检索结果-内蒙古大学图书馆

中国病原生物学杂志 2023年第5期18卷 508-512页

作者：李紫玥苏晓悦谢晓婷胡欣陈佳琪董凤黄钰张莉张雷大理大学病原与媒介生物研究所云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室云南大理671000 大理大学基础医学院病原生物学综合实验室

目的分析淋病奈瑟菌外膜蛋白H.8的抗原表位,利用原核表达系统表达并纯化该蛋白。方法运用生物信息学相关软件对目的蛋白进行理化性质分析及B细胞表位、T细胞表位的预测。将外膜蛋白H.8基因克隆至pET32a(+)质粒,并在Rosetta(DE3)宿主菌... 详细信息

目的分析淋病奈瑟菌外膜蛋白H.8的抗原表位,利用原核表达系统表达并纯化该蛋白。方法运用生物信息学相关软件对目的蛋白进行理化性质分析及B细胞表位、T细胞表位的预测。将外膜蛋白H.8基因克隆至pET32a(+)质粒,并在Rosetta(DE3)宿主菌中构建原核表达系统,利用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白的表达及其免疫反应性。结果生物信息学分析显示外膜蛋白H.8的优势B细胞表位位于20-57、66-73、76-81、93-99、111-117、120-132、141-147、157-160肽段,优势T细胞表位位于125-139、132-146肽段。构建的含有外膜蛋白H.8基因的pET32a(+)重组质粒转化DE3后表达重组蛋白,以IPTG浓度为0.5mmol/L时重组蛋白在上清中的表达效果最佳;Western blot检测该重组蛋白能分别被His标签抗体和淋病奈瑟菌多克隆抗体识别。结论生物信息学方法预测淋病奈瑟菌外膜蛋白H.8含有优势B细胞表位和优势T细胞表位,原核表达的外膜蛋白H.8具有免疫反应性,为淋病奈瑟菌疫苗及其致病机制的研究提供了实验基础。

关键词：淋病奈瑟菌外膜蛋白H.8 原核表达及纯化表位分析

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结核分枝杆菌RD区编码蛋白表位分析及免疫效应的初步研究

结核分枝杆菌RD区编码蛋白表位分析及免疫效应的初步研究

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作者：代云鹏吉林农业大学

学位级别：硕士

结核病(Tuberculosis)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium Taberculosis,MTB)引起的慢性传染性疾病,致死率极高,始终是公共卫生和人类健康的巨大威胁。世界卫生组织发布的《全球结核病报告》指出,结核病每年新增病例约10万人,且在2022年至2... 详细信息

