检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：唐红玲华中科技大学

学位级别：硕士

[背景及目的]转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR)是细胞摄取铁的主要途径,分为TfR1和TfR2两种。其中TfR1又称为CD71,在正常细胞中表达较低,而在快速增殖的肿瘤细胞表面高表达,且肿瘤细胞表面的TfR与转铁蛋白的亲和力是正常细胞的10... 详细信息

[背景及目的]转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR)是细胞摄取铁的主要途径,分为TfR1和TfR2两种。其中TfR1又称为CD71,在正常细胞中表达较低,而在快速增殖的肿瘤细胞表面高表达,且肿瘤细胞表面的TfR与转铁蛋白的亲和力是正常细胞的10～100倍,其表达水平与肿瘤的分期与预后息息相关。在肿瘤的靶向生物治疗中,如何获得特异性高且稳定性强的抗体是有待解决的关键问题。本课题旨在构建新型抗TfR双价抗体,建立稳定的真核表达细胞株,并探究其生物学效应,为其应用于靶向抗瘤研究奠定基础。[实验方法]1.抗TfR双价抗体表达载体TfR-scFv-Fc-pOptiVEC的构建以本课题组保存的鼠源型抗TfR-VH、TfR-VL为模板,设计引物通过Overlap-PCR的方法获得scFv。酶切后将其插入到pOptiVEC-Fc表达载体的Fc基因片段之前,构建抗TfR二价抗体真核表达载体TfR-scFv-Fc-pOptiVEC。2.抗TfR双价抗体真核表达载体TfR-scFv-Fc-pOptiVEC稳转细胞株(1)将TfR-scFv-Fc-pOptiVEC瞬时转染293T细胞,培养3天后,收集上清,ELISA试剂盒检测上清中抗体的含量,用FCM的方法检测3天细胞上清与CT11(稳定表达人TfR的CHO细胞系)及C14(空载对照的CHO细胞系)的结合活性及特异性;(2)将表达载体TfR-scFv-Fc-pOptiVEC线性化后电转真核细胞DG44(DHFR基因缺陷的CHO细胞),用无血清Opti培养基培养,同时添加甲氨喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选。细胞扩增后通过有限稀释法挑取单克隆,挑选出状态最佳的克隆,扩大培养后,收集上清,FCM检测上清与高表达TfR的细胞系Molt4的结合活性。3.抗TfR双价抗体的纯化及鉴定(1)扩大培养稳定表达抗TfR双价抗体的细胞株,收集上清,0.22μm的滤器过滤后通过Protein A预装柱,纯化获得抗TfR双价抗体;(2)SDS-PAGE检测抗体分子量及纯度;(3)用ELISA的方法检测抗体的浓度;(4)用ELISA的方法检测与TfR的亲和力,计算后得出一个常数。4.抗TfR双价抗体生物学效应的研究(1)FCM 法检测 HepG2.215、HepG2、MDA-MB-231、A549、Molt4、U266、KG-1a表面TfR的表达;(2)将3×104个靶细胞与6×105个PBMCs(效应细胞:靶细胞=20:1)在添加了抗TfR二价抗体(终浓度:6.25pmol/ml)的培养基中孵育5h。7-AAD染色后用FCM的方法检测抗TfR双价抗体联合PBMCs对高表达TfR的肿瘤细胞系介导的ADCC效应;(3)将3×104个靶细胞与补体(用量为20μl/100μl)在添加了抗TfR二价抗体(终浓度:6.25pmol/ml)的培养基中孵育3h。7-AAD染色后用FCM的方法检测抗TfR双价抗体联合补体对高表达TfR的肿瘤细胞系介导的CDC效应。[实验结果]1.抗TfR双价抗体表达载体TfR-scFv-Fc-pOptiVEC的构建以抗TfR抗体信号肽-VH和VL载体为模板,使用一段短的连接肽(G4S)3通过 Overlap-PCR 扩增获得 VH-Linker1-VL-Linker2(NheI/BamHI)序列,凝胶电泳位置与预测大小 800bp 左右一致。随后将 VH-Linker1-VL-Linker2(NheI/BamHI)序列和目的载体pOptiVEC-hFc用NotI/BamHI双酶切后,用连接酶将两者连接形成TfR-scFv-Fc表达载体,命名为TfR-scFv-Fc-pOptiVEC。通过克隆、酶切和测序鉴定证明抗TfR-scFv-Fc真核表达载体构建成功。TfR-scFv-Fc经哺乳动物细胞表达后可通过Fc段铰链区二硫键作用形成双链抗体(双价抗体),命名为TfR-Diabody。2.抗TfR双价抗体的表达(1)将TfR-scFv-Fc-pOptiVEC瞬时转染293T细胞后,3天后收集上清,ELISA试剂盒检测了上清中抗体的含量,结果显示为13.88mg/L,浓度可观。FCM检测瞬时转染细胞培养上清分别与CT11和C14的结合活性和特异性,结果表明培养上清与CT11的结合率为97.9%,而与C14的结合率仅为3.42%,证明表达上清中的抗体可与表达TfR的细胞株结合,且特异性较好;(2)TfR-scFv-Fc-pOptiVEC线性化后电转DG44细胞,培养过程中MTX加压筛选,一段时间后使用有限稀释法获得多株单克隆细胞株。ELISA检测各单克隆细胞株上清中抗体的浓度后,挑选出状态最好且相对高表达的稳转细胞株2号克隆,将其扩大培养后,收集上清,分别取上清100μl/

