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目的:　　缺血再灌注损伤是肝脏外科手术过程中不可避免的外科棘手问题，很多病人因考虑缺血再灌注损伤而丧失手术机会，随着细胞分子生物学技术的发展，能否通过细胞移植治疗缺血再灌注损伤，使这些原本丧失手术机会的患者再次通过手术来治疗疾病是本次实验主要目的。因此本实验首先通过制造大鼠肝脏缺血再灌注损伤合并大范围肝切除模型，将骨髓间充质干细胞（BoneMarrow-mesenchymalStemCells,BM-MSCs）与骨髓内皮前体细胞（BoneMarrow-derivedEndothelialProgenitorCells,BM-EPCs）分别经门静脉移植入模型肝内，其次观察其对于鼠肝脏缺血再灌注肝损伤修复和肝脏再生中的作用，以及将两种细胞联合移植观察两种细胞是否存在协同作用促进肝脏缺血再灌注肝损伤修复和肝脏再生。　　方法:　　1.通过细胞贴壁法从骨髓液中获得BM-MSCs和BM-EPCs。通过BM-MSCs的成骨、成脂、成软骨分化实验对其多分化功能进行功能鉴定;通过BM-EPCs成管实验对其进行功能鉴定。最后利用慢病毒携带绿色荧光蛋白（GFP）及红色荧光蛋白（RFP）分别对BM-MSCs及BM-EPCs进行细胞标记，为下一步将细胞移植入动物体内观察细胞的分布情况做准备。　　2.制作SD大鼠70%肝缺血再灌注损伤合并大范围肝切除手术模型，将SD大鼠随机分为四组（单独注射BM-MSCs、单独BM-EPCs、联合注射BM-MSCs+BM-EPCs组、单独注射PBS空白对照组），按不同分组进行细胞移植，分别经大鼠门静脉注射GFP标记的BM-MSCs/200μL、RFP标记的BM-EPCs/200μL、BM-MSCs+BM-EPCs（BM-MSCs∶BM-EPCs=1∶1）/200μL、对照组注射PBS/200μL。以上四组分别在不同的时间段（1天，3天，5天，7天）取外周血检测肝功能恢复指标，使用称重法测肝再生率，肝脏组织做冰冻切片后利用免疫荧光方法动态观察BM-MSCs和BM-EPCs在肝脏内的分布，各组取第3天的肝组织使用EDU法检测肝内细胞增殖反应，Tunnel法检测肝内细胞凋亡，肝脏组织的常规病理切片观察肝脏病理损害及恢复的程度，最后利用qRT-PCR技术检测炎症因子（TNF-ɑ）、促炎因子（IL6）、生长因子（HGF）、趋化因子（IP-10）表达变化。　　结果:　　1.成功从大鼠骨髓腔分离了BM-MSCs和BM-EPCs，完成了BM-MSCs的多分化功能鉴定，完成了BM-EPCs血管形成实验（Tubeformation）的鉴定。使用慢病毒携带荧光蛋白GFP、RFP成功标记了BM-MSCs和BM-EPCs。构建了SD大鼠肝脏70%肝缺血再灌注损伤合并大部分切除模型并完成细胞移植。　　2.通过肝功能AST、ALT检测BM-MSCs组、BM-EPCs组及BM-MSCs+BM-EPCs混合组在再灌注后1天、3天、5天、7天大鼠血清ALT、AST表达水平与对照组比较均明显降低（P＜0.05），BM-MSCs组和BM-EPCs组比BM-MSCs+BM-EPCs混合组血清AST、ALT表达水平更低（P＜0.05），BM-MSCs组ALT及AST水平则也低于BM-EPCs组（P＜0.05），故肝脏功能恢复情况BM-MSCs组优于BM-EPCs组，BM-EPCs组优于BM-MSCs+BM-EPCs混合组，BM-MSCs+BM-EPCs混合组优于空白组。称重法测定BM-MSCs组、BM-EPCs组及BM-MSCs+BM-EPCs混合组在再灌注5天后再生率明显高于对照组（P＜0.05），但BM-MSCs组与BM-EPCs组比BM-MSCs+BM-EPCs混合组再生率升高（P＜0.05），故肝脏再生率情况BM-MSCs组、BM-EPCs组、BM-MSCs+BM-EPCs组均优于空白组，BM-MSCs组与BM-EPCs组优于BM-MSCs+BM-EPCs混合组。通过免疫荧光方法观察BM-MSCs及BM-EPCs可以特异分布至肝脏损伤部位促进肝脏组织修复再生。通过EDU法及Tunnel法检测肝内细胞增殖与凋亡得出BM-MSCs、BM-EPCs及BM-MSCs+BM-EPCs混合组均能通过降低肝内细胞的凋亡促进肝内细胞的增殖来保护肝脏功能促进再生，但BM-MSCs组肝内细胞增殖最优，肝内凋亡细胞数量也最少。通过HE染色观察BM-MSCs组、BM-EPCs组及混合组与对照组比较在再灌注后充血、空泡化及局部坏死程度明显减轻（P＜0.05），但BM-MSCs组及BM-EPCs组肝损伤程度也低于BM-MSCs+BM-EPCs混合组（P＜0.05）。PCR结果提示BM-MSCs组、BM-EPCs组及BM-MSCs+BM-EPCs混合组生长因子（HGF）、促炎因子（IL

