检索结果-内蒙古大学图书馆

生物化学与生物物理学报 2000年第3期32卷 229-234页

作者：胡建红齐兵中西真人齐义鹏武汉大学病毒研究所!武汉430072 大阪大学微生物病研究所!大阪565 日本

仙台病毒的血凝素神经氨酸酶 (HN)在COS 7细胞中得到了表达。将具有表达功能的质粒转入非洲绿猴肾细胞LLCMK2 中 ,在抗生素筛选压力下连续传代 ,获得了具有抗生素抗药性的细胞系 ,表明HN基因已整合到该细胞的染色体中。尽管核酸酶S1实... 详细信息

仙台病毒的血凝素神经氨酸酶 (HN)在COS 7细胞中得到了表达。将具有表达功能的质粒转入非洲绿猴肾细胞LLCMK2 中 ,在抗生素筛选压力下连续传代 ,获得了具有抗生素抗药性的细胞系 ,表明HN基因已整合到该细胞的染色体中。尽管核酸酶S1实验结果表明 ,这些抗药性细胞内有大量HNmRNA的转录 ,但非直接免疫荧光和放射性免疫沉淀的结果却显示 ,细胞表面和细胞内部的HN蛋白的表达量很低。而仙台病毒持续感染的LLCMK2 细胞中却有大量的HN蛋白存在。这种转录与翻译不一致的现象 ,表明某些病毒因子对HN基因mRNA转录本的加工或翻译可能有正调控作用。同时也说明 ,在外源基因的表达过程中 ,没有可测定的表达蛋白也不一定就是没有该基因的转录。

关键词：仙台病毒血凝素神经氨酸酶转录翻译

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鸡新城疫病毒F48E9株血凝素神经氨酸酶基因免疫诱导免疫保护的初步研究

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中国农业科学 2002年第12期35卷 1565-1569页

作者：刘胜旺孔宪刚童光志马云燕卢景良中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家兽医生物技术重点实验室国家兽医生物技术重点实验室哈尔滨150001

将我国新城疫病毒标准强毒F4 8E9株的血凝素神经氨酸酶基因克隆于真核表达载体 pcDNA3 中 ,进行鉴定后筛选阳性质粒。将此阳性质粒进行大量法提取并纯化后作为基因疫苗以每只鸡 10 0 μg的剂量肌肉接种 4 5日龄SPF鸡 ,并以 pcDNA3 空... 详细信息

将我国新城疫病毒标准强毒F4 8E9株的血凝素神经氨酸酶基因克隆于真核表达载体 pcDNA3 中 ,进行鉴定后筛选阳性质粒。将此阳性质粒进行大量法提取并纯化后作为基因疫苗以每只鸡 10 0 μg的剂量肌肉接种 4 5日龄SPF鸡 ,并以 pcDNA3 空质粒作为对照。结果表明 ,新城疫基因疫苗能够诱导机体产生新城疫病毒特异的血清IgG抗体反应 ,但产生抗体所需的时间较长 ,抗体滴度的增加较为缓慢。人工接种新城疫强毒后 ,基因疫苗免疫组 4 / 6的鸡得到保护 ,而且保护鸡具有明显的抗体反应 ,2只鸡未得到保护 ,但其死亡时间明显迟于对照组鸡 ,死亡鸡具有典型的新城疫病毒感染鸡的病理形态学变化。

关键词：鸡新城疫F48E9病毒血凝素神经氨酸酶基因疫苗

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新城疫病毒HN糖蛋白促细胞融合区域内保守氨基酸基因突变分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2012年第4期32卷 351-357页

作者：褚福禄温红玲林彬孙成玺李振梅宋艳艳许洪芝王志玉山东大学公共卫生学院病毒学研究室济南250012 山东省疾病预防控制中心艾滋病防治所

目的确定新城疫病毒（NDV）血凝素神经氨酸酶（HN）糖蛋白促细胞融合区域内的保守氨基酸功能，探讨HN糖蛋白的促细胞融合机制。方法采用PCR定点突变与体内同源重组相结合的方法将HN糖蛋白促细胞融合区域内6个保守氨基酸突变为丙氨酸（A... 详细信息