结核病(Tuberculosis)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium Taberculosis,MTB)引起的慢性传染性疾病,致死率极高,始终是公共卫生和人类健康的巨大威胁。世界卫生组织发布的《全球结核病报告》指出,结核病每年新增病例约10万人,且在2022年至2023年期间上升7.1%。作为结核病高负担国家之一,我国结核病的预防和控制面临着新的挑战。卡介苗(Bacille Calmette-Guérin vaccine,BCG)自1921年发明至今,是全球唯一的结核病预防疫苗,但随着时间推移,其预防结核病的不足日益明显,其保护效力根据地域和人群等有较大差异。研究表明,这可能与卡介苗缺失的一段毒力基因缺失区(Region of Difference,RD)有关。RD区共分为16个区,由129个基因组成。目前研究普遍集中在RD1区与RD2区的单个关键蛋白或关键蛋白组合。虽然多种新型疫苗(重组卡介苗、亚单位疫苗等)相继出现,但迄今为止还没有找到一个根治结核病的新途径及一种能够有效替代卡介苗的新疫苗。因此,本研究利用Net MHCpan-4.1、Net MHCIIpan-4.0、Bepipred、Vaxi Jen与Tox IBTL分析网站对结核分枝杆菌RD区编码的129个蛋白进行生物信息学分析,对MHC I类T细胞表位、MHC II类T细胞表位、B细胞线性表位、表位抗原相似性强弱与表位毒性强弱进行预测分析,根据预测分析结果筛选出5个优势蛋白Rv3871,Rv3874,Rv3875,Rv3879c,Rv3401与3个劣势蛋白Rv1986,Rv2074,Rv2660c,以H37Rv标准菌株基因为模板扩增出8个蛋白相对应目的基因后,将其构建于PMV361-e GFP整合载体中。获得8个重组质粒后,通过电转化的方法将其转入BCG中,得到8种重组卡介苗。成功构建8种重组卡介苗后,通过重组卡介苗侵染小鼠巨噬细胞RAW 264.7,观察其对RAW264.7炎症因子、细胞周期、细胞自噬、活性氧的影响,初步探究RD区蛋白的表位数量与免疫效应间的关系。主要研究结果如下: (1)利用Net MHCpan-4.1、Net MHCIIpan-4.0、Bepipred、Vaxi Jen、Tox IBTL预测网站,对结核分枝杆菌RD区129个编码蛋白的FASTA序列进行预测,并通过对表位数量的多少,表位毒性强弱及表位抗原相似性强弱几个方面进行筛选,以表位数量多,表位抗原相似性强,毒性低为筛选条件,最终筛选出Rv3871、Rv3874、Rv3875、Rv3879c、Rv34015个优势的优势蛋白与Rv2074、Rv1986、Rv2660c 3个劣势蛋白。 (2)成功获得8个蛋白的基因片段,利用整合载体成功构建r BCG-Rv3871、r BCG-Rv3874、r BCG-Rv3875、r BCG-Rv3879c、r BCG-Rv3401、r BCG-Rv2074、r BCG-Rv1986、r BCG-Rv2660c 8种重组卡介苗,且重组卡介苗菌株与标准卡介苗菌株在同一培养条件下,重组卡介苗菌株能够正常生长,与卡介苗菌株生长周期相似,同时具有侵染巨噬细胞的能力。 (3)BCG及8种重组卡介苗体外侵染小鼠RAW 264.7巨噬细胞实验结果显示:与对照组相比r BCG-Rv3871、r BCG-Rv3874、r BCG-Rv3875、r BCG-Rv3879c、r BCG-Rv3401组G1占比显著提高(P<0.05),S期占比较对照组降低,差异显著(P<0.05);与对照组相比r BCG-Rv3874、r BCG-Rv3875、r BCG-Rv3871、r BCG-Rv3879c、r BCG-Rv3401组产生的活性氧显著增多(P<0.05);与对照组相比r BCG-Rv3874产生的细胞自噬结果最为显著(P<0.05);与对照组相比r BCG-Rv3871、Rv3874、r BCG-Rv3875、r BCG-Rv3879c、r BCG-Rv3401组INF-γ表达水平显著升高(P<0.05)。综上,本研究利用生物信息学的方法成功预测出结核分枝杆菌RD区129个编码蛋白表位间数量关系,利用PMV361-e GFP整合载体将筛选出的8个基因成功转入卡介苗中。通过侵染小鼠RAW 264.7巨噬细胞相关实验,初步探究了结核分枝杆菌RD区编码蛋白表位与免疫原性间的关系,为结核病疫苗的研制奠定基础。

关键词：重组卡介苗 RD区表位分析免疫效应

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淋病奈瑟菌全基因组中外膜蛋白的筛选及其表位分析

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中国病原生物学杂志 2021年第7期16卷 787-791页

作者：陈佳琪宋佳林高洁刘颖董凤张雷张莉大理大学基础医学院病原生物学综合实验室云南大理671000 佳木斯大学附属第一医院广西医科大学附属肿瘤医院云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室

目的利用生物信息学软件从淋病奈瑟菌全基因组数据中筛选外膜蛋白候选抗原,并对候选抗原进行T细胞和B细胞表位分析,为淋病奈瑟菌疫苗和分子诊断制剂的研制奠定基础。方法对淋病奈瑟菌标准菌株FA1090基因组数据库中推定的2 002个编码蛋白... 详细信息