关键词：间充质干细胞血管内皮前体细胞肝切除细胞移植肝再生

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空气细颗粒物中Ni对血管内皮细胞作用的研究

空气细颗粒物中Ni对血管内皮细胞作用的研究

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作者：张利英兰州大学

学位级别：硕士

目的：1.分析比较镍污染区和对照区主要污染物、空气细颗粒物(PM2.5)浓度及PM2.5中Ni和V的含量是否有差异；2.观察空气细颗粒物中Ni在体内和体外对血管内皮细胞数目和功能的影响,从而探讨空气细颗粒物中Ni致心血管疾病的可能机制。方法... 详细信息

目的：1.分析比较镍污染区和对照区主要污染物、空气细颗粒物(PM2.5)浓度及PM2.5中Ni和V的含量是否有差异；2.观察空气细颗粒物中Ni在体内和体外对血管内皮细胞数目和功能的影响,从而探讨空气细颗粒物中Ni致心血管疾病的可能机制。方法：1.选择镍污染区和对照区,用智能中流量采样器于2009年12月和2010年6-7月两次在两个区采集并分析空气中PM2.5浓度及PM2.5中Ni和V两种元素的含量；2.将采集的PM2.5制备成不同浓度的混悬液(0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml. 100μg/ml),对ECV-304细胞染毒,MTT法测定细胞存活率,Transwell迁移小室测定细胞迁移率,同时测定细胞上清液中LDH的活力；3.从镍污染区和对照区配对选取20名研究对象,收集外周血后用流式细胞仪测定全血中CD34+/KDR+、CD34+/KDR+/CD133+和CD34+/KDR+/CD45三个细胞群数目,以检测外周血中血管内皮前体细胞数目；Transwell迁移小室测定血管内皮前体细胞迁移率及细胞集落形成,以检测血管内皮前体细胞功能。结果：1.大气细颗粒物监测结果：①镍污染区和对照区主要污染物PM10、PM2SO2和NO2浓度无统计学意义(P>0.05)；②镍污染区PM2.5中Ni浓度显著高于对照区,为对照区的69倍(P<0.001)；两区V浓度无统计学差异(P>0.05)。2.空气PM2.中Ni的细胞毒理学研究结果：①用镍污染区和对照区PM2.5染毒的ECV-304细胞存活率均随着染毒浓度上升而下降(P<0.05)；在同一染毒时间和染毒剂量下,镍污染区PM2.5染毒的ECV-304细胞存活率低于对照区(P<0.05)；②镍污染区和对照区PM2.5染毒的ECV-304细胞上清中LDH活力均随染毒浓度增大而逐渐上升(P<0.05)；同一染毒时间和染毒剂量,镍污染区PM2.5染毒的ECV-304细胞上清中LDH活力均高于对照区(P均<0.01)。③随着染毒浓度的上升,镍污染区和对照区PM2.5染毒的ECV-304细胞迁移数目逐渐减少,迁移率逐渐下降(P<0.05)；同一染毒时间和染毒剂量,镍污染区PM2.5染毒的ECV-304细胞迁移数低于对照区(P<0.05)。3、人群流行病学研究结果：镍污染区研究对象外周血循环内皮前体细胞数显著低于对照区(P<0.05),细胞迁移数显著低于对照区为(P<0.01)集落形成单位数显著低于对照区(P<0.05)。结论：1.监测期间镍污染区和对照区PM2.5浓度相近,镍污染区中Ni浓度是对照区的69倍；2.镍污染区PM2.5(Ni)可导致血管内皮细胞存活率减少、细胞功能减弱；3.镍污染区居民血管内皮前体细胞的数目减少、功能降低。提示PM2.5中镍可能是损伤血管内皮前体细胞、导致心血管疾病发生的主要成分。

