检索结果-内蒙古大学图书馆

中国病理生理杂志 2025年第3期41卷 524-533页

作者：程思远白云苹程俞梦万冉邢小香赵鹏李建生河南中医药大学呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心河南省中医药防治呼吸病重点实验室河南郑州450046 河南中医药大学中医药科学院河南郑州450046 河南中医药大学第一附属医院河南郑州450000

目的:探讨清肺解毒化痰方(Qingfei-Jiedu-Huatan formula,QJHF)对肺炎克雷伯杆菌诱导的重症肺炎小鼠肺血管内皮屏障损伤的作用及其机制。方法:将51只C57BL/6J小鼠随机分为对照组(n=6)、模型组(n=15)、QJHF组(n=15)和头孢曲松钠(ceftriax... 详细信息

目的:探讨清肺解毒化痰方(Qingfei-Jiedu-Huatan formula,QJHF)对肺炎克雷伯杆菌诱导的重症肺炎小鼠肺血管内皮屏障损伤的作用及其机制。方法:将51只C57BL/6J小鼠随机分为对照组(n=6)、模型组(n=15)、QJHF组(n=15)和头孢曲松钠(ceftriaxone sodium,CRO)组(n=15)。第0天一次性气管插管注入50μL浓度为1×10^(11)CFU/mL肺炎克雷伯杆菌制备重症肺炎小鼠模型。造模6 h后,QJHF组和CRO组分别给予相应药物治疗,其余组给予等体积生理盐水,第3天灌胃结束后处死小鼠。苏木素-伊红染色法观察肺组织病理改变;ELISA检测肺组织匀浆中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-6水平;流式细胞术检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中CD11b+Ly6g+细胞数;蛋白质组学及网络药理学分析药物作用机制;Western blot检测肺组织血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)、闭锁小带蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)、闭合蛋白(occludin)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、P38丝裂原活化蛋白激酶和磷酸化P38(phosphorylated P38,p-P38)蛋白水平。结果:QJHF可显著改善重症肺炎模型小鼠的精神状态,缓解呼吸促动等症状,降低死亡率,减轻肺组织病变,降低肺组织IL-6、TNF-α和IL-1β水平,减少BALF总蛋白、总细胞数和中性粒细胞含量,增加肺组织VE-cadherin、ZO-1和occludin蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。蛋白质组学显示QJHF可逆转重症肺炎小鼠肺组织中129个蛋白的表达;网络药理学显示QJHF的14种主要入血成分的328个潜在靶点与1665个重症肺炎疾病基因共有125个交集基因。将逆转蛋白与交集基因构建蛋白质相互作用网络,GO富集分析和KEGG通路富集分析显示,QJHF主要调控PI3K-Akt、MAPK和Rap1信号通路及VEGFR等。Western blot结果显示,QJHF可显著抑制肺组织中VEGF和P38表达(P<0.05或P<0.01)。结论:QJHF减轻重症肺炎模型小鼠肺病理损伤,机制可能与抑制VEGF/P38信号通路、保护小鼠血管内皮屏障有关。

关键词：清肺解毒化痰方重症肺炎血管内皮屏障 VEGF/P38信号通路

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高迁移率族蛋白B1介导血管内皮屏障功能障碍及对白细胞-内皮细胞黏附的调节作用

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中华病理学杂志 2017年第1期46卷 64-67页

作者：吴蕾栾正刚中国医科大学附属第一医院重症医学科沈阳110001

高迁移率族蛋白B1（ high-mobility group box-1 protein， HMGB1）是一种非组蛋白染色质结合蛋白，存在于几乎所有细胞的细胞核和细胞质中。近期研究表明，HMGB1可被分泌到细胞外，作为一种炎性细胞因子参与组织损伤的病理生理过程及... 详细信息

高迁移率族蛋白B1（ high-mobility group box-1 protein， HMGB1）是一种非组蛋白染色质结合蛋白，存在于几乎所有细胞的细胞核和细胞质中。近期研究表明，HMGB1可被分泌到细胞外，作为一种炎性细胞因子参与组织损伤的病理生理过程及参与免疫应答反应。大量研究表明HMGB1在介导血管内皮屏障功能障碍和调节黏附分子表达中起重要作用。 HMGB1通过跨细胞途径促进白细胞黏附和迁移，调节黏附分子的表达和磷酸化并改变紧密连接蛋白的分布和表达，最终可导致血管内皮屏障（如血-脑屏障、血-视网膜屏障）功能的破坏。我们就HMGB1介导血管内皮屏障功能障碍和HMGB1与细胞表面受体间相互作用及介导细胞内信号转导通路作一综述。