关键词：抗TfR双价抗体转铁蛋白受体抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用补体依赖的细胞毒作用

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抗精子蛋白17单克隆抗体对人卵巢癌细胞SKOV-3的抑制作用

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肿瘤防治研究 2012年第11期39卷 1297-1300页

作者：曹王丽宋佳希李芳秋贾瑄史利宁南京军区总医院解放军检验医学研究所南京210002

目的观察抗精子蛋白17单克隆抗体(anti-Sperm protein 17 monoclonal antibody,anti-Sp17mAb)对卵巢癌细胞系SKOV-3的体外抗肿瘤活性和机制。方法采用MTT法观察抗anti-Sp17 mAb对肿瘤细胞SKOV-3的细胞毒作用;以外周血单个核细胞PBMCs为... 详细信息

目的观察抗精子蛋白17单克隆抗体(anti-Sperm protein 17 monoclonal antibody,anti-Sp17mAb)对卵巢癌细胞系SKOV-3的体外抗肿瘤活性和机制。方法采用MTT法观察抗anti-Sp17 mAb对肿瘤细胞SKOV-3的细胞毒作用;以外周血单个核细胞PBMCs为效应细胞,SKOV-3为靶细胞,在效靶比分别为80∶1、40∶1和20∶1的条件下,观察anti-Sp17 mAb的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用;以SKOV-3为靶细胞,加入浓度为2.5%、5%、10%和20%的健康人新鲜血清作为补体,观察单抗的补体依赖性细胞毒性。结果 anti-Sp17 mAb对SKOV-3无明显细胞毒作用;与对照组相比,单抗对SKOV-3的ADCC作用呈剂量依赖关系,在效靶比为80∶1,孵育24 h后,细胞生长抑制率约为22%;补体的加入也可显著提高单抗对SKOV-3细胞生长的抑制率,在血清浓度为5%,单抗浓度为10μg/ml时抑制率达到了40%。结论 anti-Sp17 mAb对表达Sp17蛋白的卵巢癌细胞株SKOV-3具有明显的ADCC和CDC效应。

关键词：抗精子蛋白17单抗 SKOV-3 抗体依赖细胞介导的细胞毒作用补体依赖的细胞毒作用生长抑制

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HCV感染下调CD59表达促进补体介导的肝细胞损伤

HCV感染下调CD59表达促进补体介导的肝细胞损伤

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第二届全国病毒性肝炎慢性化重症化基础与临床研究进展学术会议