关键词：细颗粒物(PM2.5) 镍血管内皮细胞血管内皮前体细胞

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Periostin蛋白过表达对小鼠损伤颈动脉再内皮化的影响

Periostin蛋白过表达对小鼠损伤颈动脉再内皮化的影响

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作者：蔡瑶蚌埠医学院

学位级别：硕士

目的:血管腔内治疗技术以其微创的独特优势成为目前治疗动脉闭塞性疾病的主要治疗方式之一,然而腔内介入治疗术后血管再狭窄是一直不可回避的问题。本课题组拟采用核转染细胞过表达Periostin蛋白和体内细胞移植干预的方式对颈动脉损伤... 详细信息

目的:血管腔内治疗技术以其微创的独特优势成为目前治疗动脉闭塞性疾病的主要治疗方式之一,然而腔内介入治疗术后血管再狭窄是一直不可回避的问题。本课题组拟采用核转染细胞过表达Periostin蛋白和体内细胞移植干预的方式对颈动脉损伤模型小鼠进行治疗并检测评估其效果,致力于寻找更好的腔内介入治疗术后血管再狭窄的治疗方案。方法:特制高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠四个月,在饲养前后对小鼠进行称重和检测血脂水平,处死部分小鼠并进行颈总动脉和肝脏HE染色,观察组织结构的变化。外购稳定过表达Periostin蛋白内皮前体细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)细胞株并进行培养。将过表达Periostin蛋白的EPCs、沉默表达Periostin蛋白的EPCs、正常的EPCs分别经尾静脉注射进小鼠体内。治疗四个月后,通过Evans blue染色检测损伤颈动脉再内皮化情况;HE和红油O染色检测损伤动脉新生内膜增生情况并比较斑块面积大小;免疫组织化学染色法测定细胞核抗原Ki67和PCNA表达,间接检测细胞增殖程度。结果:高脂饮食组小鼠体重增加;血脂水平明显升高;病理染色提示颈总动脉内膜破坏增厚,大量斑块形成;肝脏结构紊乱,大部分肝细胞肿胀、气球样变,内有空泡形成。以上结果提示ApoE-/-小鼠颈动脉损伤模型建立成功。观察细胞的形态呈铺路石样;免疫组化鉴定细胞CD34表达为阳性;Western-blot实验检测Periostin蛋白在EPCs的稳定表达,可以用于后期颈动脉损伤模型小鼠的体内移植治疗。各病理染色结果表明过表达Periostin蛋白能够促进EPCs在小鼠体内增殖和损伤颈动脉再内皮化,效果明显。结论:本课题通过高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠,能够成功建立颈动脉损伤模型小鼠。通过基因转染的方法构建过表达Periostin蛋白的EPCs,并进行体内移植治疗,研究结果表明过表达Periostin蛋白的EPCs能促进小鼠损伤颈动脉再内皮化,效果优于沉默表达Periostin蛋白的EPCs和单纯EPCs。

关键词： Periostin蛋白血管内皮前体细胞颈动脉粥样硬化细胞治疗

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高糖对人血管内皮祖细胞增殖的影响及其机制的初步研究

高糖对人血管内皮祖细胞增殖的影响及其机制的初步研究

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作者：郑奇南京医科大学

学位级别：硕士

糖尿病是临床常见的代谢性疾病,而血管病变则是其慢性并发症的主要表现,为糖尿病患者预后和生活质量的重要影响因素。多项研究表明,存在缺血性血管形成受损的糖尿病患者伴有视网膜的血管新生,即糖尿病视网膜病变(DR)。DR中的新生血管由... 详细信息