关键词：高迁移率族蛋白B1 血管内皮屏障内皮细胞黏附白细胞黏附功能障碍介导调节 HMGB1

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抑制多药耐药相关蛋白4对脓毒症大鼠肺血管内皮屏障功能的保护作用

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中华急诊医学杂志 2015年第8期24卷 830-833页

作者：夏文芳苏镔邹捍东周青山武汉大学人民医院重症医学科武汉430060

目的探讨抑制多药耐药相关蛋白4（MRP4）对脓毒症大鼠肺血管内皮屏障功能的影响。方法60只SpragueDawley大鼠随机（随机数字法）分为假手术组、脓毒症组和MRP4抑制剂干预组，每组20只动物。脓毒症模型采用盲肠结扎穿孔法。MRP4抑制剂干... 详细信息

目的探讨抑制多药耐药相关蛋白4（MRP4）对脓毒症大鼠肺血管内皮屏障功能的影响。方法60只SpragueDawley大鼠随机（随机数字法）分为假手术组、脓毒症组和MRP4抑制剂干预组，每组20只动物。脓毒症模型采用盲肠结扎穿孔法。MRP4抑制剂干预组于脓毒症模型建立前30min腹腔注射MRP4抑制剂MK571（20mg／kg）。术后24h，采用ELISA法检测血清促炎细胞因子白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，取肺组织做病理学检查，用伊文思蓝法测定肺组织渗透性。结果与假手术组大鼠相比，脓毒症组大鼠血清IL-6和TNF-α水平显著升高，肺组织损伤明显，肺组织渗透性增强。与脓毒症大鼠组比较，MRP4抑制剂干预组大鼠血清IL-6和TNF-α水平明显降低，肺组织病理损伤减轻，肺组织渗透性减弱。结论抑制MRP4可显著改善脓毒症大鼠肺血管内皮屏障功能障碍。

关键词：脓毒症血管内皮屏障多药耐药相关蛋白4

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水泡性口炎病毒对体外血管内皮屏障功能的损伤作用及其机制

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吉林大学学报（医学版） 2024年第5期50卷 1275-1285页

作者：曹宇璇陈为孙成彪赵娜王燕董明鑫许娜刘文森李咏梅北华大学基础医学院病原生物学教研室吉林吉林132013 中国农业科学院长春兽医研究所动物性食品安全与生物交叉研究室吉林长春130122 河南科技大学应用工程学院食品医药教研组河南三门峡472099 吉林医药学院教务处吉林吉林132013

目的:探讨水泡性口炎病毒(VSV)对血管内皮(VE)屏障的损伤作用,并阐明其作用机制。方法:采用犬肾细胞对VSV进行扩增,采用小鼠脑血管内皮瘤bEnd. 3细胞检测VSV的半数组织培养感染剂量(TCID_(50)),采用300倍TCID_(50)进行后续实验。将bEnd... 详细信息