作者：杭小峰徐文胜倪武缪晓辉第二军医大学长征医院感染科

目的明确HCV感染对肝细胞CD59表达的调控效应及其对补体介导的肝细胞损伤的影响,探讨HCV感染下调肝细胞CD59表达的分子机制。方法 (1)采用实时荧光定量PCR、Western blot观察丙型肝炎患者肝组织及HCVcc感染的Huh7.5细胞中CD59的含量,观... 详细信息

目的明确HCV感染对肝细胞CD59表达的调控效应及其对补体介导的肝细胞损伤的影响,探讨HCV感染下调肝细胞CD59表达的分子机制。方法 (1)采用实时荧光定量PCR、Western blot观察丙型肝炎患者肝组织及HCVcc感染的Huh7.5细胞中CD59的含量,观察HCVcc感染后Huh7.5细胞CDC(补体依赖的细胞毒作用)效应的变化。(2)多个软件联合预测可能的CD59转录因子和可能调控CD59表达的miRNA,观察HCV感染后CD59相关转录因子表达水平及部分转录因子的磷酸化水平;观察丙型肝炎患者肝组织和Huh7.5细胞感染HCVcc后相关miRNA表达水平,在Huh7.5细胞中采用反义的寡核苷酸沉默CD59表达相关的miRNA观察对CD59表达的影响。结果 (1)HCV感染后CD59mRNA表达水平及蛋白表达水平均下降;HCVcc感染后Huh7.5细胞CDC效应增加。(2)HCV感染后肝细胞中转录因子CREB1、AP-1与SP1基因表达量无明显差异,CREB1磷酸化水平下降;HCV感染后肝细胞hsa-let-7b及hsa-let-7i含量明显升高,在Huh7.5细胞中转染反义的寡核苷酸anti-hsa-let-7i后CD59表达明显升高。结论 (1)HCV感染下调肝细胞CD59表达,并导致肝细胞CDC效应增加,提示CD59表达的下调可能参与HCV感染导致的肝脏炎症损伤过程。(2)HCV感染可能通过下调CREB1磷酸化水平、上调hsa-let-7i调控CD59表达。

关键词：丙型肝炎病毒感染肝损伤补体 CD59 补体依赖的细胞毒作用转录微小RNA

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抗CD45人—鼠嵌合抗体的构建、表达与鉴定

抗CD45人—鼠嵌合抗体的构建、表达与鉴定

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作者：朱志刚南方医科大学

学位级别：博士

研究背景急性髓系白血病(AML)是一种常见的恶性血液系统疾病,虽然化放疗和造血干细胞移植技术的应用提高了患者的生存率,但仍有60%-70%遭受该疾病痛苦的病人死于AML。放化疗后的造血干细胞移植只是为许多耐药白血病类型病人提供了一种... 详细信息