糖尿病是临床常见的代谢性疾病,而血管病变则是其慢性并发症的主要表现,为糖尿病患者预后和生活质量的重要影响因素。多项研究表明,存在缺血性血管形成受损的糖尿病患者伴有视网膜的血管新生,即糖尿病视网膜病变(DR)。DR中的新生血管由于其功能不完善,从而引起玻璃体反复出血、纤维增生、视网膜脱离,最终发展为视力丧失。近年的研究发现,DR的新生血管与体内的某种干细胞密切相关,即内皮前体细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),又称为内皮祖细胞,是近年发现的能自我更新、增殖分化为内皮细胞的多能干细胞,与血管新生关系密切。大量的证据表明EPCs在血管形成中起重要作用,尤其在缺血条件下,Grant等研究发现骨髓来源的EPCs在成人视网膜血管新生的模型中起重要作用。有实验表明,NO也与糖尿病关系密切,糖尿病外周血中EPCs细胞数量减少可能与NO的减少有关,然而在DR中NO和EPCs与新生血管间的作用尚未见报道。本实验观察高浓度葡萄糖体外培养EPCs,旨在了解高糖与EPC增殖的关系及NO在其中的作用机制。我们从脐血成功分离出单核细胞,体外应用EPCs专用培养基EGM-2MV培养,倒置显微镜下观察细胞生长形态,免疫荧光染色鉴定细胞表面标志CD133、KDR、vWF的表达。体外培养的P2代细胞随机分为4组,即正常对照组:用EGM-2MV培养液培养;高糖组:葡萄糖终浓度为33mmol/L的EGM-2MV培养液;高糖+L-NAME组:含葡萄糖浓度为33mmol/L的EGM-2MV培养液中加入内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide synthase,eNOS)抑制剂L-NAME10μmol/L;甘露醇组(渗透压对照组):含甘露醇的终浓度为33mmol/L的EGM-2MV培养液。四组细胞各培养48小时,采用倒置显微镜观察细胞生长形态,用CCK-8试剂分析细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,采用免疫荧光染色研究3-硝基酪氨酸(3-NT)蛋白表达的变化。结果表明:通过细胞形态学及表型鉴定,本实验培养的细胞均表达CD133、KDR抗体,vWF抗体表达阴性,可以认为这些贴壁细胞大部分都是EPCs;同时免疫荧光证明各实验组EPCs都表达同样的细胞表面标志,高糖的培养环境并未引起细胞分化。与正常对照组相比,应用含33mmol/L葡萄糖的EGM-2MV培养基处理EPCs48h后,高糖可以促进EPCs增殖,加入eNOS特异性抑制剂L-NAME处理后,其促进作用减弱;细胞周期分析显示高糖培养的EPCs大多处于增殖S期;高糖组EPCs的3-NT蛋白表达明显增加,加入L-NAME处理后,3-NT蛋白表达量较高糖组减少。通过以上研究,我们得出下列结论:(1)通过密度梯度法可成功从人脐血分离出血管内皮前体细胞。(2)高浓度葡萄糖培养EPCs可明显促进细胞增殖,但却不影响细胞分化。(3)高糖可使EPC表达3-NT蛋白增多,加入L-NAME后可明显逆转高糖对细胞的增殖作用。由此可见,高糖对EPCs的作用机制可能是通过引起细胞释放NO,从而促进细胞增殖;高糖不影响EPCs分化,即不影响血管形成作用,而只是促进了血管生成,从而生成糖尿病视网膜病变中的新生血管网。通过探究EPCs细胞增殖、分化的机制,研究血管发生和血管形成,可能为糖尿病视网膜血管病变的治疗提供新的方向。

关键词：血管内皮前体细胞高糖 NO 新生血管

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骨髓间充质干细胞双向诱导分化构建血管化组织工程骨的实验研究

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中国美容医学 2017年第4期26卷 61-66页

作者：张蓉高瞻高伟新疆军区总医院颌面外科新疆乌鲁木齐830000

目的:探讨利用骨髓间充质干细胞(marrow stromal cells,MSCs)的成骨和成血管化特性双向诱导分化,构建血管化组织工程骨的新策略。方法:将体外培养扩增的MSCs,用含成骨诱导剂的培养液连续培养2周,形成成骨性细胞膜片。同时将另一部分MSC... 详细信息

目的:探讨利用骨髓间充质干细胞(marrow stromal cells,MSCs)的成骨和成血管化特性双向诱导分化,构建血管化组织工程骨的新策略。方法:将体外培养扩增的MSCs,用含成骨诱导剂的培养液连续培养2周,形成成骨性细胞膜片。同时将另一部分MSCs向成血管化分化,获得血管内皮前体细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),并将EPCs悬液接种于膜片,形成膜片-EPCs复合体。然后将膜片-EPCs复合体植入裸鼠体内,同时单纯植入MSCs膜片作为对照组。术后4周和8周取材,通过Micro-CT、组织学和扫描电镜检查,分析其成骨性能。结果:体外构建的细胞膜片为细胞-细胞外基质聚合体,细胞外基质中沉积有钙化结节。培养获得的EPCs能够形成管腔状结构,CD31染色表达阳性;膜片-EPCs复合体植入裸鼠体内4周和8周后,形成密布血管网的组织工程骨,成骨面积和血管密度均明显高于对照组。结论:掺入血管内皮前体细胞不仅有利于产生丰富血管网,而且能够促进新骨形成。