目的利用生物信息学软件从淋病奈瑟菌全基因组数据中筛选外膜蛋白候选抗原,并对候选抗原进行T细胞和B细胞表位分析,为淋病奈瑟菌疫苗和分子诊断制剂的研制奠定基础。方法对淋病奈瑟菌标准菌株FA1090基因组数据库中推定的2 002个编码蛋白,用SingnalP和PrediSi软件预测信号肽。在具有信号肽的蛋白序列中以TMHMM和Phobius软件为主预测跨膜螺旋结构并构建ORF-TMH外膜蛋白库;利用PSORTb和Cell-Ploc软件进行蛋白表达的亚细胞定位分析,得到ORF-SCL外膜蛋白库。综合"双库"的结果,筛选最有可能表达在淋病奈瑟菌外膜的候选外膜蛋白抗原库。利用BLASTp筛除同源性较低的外膜蛋白;运用ABCpred和BepiPred分析B细胞表位;运用NetCTLpan和SYFPEITHI分析CTL表位;运用SYFPEITHI和NetMHCIIpan分析Th表位。结果预测有信号肽的蛋白序列共350个,"双库"筛选出30个最有可能表达在淋病奈瑟菌外膜的蛋白。通过同源性分析、T细胞表位和B细胞表位分析,得到26个蛋白序列为最有潜力的候选疫苗抗原。结论从淋病奈瑟菌标准菌株FA1090全基因组数据中反向筛选出26个最有可能成为外膜蛋白的候选抗原,为淋病奈瑟菌疫苗的研究奠定了基础。

关键词：淋病奈瑟菌生物信息学外膜蛋白筛选表位分析

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埃博拉病毒广谱单克隆中和抗体的筛选及表位分析

埃博拉病毒广谱单克隆中和抗体的筛选及表位分析

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作者：王龙雨安徽大学

学位级别：硕士

埃博拉病毒属于丝状病毒科埃博拉病毒属,为单股负链不分节段RNA病毒。丝状病毒科主要包含埃博拉病毒属和马尔堡病毒属。埃博拉病毒属扎依尔型(Zaire,ZEBOV)、苏丹型(Sudan,SUDV)、本迪布焦型(Bundibugyo,BDBV)、塔伊森林型(Tai Forest,T... 详细信息

埃博拉病毒属于丝状病毒科埃博拉病毒属,为单股负链不分节段RNA病毒。丝状病毒科主要包含埃博拉病毒属和马尔堡病毒属。埃博拉病毒属扎依尔型(Zaire,ZEBOV)、苏丹型(Sudan,SUDV)、本迪布焦型(Bundibugyo,BDBV)、塔伊森林型(Tai Forest,TAFV)、莱斯顿型(REstonia,RESTV)五个亚型。马尔堡病毒属包含马尔堡病毒(Marburg,MARV)、Ravn病毒(RAVV)。2014-2016年起始于西非的埃博拉病毒导致了上万人的死亡,2019年在刚果地区爆发的新一轮的疫情已导致两千多人的死亡,对全球公共卫生造成了重大威胁。此外,迄今已报告了十多起马尔堡病毒感染疫情,其病死率高达90%。对于埃博拉与马尔堡病毒的感染,尚无批准使用的特异性治疗药物。中和抗体已被证明是治疗埃博拉病毒感染的有效手段,病毒表面糖蛋白(glycoprotein,GP)是中和抗体的主要靶点。目前埃博拉病毒中和抗体研究较多,但尚无报道对埃博拉病毒属和马尔堡病毒属都具有中和活性的广谱中和抗体。前期实验中,本实验室制备了腺病毒载体埃博拉候选疫苗并评价了其免疫原性,同时从免疫的中国猕猴体内获得了埃博拉病毒中和抗体,这些抗体在小鼠体内可有效抑制埃博拉病毒的感染。鉴于此,我们提出如下科学问题:能否从多次免疫埃博拉和马尔堡候选疫苗的中国猕猴体内分离到埃博拉与马尔堡病毒的广谱中和抗体?我们探讨如下研究内容:(1)埃博拉病毒和马尔堡病毒的GP蛋白是否具有保守表位。(2)候选疫苗免疫多次后,猕猴血清中能否产生高效价的广谱中和抗体。(3)筛选分别对两种病毒GP蛋白特异性的记忆B细胞,通过单细胞PCR技术获得抗体可变区基因并进行抗体功能的验证。(4)对获得的广谱中和抗体进行表位分析。本课题研究发现:(1)埃博拉和马尔堡病毒主要致病株扎伊尔型埃博拉病毒GP蛋白(ZGP)、苏丹型埃博拉病毒GP蛋白(SGP)、马尔堡病毒GP蛋白(MGP)的氨基酸相似性约为30%,在RBD(受体结合区)存在氨基酸保守位点。(2)我们使用埃博拉与马尔堡候选疫苗对中国猕猴进行反复免疫,针对ZGP、SGP、MGP三种蛋白,猕猴血清均具有较高结合活性,并能有效中和以上三种假病毒。(3)分离免疫猕猴外周血单核细胞(PBMC),流式分选GP蛋白特异性记忆B细胞,利用单细胞PCR技术成功制备96株单克隆抗体,有21株抗体对至少一种GP蛋白具有结合活性。经过表达、纯化后,检测发现有11株抗体对三种GP蛋白均具有结合活性。其中,四株抗体7D10、7E10、40C1L、41F8对三种假病毒都具有中和活性。(4)我们对中和抗体结合位点进行分析,发现三株中和抗体分别可与SGP1蛋白、ZGP RBD蛋白结合,提示三株中和抗体均识别RBD保守位点。利用实验室已有的SGP与MGP蛋白多肽库检测4株广谱中和抗体的线性表位,发现抗体7D10能够与RBD保守区多肽GAFFLYDRIA序列结合,而其它3株抗体与多肽并无明显结合。综上所述,我们利用候选疫苗免疫中国猕猴,使其产生广谱中和抗体。进而利用单细胞PCR技术分离到针对埃博拉与马尔堡病毒的广谱单克隆中和抗体,并探究其结合表位。本文对丝状病毒广谱中和抗体的研究提供了参考,为丝状病毒广谱特效药物及广谱疫苗的研发奠定了基础。

