导的非基因组途径。但是,其机制还没有深入研究。在JH通路中,由于其受体Met的鉴定,JH信号通路的研究蔚然成风,但是关于20E和JH信号通路之间相互作用的机理还并不清楚。人类周期蛋白依赖的激酶10(cyclin-dependent kinase10, CDK10)可以与Hsp90发生相互作用,但是机理并不清楚。己知Hsp90参与调控EcR的DNA活性,并调节20E信号通路。另外,胰岛素可以有效诱导CDK10的快速磷酸化。这些现象暗示,CDK10可能通过与Hsp90的相互作用参与20E通路。同时,我们有必要探索20E能否诱导CDK10的快速磷酸化参与20E激活的非基因组途径。在家蚕和果蝇中的研究表明,20E可以通过细胞膜上的G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor, GPCR)诱导钙离子水平上调。果蝇中USP的磷酸化依赖于20E对PKC的激活。然而,20E诱导的钙信号与PKC激活的USP磷酸化之间的联系还没有报道。事实上,一种磷脂酶C(phospholipase C gamma1, PLCG1)可以承接GPCR信号并通过上调钙信号而激活PKC。所以,20E诱导的细胞膜信号与核受体信号之间的联系是否依赖于PLCG1则需要深入的探讨。在20E信号通路中,Hsp90和Hsc70(Hsp70同源蛋白)通过与果蝇EcR相互作用调节受体的DNA结合活性,但是当受体装配成转录复合体后,热休克蛋白则解离下来而并不出现在启动子区域的复合体中。然而也有文章报道,Hsp90可以调控盐皮质激素受体结合于启动子的不同位置,这暗示它可能参与到转录复合体中。另外Hsc70对于受体的循环和降解也起着至关重要的作用。因此,Hsp90和Hsc70是否参与棉铃虫20E信号转录复合体并调节转录,需要更进一步的研究。鉴于20E和JH能通过复杂的调控网络精密有效地控制昆虫发育,所以阐明20E和JH信号通路不仅能为害虫防治提供策略,也能够为研究人类内分泌系统的调节机理提供参考,最终服务于人类健康。研究方法与取得成果 1.20E通过诱导蛋白激酶CDK10的快速磷酸化调节蜕皮激素核受体在启动子上的装配利用RNA干扰技术下调幼虫和表皮细胞系中的CDK10阻碍了幼虫发育并抑制20E可诱导基因的转录。20E诱导CDK10的快速磷酸化,但是G蛋白偶联受体、磷脂酶C、钙离子通道等蛋白的抑制剂都能抑制此磷酸化。磷酸化的CDK10促进其与热休克蛋白(heat shock proteins, Hsps)Hsc70和Hsp90的相互作用,随后有助于更多的Hsc70和Hsp90与蜕皮激素受体EcRB1的相互作用,并最终促进Hsps-EcRB1复合体结合到20E应答元件上调控基因转录。下调CDK10可以抑制Hsps-EcRB1复合体在HR3启动子上的形成。以上结果说明,20E通过非基因组途径诱导CDK10磷酸化,并最终调控细胞核中的基因转录。 2. PLCG1将ErGPCR介导的20E膜信号与核受体信号有效连接通过RNA干扰沉默PLCG1后,20E诱导的昆虫化蛹被显著抑制,并导致幼虫死亡和化蛹缺陷,同时20E可诱导基因的表达被下调。20E诱导PLCG1发生酪氨酸磷酸化并向细胞膜迁移。Src激酶家族抑制剂PP2、沉默ErGPCR和Gaq都能抑制PLCG1的酪氨

关键词：棉铃虫蜕皮与变态蜕皮激素磷酸化非基因组途径基因组途径

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