关键词：骨组织工程细胞膜片技术血管化间充质干细胞血管内皮前体细胞

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肿瘤患者循环血管内皮干/祖细胞的检测及体外诱导分化

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实用癌症杂志 2003年第4期18卷 340-343页

作者：李慧任秀宝张澎安秀梅郝希山天津医科大学附属肿瘤医院免疫室 300060

目的　证实外周血中循环血管内皮细胞 (CECs)及血管内皮前体细胞 (CEPs)的存在 ,检测内皮前体细胞的增殖分化能力。方法　应用流式细胞术检测 5 7例肿瘤患者及 15例正常人外周血中的CECs和CEPs ,应用ELISA方法检测血清VEGF水平。选择经... 详细信息

目的　证实外周血中循环血管内皮细胞 (CECs)及血管内皮前体细胞 (CEPs)的存在 ,检测内皮前体细胞的增殖分化能力。方法　应用流式细胞术检测 5 7例肿瘤患者及 15例正常人外周血中的CECs和CEPs ,应用ELISA方法检测血清VEGF水平。选择经造血干细胞动员的肿瘤患者 ,分离单个核细胞 (MNCs) ,在VEGF、IGF及bFGF条件下培养血管内皮细胞 ,并应用透射电镜法对培养细胞进行鉴定。结果　肿瘤患者外周血中CECs、CEPs含量分别为 0 .3 78%± 0 .0 47%、0 .0 5 9%± 0 .0 13 % ,高于正常对照组 ,且与血清VEGF水平相关。透射电镜下培养细胞可见Weibel-Palade小体 ,为血管内皮细胞的特异性标志。结论　外周血中存在CECs和CEPs ,在肿瘤患者体内存在血管内皮及其前体细胞的动员 ,循环血管内皮干

关键词：肿瘤循环血管内皮细胞血管内皮前体细胞单个核细胞血管内皮生长因子胰岛素样生长因子成纤维生长因子

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肿瘤血管生成拟态的研究进展

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实用肿瘤学杂志 2007年第3期21卷 276-278页

作者：牛多山葛霞安徽省蚌埠医学院病理教研室蚌埠233004

肿瘤需要机体血液供应来满足生长的需要和进行播散。经典的血管生成理论认为：当实体肿瘤直径大于2mm时,需要诱导生成新的血管来获取血供,新的血管生成包括血管再生和血管形成两种方式，前者通过激活瘤体周围的宿主血管内皮细胞增生、... 详细信息

肿瘤需要机体血液供应来满足生长的需要和进行播散。经典的血管生成理论认为：当实体肿瘤直径大于2mm时,需要诱导生成新的血管来获取血供,新的血管生成包括血管再生和血管形成两种方式，前者通过激活瘤体周围的宿主血管内皮细胞增生、迁移、芽生、向瘤组织内生长形成血管网；后者则是通过动员骨髓中血管内皮前体细胞，

关键词：血管生成拟态肿瘤直径血管内皮细胞增生血管内皮前体细胞血管生成理论血液供应血管形成血管再生

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高糖对人血管内皮祖细胞增殖的影响及其机制的初步研究

高糖对人血管内皮祖细胞增殖的影响及其机制的初步研究

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第一届中国眼科学基础研究大会暨研究生导师论坛

作者：郑奇袁志兰戈应斌江苏省人民医院眼科江苏省南京医科大学生理教研室

目的：初步研究高糖与人血管内皮祖细胞(EPC)增殖的关系及NO在其中的作用机制.方法：从脐血中成功分离出单核细胞,体外应用EPCs专用培养基EGM-2MV培养,倒置显微镜下观察细胞生长形态,免疫荧光染色鉴定细胞表面标志的表达.P2代细胞随机分... 详细信息

目的：初步研究高糖与人血管内皮祖细胞(EPC)增殖的关系及NO在其中的作用机制.方法：从脐血中成功分离出单核细胞,体外应用EPCs专用培养基EGM-2MV培养,倒置显微镜下观察细胞生长形态,免疫荧光染色鉴定细胞表面标志的表达.P2代细胞随机分为4组,即正常对照组;高糖组;高糖+L-NAME组;甘露醇组(渗透压对照组).各培养48小时,观察细胞生长形态,CCK-8分析细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,免疫荧光染色研究蛋白表达的变化.

关键词：血管内皮前体细胞高糖 NO 新生血管

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