目的确定新城疫病毒（NDV）血凝素神经氨酸酶（HN）糖蛋白促细胞融合区域内的保守氨基酸功能，探讨HN糖蛋白的促细胞融合机制。方法采用PCR定点突变与体内同源重组相结合的方法将HN糖蛋白促细胞融合区域内6个保守氨基酸突变为丙氨酸（A），在BHK21细胞内表达后，流式细胞仪定量分析蛋白的表达效率，并分别检测其促细胞融合活性、血细胞吸附能力（也称为受体识别活性）和神经氨酸酶活性。结果L74A蛋白表达效率降低为72．7％，各突变株蛋白表达效率与野毒株相比差别无统计学意义（P〈0．05）。各突变株蛋白促细胞融合活性都有不同程度的下降，其中1103A下降幅度最大，为野毒株的9．1％，各突变株蛋白血细胞吸附能力也都出现不同程度的降低，其中1103A的下降最明显，为28．2％，各突变株蛋白的神经氨酸酶活性变化程度不同，其中L74A略有升高，为118．6％，L110A下降幅度最大，为5．2％，1103A仅次于L110A，为5．7％。结论新城疫病毒HN糖蛋白促细胞融合区域内的保守氨基酸在细胞融合中发挥着重要作用，第103位异亮氨酸（Ⅰ）是此区域内的关键氨基酸。

关键词：新城疫病毒细胞融合血细胞吸附血凝素神经氨酸酶

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新城疫病毒HN抗肿瘤机制研究进展

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安徽农业科学 2008年第32期36卷 14102-14102,14134页

作者：刘一尘程相朝张春杰程安春张谦李银聚吴庭才赵战勤河南科技大学动物科技学院河南洛阳471003 四川农业大学动物科技学院四川雅安625014 郑州后羿集团河南郑州450002

论述了HN抗肿瘤作用的机制,并对其发展前景作了展望。

关键词：新域疫病毒血凝素神经氨酸酶抗肿瘤机制

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新城疫病毒HN基因真核细胞定位表达的重组质粒的构建

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国际免疫学杂志 2009年第4期32卷 258-262页

作者：隋红李曦张永欣肖晶符芳李乐静白玉贤哈尔滨医科大学附属肿瘤医院内科 150040 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪病研究室 150001

目的构建定位表达于细胞不同部位的新城疫病毒HN（hemagglutinin—neuraminidase）基因。方法应用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术，以新城疫病毒D90株RNA为模板，分别扩增出含有HN基因全长和不含终止子的HN基因片段，将克隆的HN基... 详细信息

目的构建定位表达于细胞不同部位的新城疫病毒HN（hemagglutinin—neuraminidase）基因。方法应用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术，以新城疫病毒D90株RNA为模板，分别扩增出含有HN基因全长和不含终止子的HN基因片段，将克隆的HN基因片段经双酶切后定向插入真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中，经过定向插入组织凝血酶原激活物（tPA）的前导序列和／或A型流感病毒血凝素（HA）基因跨膜区（TM）片段进行修饰分别构建胞浆型、跨模型和分泌型DNA质粒。结果所有重组质粒经酶切和测序鉴定插入正确。经过体外转染真核细胞，间接免疫荧光和***蛋白质电泳检测，证明构建的新城疫病毒HN基因定位表达于真核细胞的胞浆、胞膜和细胞外。结论成功构建了定位表达于细胞不同部位的HN蛋白的DNA质粒即胞浆型、跨模型和分泌型。