关键词：埃博拉病毒单克隆抗体单细胞PCR技术表位分析

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多表位疫苗生物信息学分析概述

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热带医学杂志 2023年第10期23卷 1487-1492页

作者：尹双双张建辉郑之琬李浇何金蕾陈建平四川大学华西基础医学与法医学院病原生物学系寄生虫教研室四川成都610041

疫苗接种是防治传染性疾病的一种有效的防治策略。安全、有效和低成本的疫苗是如今疫苗研究的追求目标。生物信息学和高通量测序的方法为疫苗研究带来了新的思路,通过生物信息学分析工具进行表位预测,分析出可以诱导有效的细胞免疫和体... 详细信息

疫苗接种是防治传染性疾病的一种有效的防治策略。安全、有效和低成本的疫苗是如今疫苗研究的追求目标。生物信息学和高通量测序的方法为疫苗研究带来了新的思路,通过生物信息学分析工具进行表位预测,分析出可以诱导有效的细胞免疫和体液免疫反应的优势表位参与疫苗构建,再综合其他方面的生物信息学技术评估最终构成新的多表位疫苗。本文主要从抗原选取、计算机表位预测、多表位的连接、蛋白三维构建及评估、分子对接、分子动力学模拟等方面对当前最主要的多表位疫苗研究策略进行综述,同时总结了多表位疫苗目前的研究情形和未来的发展。该策略已经应用于新冠病毒、疟疾及利什曼原虫等病原体的多表位疫苗研究之中。

关键词：多表位疫苗生物信息学表位分析

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基于抗原表位分析的人乳头瘤病毒16L1壳蛋白基因克隆及表达纯化

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现代妇产科进展 2015年第7期24卷 531-533页

作者：李屹贾杰刘婷艳彭秀红罗喜平广州医科大学附属广东省妇女儿童医院妇科广州510010 广州医科大学附属广东省妇女儿童医院麻醉科广州510010

目的：选择人乳头瘤病毒（HPV）16L1抗原性最强的一段抗原表位编码区,构建原核表达载体并利用大肠杆菌表达抗原蛋白,为HPV疫苗的研究及宫颈癌的诊断奠定基础。方法：借助DNAstar软件分析HPV16L1的CDS区,选择抗原性最强的一段抗原表位编... 详细信息