目的:探讨水泡性口炎病毒(VSV)对血管内皮(VE)屏障的损伤作用,并阐明其作用机制。方法:采用犬肾细胞对VSV进行扩增,采用小鼠脑血管内皮瘤bEnd. 3细胞检测VSV的半数组织培养感染剂量(TCID_(50)),采用300倍TCID_(50)进行后续实验。将bEnd. 3细胞分为感染0 h组、感染4 h组、感染8 h组和感染12 h组,进行VSV感染损伤VE屏障实验;将bEnd. 3细胞分为对照组、感染组和纠正组,进行抑制VSV复制与VE屏障恢复实验。将bEnd. 3细胞接种于Transwell小室,构建体外VE屏障模型,采用细胞电压电阻仪检测感染VSV不同时间后各组bEnd. 3细胞中跨上皮电阻(TER),采用异硫氰酸荧光素-葡聚糖渗漏实验检测各组渗透系数,采用免疫荧光染色法观察VSV感染后各组bEnd. 3细胞骨架及黏附连接(AJs)中VE-钙黏蛋白、β-连环蛋白(β-catenin)和磷酸化β-连环蛋白(p-β-catenin)定位变化,采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组细胞中Wnt和β-catenin mRNA表达水平,采用Western blotting法检测各组细胞中Wnt、β-catenin和p-β-catenin表达水平。结果:VSV的TCID_(50)为10^(-4.5)·100μL^(-1)。Transwell小室实验检测,与感染0 h比较,其他各组细胞中TER明显降低(P<0.05),渗透系数明显升高(P<0.05)。免疫荧光染色,与对照组比较,感染组bEnd. 3细胞骨架紊乱,细胞间隙增大,AJs线性指数明显降低(P<0.05),β-catenin和p-β-catenin从细胞膜转移至细胞核周围。RT-qPCR法检测,与感染0 h比较,其他各组细胞中Wnt mRNA表达水平明显降低(P<0.05),β-catenin mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。Western blotting法检测,与感染0 h比较,其他各组细胞中Wnt蛋白表达水平明显降低(P<0.05),β-catenin表达水平差异无统计学意义(P>0.05),p-β-catenin表达水平明显升高(P<0.05)。在抑制VSV复制并纠正低密度脂蛋白受体(LDLR)异常后,Transwell小室实验检测,与感染组比较,纠正组bEnd. 3细胞中TER明显升高(P<0.05),渗透系数明显降低(P<0.05)。免疫荧光染色,与感染组比较,纠正组细胞间隙减小,细胞中β-catenin和p-β-catenin核周聚集现象有所改善。RT-qPCR法检测,与感染组比较,纠正组细胞中Wnt mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。Western blotting法检测,与感染组比较,纠正组细胞中Wnt蛋白表达水平明显升高(P<0.05),β-catenin表达水平差异无统计学意义(P>0.05),p-β-catenin表达水平明显降低(P<0.05)。结论:VSV感染后可引起LDLR失活,降低Wnt蛋白表达水平,造成β-catenin磷酸化水平升高并发生内化,破坏AJs稳定性,最终导致VE屏障损伤。

关键词：水泡性口炎病毒血管内皮屏障黏附连接低密度脂蛋白受体 Wnt/β-连环蛋白信号通路

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右美托咪定对脓毒症大鼠血管内皮屏障功能的保护作用

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第三军医大学学报 2020年第4期42卷 334-341页

作者：佘汉房贺李涛刘良明胡弋陆军军医大学(第三军医大学)大坪医院麻醉科重庆400042 陆军军医大学(第三军医大学)大坪医院:野战外科研究所战伤休克与输血研究室创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400042

目的探讨右美托咪定对脓毒症大鼠血管内皮屏障功能的保护作用。方法采用盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)诱导大鼠脓毒症模型,将SD大鼠分成4组:假手术(Sham)组、脓毒症(sepsis,Sep)组、常规治疗(conventional treatment,... 详细信息

目的探讨右美托咪定对脓毒症大鼠血管内皮屏障功能的保护作用。方法采用盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)诱导大鼠脓毒症模型,将SD大鼠分成4组:假手术(Sham)组、脓毒症(sepsis,Sep)组、常规治疗(conventional treatment,CT)组、右美托咪定(Dex)组,观察肠系膜微血管静脉通透性、肺血管通透性的变化及存活率、存活时间的变化;离体取原代肺静脉内皮细胞,观察右美托咪定对内毒素刺激血管内皮细胞后的闭锁小带蛋白1(zonula occludes-1,ZO-1)表达和细胞跨膜电阻(transmembrane electrical resistance,TER)的影响。结果与假手术组比较,脓毒症后大鼠肠系膜微血管和肺血管的通透性明显增加,存活率与存活时间明显降低(P<0.01);常规治疗能够轻微降低脓毒症大鼠的血管通透性;右美托咪定可显著降低脓毒症大鼠肠系膜微血管和肺血管通透性(P<0.01),提高脓毒症大鼠的存活率与存活时间(P<0.05)。LPS孵育可导致肺静脉内皮细胞间连接断裂、消失,ZO-1表达明显降低,TER明显降低(P<0.01)。结论右美托咪定可明显改善脓毒症大鼠的血管内皮屏障功能,并进一步发挥对脓毒症大鼠的保护作用。