关键词：新城疫病毒血凝素神经氨酸酶细胞定位质粒构建

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新城疫病毒HN蛋白膜外区的纯化

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动物医学进展 2019年第9期40卷 48-52页

作者：商雨李丽樊三铃李林涛唐国毅任助王红琳薛玉涵罗青平邵华斌温国元湖北省农业科学院畜牧兽医研究所湖北武汉430064 农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室湖北武汉430064

血凝素神经氨酸酶(HN)是新城疫病毒(NDV)囊膜表面的糖蛋白之一,其在病毒表面的含量非常丰富,影响NDV的很多生物学特性,如热稳定性等。利用TritonX-100破坏病毒囊膜结构,分离囊膜糖蛋白,最后通过蛋白酶酶切和高速离心的方法获得了较为纯... 详细信息

血凝素神经氨酸酶(HN)是新城疫病毒(NDV)囊膜表面的糖蛋白之一,其在病毒表面的含量非常丰富,影响NDV的很多生物学特性,如热稳定性等。利用TritonX-100破坏病毒囊膜结构,分离囊膜糖蛋白,最后通过蛋白酶酶切和高速离心的方法获得了较为纯净的HN蛋白胞外区的蛋白样品,建立了从NDV粒子上纯化HN蛋白胞外区的方法。利用该方法获得的HN蛋白样品可以保持天然蛋白的结构、化学修饰和功能,能够更好地用于研究HN蛋白结构功能和生物学特性的形成机制,为新城疫病毒的基础研究、新城疫病毒载体改良应用和新城疫疫苗的研发奠定了基础。

关键词：新城疫病毒血凝素神经氨酸酶蛋白纯化

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NDV7793-HN蛋白在SF9细胞中的表达

NDV7793-HN蛋白在SF9细胞中的表达

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作者：张磊广西医科大学

学位级别：硕士

研究背景及目的新城疫病毒(Newcasle disease virus,NDV)属于禽类病毒,能引起禽类大面积的死亡,给家禽业造成严重的经济损失。NDV病毒对人类基本不致病,但能杀死肿瘤细胞,已被用于抗肿瘤的生物治疗上。2006年以来我们课题组利用从江西... 详细信息

研究背景及目的新城疫病毒(Newcasle disease virus,NDV)属于禽类病毒,能引起禽类大面积的死亡,给家禽业造成严重的经济损失。NDV病毒对人类基本不致病,但能杀死肿瘤细胞,已被用于抗肿瘤的生物治疗上。2006年以来我们课题组利用从江西省鄱阳湖野鸭分离得到的1株NDV 7793弱毒株进行NDV抗肿瘤治疗的系列研究,积累了大量NDV抗肿瘤生物治疗基础研究的经验。为了能更深入进行研究,我们拟利用真核表达基因工程系统对NDV的表面蛋白进行表达和纯化。NDV含有多种蛋白,其中的血凝素神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin neuraminidase,HN)是固定在病毒囊膜外表面上的蛋白,具有血凝素和神经氨酸酶的功能,在病毒侵染细胞的过程中,HN起到识别细胞膜表面的唾液酸受体和介导病毒吸附细胞膜的作用。HN不仅是NDV引起禽类致病的主要蛋白,而且在NDV发挥抗肿瘤功能上起至关重要的作用,研究HN蛋白的功能有重要意义。为了获得高品质的HN蛋白进行深入的研究,我们将利用昆虫细胞——草地贪夜蛾卵巢细胞系(SF9)来表达NDV 7793HN蛋白,这是我们实验室第一次利用SF9细胞表达NDV 7793弱毒株的HN蛋白。方法1.提取NDV7793的RNA,逆转录成c DNA,通过PCR将HN基因进行点突变,并将Nco I/Xho I酶切位点引入NDV7793HN基因片段。2.将HN基因片段通过酶切和连接的方法连接到p Fast Bac1 HT B质粒载体,以构建p Fast Bac1 HT B-HN重组质粒,将质粒送测序公司进行测序。3.将测序正确的p Fast Bac1 HT B-HN重组质粒转化到感受态细胞DH10Bac TM中,提取HN杆粒,PCR验证HN杆粒。4.用脂质体转染试剂将HN杆粒转入进昆虫SF9细胞中,培养48小时后收取细胞培养上清,获得第一代病毒,接着用一代病毒感染SF9细胞,培养60小时后收取细胞培养上清,获得二代病毒,最后用二代病毒感染SF9细胞,培养72小时后收集细胞,用SDS-PAGE检测HN蛋白的表达。结果1.从NDV 7793病毒中提取出了病毒的RNA,RNA逆转录成了c DNA,PCR扩增出1710bp带有Nco I/Xho I酶切位点的HN基因片段。2.测序结果表明:p Fast Bac1 HT B-HN质粒构建成功,HN中的Xho I酶切位点被去除。3.从DH10Bac TM细胞其取出HN杆粒,PCR验证HN杆粒构建成功。***-PAGE结果显示在HN杆粒感染的SF9细胞裂解液中比未感染病毒的SF9细胞裂解液在67k Da左右出现了一个明显的条带,这与HN的理论分子量吻合。结论我们成功构建并获得p Fast Bac1 HT B-HN质粒,即HN杆粒,并将该杆粒转染昆虫SF9细胞并得到表达的目的蛋白,初步鉴定为HN蛋白,为今后用基因工程技术获得的HN研究NDV感染宿主细胞(肿瘤细胞)奠定了基础。