研究背景急性髓系白血病(AML)是一种常见的恶性血液系统疾病,虽然化放疗和造血干细胞移植技术的应用提高了患者的生存率,但仍有60%-70%遭受该疾病痛苦的病人死于AML。放化疗后的造血干细胞移植只是为许多耐药白血病类型病人提供了一种治愈的机会,尽管有许多研究团队已证明了这种治疗方法的有效、安全和可行性。研究证明针对白血病前体细胞和骨髓造血干细胞进行靶向放疗最安全的方法就是用放射物标记的抗体直接靶向白血病细胞或正常骨髓造血干细胞。用单克隆抗体治疗急性髓性白血病早已有所报道,常用的抗体靶向标志有CD33、CD66和CD45,而现行研究认为抗CD45的抗体是最具研发前景的。 CD45抗原是一种稳定、高表达于所有白细胞和他们的前体细胞以及超过70%的骨髓有核细胞表面上的单链细胞膜糖蛋白,CD45又被称为GP180、T200或白细胞共同抗原(LCA),是一种分子量约为200 kDa的酪氨酸磷酸酶,它稳定表达于除成熟红细胞和血小板外的所有造血细胞,且不存在于非造血组织中,使之成为治疗白血病的一个诱人的靶点。 CD45能广泛的表达于几乎所有的白细胞,包括骨髓的髓系前体细胞和淋巴结中的成熟淋巴细胞以及90%的AML细胞,这些细胞和组织为病人治疗的缓解或复发提供了大量抗体结合位点。由于CD45作为白细胞的标记物能出现在正常和恶性细胞,所以在病人体内应用抗CD45抗体可以通过代谢分布到骨髓、脾脏和淋巴结中与靶抗原结合,用于治疗急性白血病。在放射免疫治疗中,通常的做法是有选择地针对一个特定的抗原将放射性物质运输到肿瘤细胞。由于造血组织来源的细胞对放射线敏感和其上的靶抗原的高度可接近性,对血液系统肿瘤的放免治疗一直被认为是最成功的。在AML和MDS的放免治疗中,CD45抗原由于具有高表达和特异结合性而成为极具吸引力的靶向目标。放射性标记的抗CD45抗体可将辐射物质运输到抗原阳性细胞和周边环绕的抗原阴性细胞上。因此,放射免疫偶联物不需要以高浓度绑定到每一个白血病细胞上或渗入骨髓或肿瘤细胞中引发致死性的DNA损伤。在复发的白血病病人的放免治疗中,即使肿瘤细胞不表达CD45抗原,也会由于围绕其周围的高表达CD45抗原的非恶性造血细胞所介导的旁观者效应而被杀灭。在造血干细胞移植领域,CD45抗原的这些特性,能促进研究者针对它的放射性标记的系列抗体进行更加深入的研究,以便用于临床的治疗。随着CD45分子异构体的研究、流式细胞仪免疫分型的应用及抗CD45单抗的靶向治疗研究等深入发展,CD45分子在免疫学和血液学方面的应用研究受到进一步的关注。可以预期,CD45必将会在临床相关疾病的诊断、治疗和预后等方面发挥更大的作用。然而抗CD45单克隆抗体来源于小鼠,用于人体可诱导抗鼠抗体的产生。因此进行基因工程改造抗体具有重要实践意义。我们实验组已报道过了抗CD45单抗在AML治疗中良好前景,由于治疗中药物仍存在毒性使我们一直致力于不断的改进。在这篇文章中,我们首次报告关于抗CD45人-鼠嵌合抗体的构建,并描述了该基因工程抗体对血液系统疾病治疗的独特优势。为后续将该嵌合抗体和放射性物质如碘-131偶联,用于预定位放射免疫治疗自体和异体造血干细胞移植的进一步研究奠定了坚实的基础。人源化或嵌合单克隆抗体(MoAbs)能与造血细胞表达的抗原产生反应,他们可以直接(“亲本”或“裸”抗体)或通过与毒素、放射性同位素或抗肿瘤药物偶联而用于临床研发中。抗体治疗由于抗体小分子的特异性和亲和力在循环系统中容易与肿瘤细胞结合是急性的骨髓性白血病治疗的理想方案。根据其是否携带其他连接物分为未结合型单抗、抗癌药物结合型单抗及同位素结合型单抗。目前已有五个药物获美国FDA的批准用于临床,其中未结合型均为人-鼠嵌合抗体或人源化抗体。但单独使用未结合型CD45单抗的在人体内应用效果甚微和受到鼠源性的限制,目前国外关于CD45单抗的研究主要是与放射性核素131I及213Bi连接作为造血干细胞移植预处理方案的组成部分,以期减少TBI的剂量,从而减少TBI所导致的全身毒副作用。动物试验及Ⅰ/Ⅱ期临床试验均证实,CD45单抗能选择性的将放射性核素131I及213Bi导入骨髓、肝脾和淋巴结,可部分代替TBI参与预处理方案。Vallera等用90Y标记CD45单抗进行了淋巴瘤动物模型的治疗试验,结果显示,给予适当90Y-Anti-CD45剂量的所有小鼠,第6天肿瘤消失,观察到第135天无1例复发,肝、肾、小肠病理切片检查均未发现明显损害。我们已采用用90Y标记的CD45单抗进行急性白血病的治疗研究,前期实验中选择CDTPA螯合90Y与CD45单抗。CDTPA是一种经典的金属离子鳌合剂,早在1985年Hnatowich就用CDTPA螯合IgG与90Y