关键词：右美托咪定脓毒症血管内皮屏障闭锁小带蛋白1 肺静脉内皮细胞大鼠

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PARs受体家族与血管内皮屏障功能调节

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第三军医大学学报 2004年第22期26卷 2077-2078页

作者：王震陶国才第三军医大学西南医院麻醉科重庆400038

凝血酶是由肝脏合成,主要以酶原形式存在于血液中的一类丝氨酸蛋白酶,能够激活血小板、促进凝血,早期的研究主要侧重于凝血酶和血栓性疾病关系.随着凝血酶受体(PAR1)及PARs受体家族的发现和克隆,研究重点也转为凝血酶及PARs受体家族的... 详细信息

凝血酶是由肝脏合成,主要以酶原形式存在于血液中的一类丝氨酸蛋白酶,能够激活血小板、促进凝血,早期的研究主要侧重于凝血酶和血栓性疾病关系.随着凝血酶受体(PAR1)及PARs受体家族的发现和克隆,研究重点也转为凝血酶及PARs受体家族的功能研究,这已大大超出了凝血/纤溶的范畴.

关键词：蛋白酶激活受体血管内皮屏障凝血酶

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低切应力对血管内皮屏障功能的调控及SL提取物的干预机制

低切应力对血管内皮屏障功能的调控及SL提取物的干预机制

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作者：周淑媛中国中医科学院

学位级别：博士

研究背景及目的随着社会的发展,心血管类疾病已成为威胁人类生命健康和生活质量的头号疾病。心血管疾病共同的病理基础是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)。对动脉粥样硬化发病机制的研究一直是医药学界研究的重点和热点,到目前为止,... 详细信息

研究背景及目的随着社会的发展,心血管类疾病已成为威胁人类生命健康和生活质量的头号疾病。心血管疾病共同的病理基础是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)。对动脉粥样硬化发病机制的研究一直是医药学界研究的重点和热点,到目前为止,对于As的发病机制尚未明确,但As发生的始动因素得到了国内外研究学者的普遍共识,即血管内皮损伤。血管内皮损伤直接导致内皮屏障功能障碍,血管内皮通透性增高,致病因子侵入内皮,诱导As发生和发展。在导致血管内皮屏障功能障碍的因素中,血流切应力具有至关重要的作用。血流切应力已被证明在As斑块发生的局灶性中具有重要作用。在低切应力(<4dyn·cm-2)血流作用下的动脉血管更易于形成斑块,而高切应力(>15dyn·cm-2)对血管具有保护的作用。血管内皮细胞直接感受血流切应力的变化,低切应力作用可以引起细胞骨架重构,导致血管内皮屏障功能的损害,使血液中的脂质等物质更易通过内皮细胞,促进As的形成。 F-actin(微丝肌动蛋白)是调节细胞骨架重构的主要收缩蛋白。F-actin重排依赖于肌球蛋白轻链(Myosin Light Chain, MLC)的磷酸化。肌球蛋白轻链激酶(Myosin Light Chain Kinase, MLCK)和ROCK/ROK/Rho激酶(Rho Kinase, ROCK)是调节MLC磷酸化的两种重要激酶。研究证实,血流切应力对成骨细胞的收缩具有Ca2+依赖性(MLCK通路)和非Ca2+依赖性(ROCK通路)两种途径。