关键词：新城疫病毒真核表达昆虫细胞血凝素神经氨酸酶

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人副流感病毒3型HN蛋白十一肽重复序列保守氨基酸突变分析

人副流感病毒3型HN蛋白十一肽重复序列保守氨基酸突变分析

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作者：严冬山东大学

学位级别：硕士

背景:人副流感病毒(human parainfluenza viruses,hPIVs)是属于副粘病毒科的单负链RNA病毒,也是一类常见的社区获得性呼吸道感染病原体。根据遗传学和抗原性的不同,将hPIVs分为4个血清型及2个血清亚型(hPIV-1、2、3、4a、4b),其中人副... 详细信息

背景:人副流感病毒(human parainfluenza viruses,hPIVs)是属于副粘病毒科的单负链RNA病毒,也是一类常见的社区获得性呼吸道感染病原体。根据遗传学和抗原性的不同,将hPIVs分为4个血清型及2个血清亚型(hPIV-1、2、3、4a、4b),其中人副流感病毒 3 型(human parainfluenza virus type 3,hPIV3)感染率高,持续时间长,主要引发六月龄以下婴幼儿下呼吸道感染所致的细支气管炎和肺炎,是仅次于呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的第二大病原体。迄今为止,hPIV3感染尚无有效的防治措施,各类疫苗也正处于研发攻坚阶段,近年来取得了重要进展。然而,针对人体的安全有效的疫苗仍未问世,其主要障碍是对致病机制中病毒与靶细胞的融合机制尚未明确。病毒包膜和靶细胞膜的融合是副粘病毒入侵和感染宿主细胞关键步骤。该过程是在附着蛋白的协助下,由同源性融合蛋白介导而发生的。根据功能的不同,将副粘病毒附着蛋白分为HN、G、H三类,其中HN蛋白功能丰富,存在广泛,受到研究者的普遍关注。HN蛋白以四聚体的形式存在于病毒包膜和宿主细胞膜上,主要功能有:①识别唾液酸受体并吸附于靶细胞膜表面;②发挥神经氨酸酶(neuraminidase,NA)活性,促进子代病毒扩散;③特异性触发同源F蛋白并使其发生一系列构象改变,最终启动膜融合。HN蛋白由头部区、茎部区、跨膜区和胞质尾区四部分组成,其中球状头部区主要负责结合受体和发挥NA活性,已受到深入研究;而茎部区结构及功能目前尚未明确,通常认为其对HN蛋白低聚化和特异性触发同源性F蛋白具有重要作用。近期研究发现,大部分副粘病毒附着蛋白茎部区存在四螺旋束状结构(four-helix bundle,4HB),其疏水性核心由11个重复的氨基酸序列(i,i+3,i+4,i+4)组成,更新了此前定义的七肽重复序列(i,i+3,i+4)模型的概念。同时,通过对比不同副粘病毒附着蛋白的十一肽重复序列可以发现,副粘病毒茎部区疏水性氨基酸核心部分较为保守,对其进行突变可能影响HN蛋白正常的结构和功能,为茎部关键氨基酸的定位提供了新的思路。迄今为止,尚未出现针对hPIV3 HN茎部十一肽重复序列保守氨基酸的突变分析。