关键词： CD45 人-鼠嵌合抗体亲本单抗分子建模补体依赖的细胞毒作用竞争抑制作用

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补体调节蛋白CD55、CD59增强赫赛汀对NSCLC细胞株A549、H157作用的研究

补体调节蛋白CD55、CD59增强赫赛汀对NSCLC细胞株A549、H157作用...

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作者：赵伟鹏第三军医大学

学位级别：硕士

随着对肿瘤作用靶点认识的不断深入和单克隆抗体技术不断发展,单克隆抗体已经用于临床的肿瘤治疗。赫赛汀(Herceptin)是一种识别HER2/neu基因产物的人源化单克隆抗体,能直接作用于HER2/neu蛋白的胞外域,因而是一种理想的分子靶向治疗药... 详细信息

随着对肿瘤作用靶点认识的不断深入和单克隆抗体技术不断发展,单克隆抗体已经用于临床的肿瘤治疗。赫赛汀(Herceptin)是一种识别HER2/neu基因产物的人源化单克隆抗体,能直接作用于HER2/neu蛋白的胞外域,因而是一种理想的分子靶向治疗药物。HER2/neu是一种原癌基因,为表皮生长因子受体(EGFR)家族成员之一,该基因的扩增和过表达存在于多种肿瘤组织,包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、胃癌、前列腺癌和宫颈癌等。已有的研究证明HER2/neu在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达率达5%～50%,过度表达HER2/neu基因的NSCLC患者通常预后较差。Herceptin最早在乳腺癌治疗中取得成功,并被逐步用于NSCLC等实体肿瘤的治疗。目前,Herceptin作为一种有前途的治疗性单克隆抗体对NSCLC的有效率仍低于15%,其原因可能与Herceptin结合到NSCLC细胞后生物学效应部分受抑制有关。单克隆抗体作用肿瘤细胞相应的分子靶点后,产生的生物学效应主要包括抗体依赖性细胞毒作用(antibody dependent cellular cytotoxicity,ADCC)和补体依赖性细胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity,CDC)。由于补体调节蛋白(complement regulatory proteins,CRP)调控补体活化的各个步骤,探讨其在肿瘤组织的表达和临床意义已成为补体杀伤肿瘤研究的热点。CD55、CD59作为主要抑制补体活化的CRP,能调节CDC作用的强弱。我们假设CD55、CD59在肺癌细胞表面表达,而这种表达与Herceptin的临床治疗效果受限有关。如果假设正确,采用抗CD55、抗CD59是否可以增强Herceptin杀伤肿瘤细胞的效果?临床上Herceptin合用化疗药物(如顺铂)可以增强治疗效果,这种增效作用是否与下调CRP有关,尚有待探讨。本研究首先应用免疫组织化学方法检测了36例NSCLC手术标本和8例正常肺组织和中CD55、CD59的蛋白表达情况,并结合临床病理、随访资料分析CD55、CD59表达与NSCLC临床病理特征之间的相互关系。其次,在CD55、CD59表达阳性的NSCLC细胞系中,加入Herceptin激活补体后,加用阻断型CD55和/或CD59单克隆抗体,比较不同用药方式时Herceptin杀伤肿瘤细胞效果。最后,本研究利用流式细胞检测技术观察化疗药物顺铂半数抑制浓度时对两种NSCLC细胞系(A549和H157细

关键词：赫赛汀 CD55 CD59 顺铂非小细胞肺癌补体依赖的细胞毒作用

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