那么血流切应力对脐动脉内皮细胞骨架重排的作用是否也具有Ca2+依赖性和非Ca2+依赖性还需要研究证实。参莲提取物(SL extract)是在中医临床经验的基础上,结合现代医学较为公认的As病理机制的“损伤—反应学说”和现代药理学研究成果所精选出的防治As有效组方的提取物。本实验室的前期研究结果证实,SL提取物能改善血管内皮功能,对As有很好的防治作用,但其改善内皮功能是否通过抑制内皮细胞骨架的改变或重组而起作用未见相关报道。因此,本课题以研究参莲提取物抑制细胞骨架重构为目的,从诱导细胞骨架重构的关键蛋白——肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化为切入点,重点研究SL提取物对介导MLC磷酸化的两条关键通路：肌球蛋白轻链激酶(MLCK)通路和ROCK激酶信号通路的干预作用,从血流切应力角度分析SL提取物抑制细胞骨架重构的Ca2+依赖性和非Ca2+依赖性效应,探讨SL提取物抑制As发生的作用机制。研究方法和内容 ***提取物对低切应力介导的兔颈总动脉粥样硬化形成的作用研究首先应用颈总动脉套管法建立局部低切应力兔动脉粥样硬化模型。在模型建立的2周、4周和8周,运用电磁血流量计分别检测套管近心端和对侧的血流量,耳中动脉取血后,应用全自动生化仪检测不同时间点各组动物的全血粘度和血清总胆固醇(’Total Cholesterol, TC)、甘油三酯(Triglyceride, TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol, LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(High Density Lipoprotein Cholesterol, HDL-C)的水平;同时在2周、4周和8周时取血管近心端及对侧相同体位血管,固定后HE染色观察血管病理情况,扫描电镜观察内皮形态变化。 ***提取物对低切应力诱导的兔颈总动脉粥样硬化形成的机制研究在造模并给药的2周、4周和8周,取颈总动脉套管处的近心端及对侧相同体位的血管,裂解组织后提取蛋白,应用Western blot检测血管组织中肌球蛋白轻链(MLC)和MLC的磷酸化水平p-MLC,检测肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和ROCK/ROK/Rho激酶(ROCK)的表达;免疫组织化学法检测不同时间点MLCK蛋白和ROCK蛋白表达水平。 ***提取物干预切应力介导的人脐动脉内皮细胞钙内流的研究 Bioflux1000控剪应力微流通道培养人脐动脉内皮细胞;数控剪切流系统加载不同切应力后进行免疫荧光染色,应用激光共聚焦显微镜实时观察细胞内游离钙变化。在应用MLCK特异性阻断剂ML-7, ROCK特异性阻断剂Y-27632及钙通道阻断剂Nicardipine干预的前提下,加载不同切应力,观察SL提取物对低切应力依赖的钙内流的影响。 ***提取物对切应力介导的细胞骨架重排的作用机制研究 BioFlux1000高通量微流系统培养人脐动脉内皮细胞,加载切应力后,进行免疫荧光染色,应用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架的变化,分析F-actin、 MLCK、ROCK、MLC、p-MLC表达的变化。在应用MLCK特异性阻断剂ML-7、ROCK特异性阻断剂Y-27632、钙通道阻断剂Nicardipine干预后