本研究将hPIV3 HN作为研究对象,通过比对与其结构高度相似的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)HN蛋白及副流感病毒5型/猴副流感病毒(parainfluenza virus type 5,PIV5)HN蛋白茎部十一肽重复区的氨基酸序列,确定了该区域存在的5个保守氨基酸位点,并将其突变为丙氨酸。通过检测突变体蛋白各活性的改变,明确hPIV3 HN茎部十一肽重复序列中起关键作用的氨基酸位点,分析其发生作用的原因,进一步加深对副粘病毒HN蛋白茎部区在融合机制中作用的理解。目的:1.确定hPIV3 HN茎部十一肽重复序列保守氨基酸中起关键作用的位点。2.分析并阐述关键氨基酸改变对HN蛋白结构与功能产生影响的原因。3.进一步理解HN蛋白茎部区在融合机制中的作用。方法:1.突变体的构建:比对hPIV3、NDV、PIV5中HN蛋白的DNA序列,确定hPIV3HN茎部区十一肽重复序列中5个保守氨基酸I102、P111、L114、S119、1125,结合同源重组和定点突变技术,将其分别突变为丙氨酸。2.突变体的表达:利用阳离子转染试剂TurboFectTM Transfection Reagent使待转染突变质粒进入传代乳鼠肾细胞(baby hamster kidney cell,BHK-21)细胞,并通过痘苗病毒-T7瞬时表达系统将其表达。3.促细胞融合活性的分析:同时转染突变体pBSK-HN及野生型pBSK-F质粒到BHK-21细胞,观察合胞体形成情况。利用Giemsa染色定性观察并记录各突变体蛋白合胞体形成情况,利用指示基因法定量测定各突变体蛋白的促细胞融合活性。4.受体识别活性的分析:分别转染突变体pBSK-HN质粒到BHK-21细胞,利用血细胞吸附(hemadsorption,HAD)实验检测各突变体蛋白的受体识别活性。先定性观察并记录光学显微镜下新鲜人红细胞(red blood cell,RBC)吸附情况,再将已吸附的RBC裂解通过比色定量测定各突变体蛋白的受体识别活性。5.神经氨酸酶活性的分析:同时转染突变体pBSK-HN及野生型pBSK-F质粒,观察合胞体形成情况。消化并裂解细胞后高速离心,利用神经氨酸酶检测试剂盒,通过酶促反应检测上清中神经氨酸酶的含量,以此定量测定各突变体蛋白的神经氨酸酶活性。6.半融合活性的分析:同时转染突变体pBSK-HN及野生型pBSK-F质粒,观察合胞体形成

关键词：人副流感病毒3型血凝素神经氨酸酶十一肽重复序列促细胞融合活性

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NDV-HN致人肺腺癌A549细胞凋亡的实验研究

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肿瘤学杂志 2020年第3期26卷 198-203页

作者：田雯钰林宇宁梁莹黄娟娟李瑞樊晓晖广西医科大学基础医学院微生物学教研室广西南宁530021

[目的]探讨NDV-HN诱导人肺腺癌A549细胞凋亡的相关机制。[方法](1)构建包含绿色荧光素蛋白(GFP)及NDV-HN的慢病毒sfGFP-HN载体,用293V细胞包装慢病毒LvsfGFP-HN,用293V细胞进行空载质粒转染组(空载组)慢病毒包装,命名为Lv-sfGFP;(2)以... 详细信息

[目的]探讨NDV-HN诱导人肺腺癌A549细胞凋亡的相关机制。[方法](1)构建包含绿色荧光素蛋白(GFP)及NDV-HN的慢病毒sfGFP-HN载体,用293V细胞包装慢病毒LvsfGFP-HN,用293V细胞进行空载质粒转染组(空载组)慢病毒包装,命名为Lv-sfGFP;(2)以空载组A549-sfGFP细胞和空白组A549为对照,用慢病毒转染方法建立稳定表达NDV-HN蛋白的A549细胞株,即A549-sfGFP-HN细胞株,RT-PCR、Western blot检测A549细胞NDVHN蛋白的表达;(3)分别在A549-sfGFP-HN和A549两组细胞中加入顺铂,流式细胞术检测细胞凋亡;(4)在基因水平和蛋白水平上分别用RT-PCR和Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白Bcl-2的表达。[结果](1)Lv-sfGFP-HN和Lv-sfGFP慢病毒分别转染A549细胞后,只在转染组A549-sfGFP-HN细胞检测到NDV-HN蛋白。(2)转染组A549-sfGFP-HN细胞凋亡率明显高于空白组A549细胞(P<0.01),转染组A549-sfGFP-HN细胞加入顺铂后,其细胞凋亡率明显增加。(3)转染组A549-sfGFP-HN细胞与空载质粒转染组A549细胞和空白组A549细胞相比,凋亡相关蛋白Bcl-2表达量明显下调(P<0.01)。[结论]慢病毒转染NDV-HN到A549细胞后导致A549-sfGFP-HN细胞出现凋亡,且与Bcl-2下调有关。转染NDV-HN的肺癌细胞联合使用抗癌药物顺铂,增加了肺癌细胞凋亡率。

关键词：新城疫病毒 A549细胞血凝素神经氨酸酶 Bcl-2 细胞凋亡

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禽分枝杆菌副结核亚种hsp65与鹅副黏病毒HN融合基因真核表达载体的构建与表达

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中国兽药杂志 2014年第4期48卷 5-10页

作者：么乃全李淑君姜秀云马红霞高云航王春芳胡静涛徐凤宇胡桂学吉林农业大学动物科技学院长春130118 吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室长春130118 吉林农业大学生命科学院长春130118

为探索禽分枝杆菌副结核亚种(MAP)的热休克蛋白65(hsp65)对鹅副黏病毒(GPMV)血凝素神经氨酸酶(HN)的分子佐剂作用及构建GPMV DNA疫苗,针对GPMV的HN基因和MAP的hsp65基因设计引物,PCR克隆扩增两个基因,分别将二者先后与真核表达载体pVAX... 详细信息

为探索禽分枝杆菌副结核亚种(MAP)的热休克蛋白65(hsp65)对鹅副黏病毒(GPMV)血凝素神经氨酸酶(HN)的分子佐剂作用及构建GPMV DNA疫苗,针对GPMV的HN基因和MAP的hsp65基因设计引物,PCR克隆扩增两个基因,分别将二者先后与真核表达载体pVAX1连接,构建了pVAX1-HN、pVAX1-hsp65-HN,并通过PCR、酶切和序列鉴定所获重组质粒;应用脂质体法将其转染至Marc-145细胞,RT-PCR和间接免疫荧光试验证实hsp65和HN在Marc-145细胞中获得了表达。本研究为制备新型GPMV DNA疫苗及探索hsp65在DNA疫苗中的应用奠定了基础。

关键词：鹅副黏病毒血凝素神经氨酸酶禽分枝杆菌副结核亚种热休克蛋白65 构建表达

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