关键词： SL提取物动脉粥样硬化切应力细胞骨架重构血管内皮屏障

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水通道蛋白1在急性坏死性胰腺炎大鼠毛细血管内皮屏障功能障碍中的作用及大承气汤对其表达的影响

水通道蛋白1在急性坏死性胰腺炎大鼠毛细血管内皮屏障功能障碍中...

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作者：陈腾上海中医药大学

学位级别：硕士

[目的]从水通道蛋白1的角度阐明急性坏死性胰腺炎(ANP)毛细血管内皮屏障功能障碍的发生机制及大承气汤治疗急性坏死性胰腺炎的部分机理。<br>　　 [方法]雄性Sprague-Dawley大鼠160只,随机分为对照组、ANP组、生理盐水... 详细信息

[目的]从水通道蛋白1的角度阐明急性坏死性胰腺炎(ANP)毛细血管内皮屏障功能障碍的发生机制及大承气汤治疗急性坏死性胰腺炎的部分机理。<br>　　 [方法]雄性Sprague-Dawley大鼠160只,随机分为对照组、ANP组、生理盐水组、乙酰唑胺组和大承气汤组,制模后各时间点分批处死,处死前经阴茎静脉注入2％Evans Blue。检测血清淀粉酶;观察胰腺、肠壁、肺组织形态学变化并对胰腺组织病理改变进行严重度计分;检测组织毛细血管通透性;检测组织AQP1基因及蛋白表达。<br>　　 [结果]同时间点相比:(1)对照组无腹水,ANP及生理盐水组有大量腹水,乙酰唑胺组18h腹水量显著高于ANP组,大承气汤组6h、12h、18h腹水量显著低于ANP组;(2)ANP组、生理盐水组大鼠血清淀粉酶水平较对照组显著升高,乙酰唑胺组血清淀粉酶水平3h、6h、18h较ANP组升高,但未达到统计学差异,而大承气汤组淀粉酶水平显著低于ANP组;(3)ANP组、生理盐水组大鼠胰腺、肠壁及肺组织病变较对照组加重,乙酰唑胺组组织病变较ANP加重,大承气汤组病变较ANP组减轻:胰腺组织严重度计分大承气汤组显著低于ANP组;(4)ANP组、生理盐水组大鼠胰腺、肠壁、肺组织毛细血管通透性显著高于对照组,乙酰唑胺组3h血管通透性高于ANP组,大承气汤组6h、12h、18h组织血管通透性则明显低于ANP组;(5)实时定量PCR中,ANP组、生理盐水组大鼠胰腺、肠壁、肺组织AQP1基因表达明显弱于对照组,乙酰唑胺组胰腺组织3h、12h、18h,肠壁组织3h、6h、12h和肺组织3h、6h、12h基因表达明显低于ANP组,而大承气汤组胰腺组织、肠壁组织各时间点及肺组织3h、6h、***1基因表达则明显强于ANP组;(6)Western Blot检测中,ANP组、生理盐水组大鼠胰腺、肠壁、肺组织AQP1蛋白表达明显低于对照组,乙酰唑胺组胰腺组织3h、18h,肠壁组织3h、6h,肺组织3h、6h、18hAQP1蛋白表达低于ANP组,大承气汤组胰腺组织各时间点,肠壁组织3h、6h、12h及肺组织18hAQP1蛋白表达则明显高于ANP组。<br>　　 [结论](1)水通道蛋白1表达下调可能在急性坏死性胰腺炎大鼠毛细血管内皮屏障功能障碍发生中起重要作用。(2)大承气汤可以有效防治急性坏死性胰腺炎大鼠的毛细血管内皮屏障功能障碍,其机制可能与上调水通道蛋白1的表达有关。

关键词：急性胰腺炎坏死性水通道蛋白1 大承气汤血管内皮屏障

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牡荆素靶向FTO/m6A抗炎改善血管内皮屏障功能的分子机制研究

牡荆素靶向FTO/m6A抗炎改善血管内皮屏障功能的分子机制研究

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作者：甘婷南昌大学

学位级别：硕士

心血管疾病已成为全球疾病死亡的首要原因,高于肿瘤及其他疾病。慢性低水平炎症引起的血管内皮细胞屏障损伤是心血管疾病始动的关键诱因。因此,通过抑制血管内皮细胞炎症是防治心血管疾病的关键一环。活性小分子-牡荆素广泛分布于常见... 详细信息

心血管疾病已成为全球疾病死亡的首要原因,高于肿瘤及其他疾病。慢性低水平炎症引起的血管内皮细胞屏障损伤是心血管疾病始动的关键诱因。因此,通过抑制血管内皮细胞炎症是防治心血管疾病的关键一环。活性小分子-牡荆素广泛分布于常见水果、蔬菜、谷物、豆类及各类中草药中,具有防治心血管疾病、抗肿瘤及减脂等功能活性。实验室前期研究及文献调研发现,牡荆素对心血管疾病的防治作用依赖于其突出的抗炎功效,但直接作用的分子靶点未知。药物亲和反应靶向稳定性（Drug affinity responsive target stability,DARTS）联合质谱技术是基于小分子配体结合时靶点蛋白对蛋白酶降解的敏感性降低而发展起来的一项新技术,可用于快速和直接鉴定活性小分子作用的潜在靶点蛋白。因此,本论文以课题组前期的研究结果为基础,采用DARTS联合质谱技术筛选并鉴定牡荆素潜在的靶点蛋白,并通过非标记的生物分子互作、分子对接等技术明确牡荆素与候选靶点蛋白的相互作用及其作用位点;在TNFα联合IL-17诱导的低水平血管内皮细胞炎症模型下,通过Western blot、转录组测序、免疫荧光染色、荧光标记、Me RIP-q PCR等分子生物学技术探究候选靶点蛋白介导牡荆素抗炎改善血管内皮细胞屏障功能的作用及分子机制。主要研究结果如下:1、DARTS分析显示牡荆素可增加SDS-PAGE上分子量约为58 k Da蛋白条带的丰度,并且在该蛋白条带中检测到了牡荆素。综合后续质谱的特征肽、序列覆盖率、分子量比对、评分及丰度等参数,发现该条带代表的蛋白极可能是m RNA去甲基化酶FTO,其是牡荆素作用的候选靶点。采用免疫沉淀法将FTO蛋白特异性富集,也检测到了牡荆素。同时进一步的分子互作分析显示,牡荆素可显著猝灭FTO蛋白的固有荧光强度,并增加了FTO的耐蛋白酶水解性和热稳定性,表明牡荆素与FTO直接结合,且结合能力强于其他三个常见的黄酮类化合物-高良姜素、漆黄素和姜黄素。分子对接结果显示,与多数发现的小分子FTO抑制剂或激动剂不同,牡荆素并不是结合在底物结合区域,而是结合在起催化活性的区域附近,且牡荆素上的羟基和苯环通过与FTO蛋白形成的氢键、疏水相互作用及阳离子-π作用是两者结合的关键驱动力。此外,牡荆素与FTO的结合进一步抑制了低水平炎症所引起的细胞内m6A水平增加,提示FTO依赖的m6A去甲基化很可能介导牡荆素抗炎。2、牡荆素以剂量依赖的方式被血管内皮细胞摄取,并降低了细胞炎症模型下炎症因子ICAM和IL-6的基因及蛋白的表达水平。此外,Western blot、免疫荧光及荧光标记实验表明,牡荆素抑制了炎症引起的紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1表达的下调以及单层细胞膜通透性的增加,从而改善内皮细胞屏障功能。通过特异性抑制剂FB23阻断FTO的m6A去甲基化活性后,牡荆素丧失了降低细胞炎症模型下ICAM和IL-6表达以及改善内皮细胞屏障功能的作用,表明牡荆素确实通过靶向FTO介导的m6A去甲基化发挥抗炎及细胞屏障保护作用。3、牡荆素可降低炎症因子ICAM和IL-6 m RNA上的m6A水平,并降低其m RNA的稳定性,而FB23处理则使牡荆素失去了降低炎症因子m RNA稳定性的能力,表明ICAM和IL-6是牡荆素激活FTO活性后直接的去甲基化靶m RNA。此外,利用转录组测序技术鉴定到mi R-4786极可能也是FTO直接的m6A去甲基化靶m RNA,并通过SRAMP在线软件预测到其核酸序列上有一个保守的m6A甲基化位点GGACU。此外,mi R-4786表达在炎症下显著下调,而牡荆素显著上调了其表达。进一步通过针对mi R-4786 5′端和3′端的特异性抑制剂处理后,发现牡荆素失去了降低IL-6和ICAM的基因和蛋白表达的能力,表明除了直接影响IL-6和ICAM m RNA上m6A外,牡荆素还可通过间接影响mi R-4786 RNA上m6A及其表达来降低炎症因子的水平。综上所述,牡荆素抗血管内皮细胞炎症的分子机制为:与FTO直接结合并激活其去甲基化酶活性,一方面直接降低IL-6和ICAM m RNA上的m6A水平,另一方面去甲基化mi R-4786上调其表达,共同降低IL-6和ICAM的m RNA稳定性,从而下调炎症因子的蛋白表达,最终发挥抗炎作用。

关键词：心血管疾病牡荆素 FTO蛋白 N6-甲基腺苷抗炎血管内皮屏障 miR-4786

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血管内皮屏障功能及其调节的信号传导机制

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解剖科学进展 1999年第2期5卷 107-110页

作者：邵淑丽刘庆华齐齐哈尔大学生物系

论述了血管内皮屏障功能及其决定因素和影响因素；阐述了血管内皮屏障功能调节的信号传导机制。炎性介质可能通过Ｇ蛋白激活磷脂酶，介导第二信使的产生，进而激活蛋白激酶，引起肌球蛋白轻链磷酸化，导致内皮细胞内Ｆ－肌动蛋白骨架重... 详细信息

论述了血管内皮屏障功能及其决定因素和影响因素；阐述了血管内皮屏障功能调节的信号传导机制。炎性介质可能通过Ｇ蛋白激活磷脂酶，介导第二信使的产生，进而激活蛋白激酶，引起肌球蛋白轻链磷酸化，导致内皮细胞内Ｆ－肌动蛋白骨架重排，中心张力增加，细胞间裂隙形成，内皮细胞通透性发生改变。

关键词：血管内皮屏障功能调节信号传导

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