目的：选择人乳头瘤病毒（HPV）16L1抗原性最强的一段抗原表位编码区,构建原核表达载体并利用大肠杆菌表达抗原蛋白,为HPV疫苗的研究及宫颈癌的诊断奠定基础。方法：借助DNAstar软件分析HPV16L1的CDS区,选择抗原性最强的一段抗原表位编码区,提取HPV16L1编码区的DNA。目的 DNA和p ET32a质粒分别进行双酶切,连接并转化DH5α大肠杆菌,筛选阳性克隆后转化BL21大肠杆菌,诱导产生HPV16L1重组蛋白,通过市售抗体对重组蛋白的抗原特异性进行鉴定。结果：利用DNAstar软件,选择了抗原表位较富集的碱基序列919~1314bp区段,按常规制备重组蛋白的方法成功制备HPV16L1重组蛋白。抗体鉴定表明,制备的重组蛋白抗原特异性良好。结论：有针对性地制备HPV16L1重组蛋白,可避免其他抗原表位的干扰。经鉴定,HPV16L1重组蛋白抗原特异性良好,将为HPV疫苗的研究及宫颈癌的诊断奠定基础。

关键词：表位分析 HPV16L1 原核表达宫颈癌

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抗高致病性禽流感H5N1的人源广谱中和性单克隆抗体100F4和65C6的表位分析及中和机制研究

抗高致病性禽流感H5N1的人源广谱中和性单克隆抗体100F4和65C6的...

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作者：钱梦然中国科学院大学

学位级别：博士

流感是由正粘病毒科的流感病毒所引起的一种传染性疾病。它能够在全世界范围内广泛传播并在多种宿主中引起大规模的感染，造成了极大的疫情和经济损失。由于流感病毒的高突变率及病毒重排所带来的变异，现今流感治疗及疫苗研发最重要的... 详细信息

流感是由正粘病毒科的流感病毒所引起的一种传染性疾病。它能够在全世界范围内广泛传播并在多种宿主中引起大规模的感染，造成了极大的疫情和经济损失。由于流感病毒的高突变率及病毒重排所带来的变异，现今流感治疗及疫苗研发最重要的是设计能够有效地引起机体产生广谱且持续的中和抗体反应的免疫原，以便能够预防和保护已知的和将到来的未知的流感病毒感染。　　高致病性禽流感病毒H5N1自1996年在中国出现以来，造成了超过5亿家禽感染，至今已有八百多人感染H5N1禽流感病毒，致死率将近60％。家禽感染后引起的巨大经济损失，在人类中极高的致死率和其造成下一次流感大流行的可能性引起了极大的公众关注和恐慌。　　实验室之前从感染高致病性禽流感H5N1的康复期病人记忆B细胞中分离到三株人源中和性单克隆抗体65C6、100F4和3C11，发现其中两株抗体65C6和100F4能够广谱且高效的中和除7.2亚型中某些毒株以外的所有H5N1病毒，并解析了其中一株65C6的中和表位。　　在本论文中，我们首先研究了另一株抗体100F4的体外及体内中和能力，发现它是一株高效的广谱中和抗体，在小鼠体内实验中有很好的预防及治疗作用，对于H5N1高致病性禽流感的临床治疗有着非常良好的应用前景。　　其次，我们通过酵母展示筛选出影响抗体100F4结合的HA上的氨基酸位点，再由假病毒中和实验和逃逸株筛选实验来验证表位，成功解析了100F4的中和表位。我们进一步解出了抗体100F4 Fab片段与HA蛋白头部的共结晶结构，更加精确得描述了抗体与抗原的结合方式。我们发现100F4的表位位于HA蛋白的头部受体结合位点以外的区域，为21个不连续的氨基酸组成，包含有我们之前鉴定出的D68和E112关键氨基酸位点。它是一个新的，在H5N1病毒中高度保守的中和表位。抗体100F4的轻重链共6个互补决定区CDR均与HA蛋白有相互作用，它能与HA上的关键位点如D68与E112间形成氢键，一旦此氢键被破坏，就会极大得影响抗体与抗原的结合，这更进一步验证了我们之前的功能实验中所得表位的准确性。　　我们同时也解析了抗体65C6的Fab片段与HA蛋白头部的共结晶结构，发现其同样位于HA头部受体结合位点以外，但与受体结合位点非常靠近，较100F4的表位更靠近HA的顶端。它由18个氨基酸组成，包含有我们在之前的工作中鉴定得到的关键氨基酸残基P118，S121，K161，R162，Y164，T167，并且在H5N1中高度保守。65C6主要通过重链尤其是HCDR3与HA蛋白互作，并在关键位点如与P118，K161，R162，Y164，T167位置形成分子键、氢键、盐桥等多种分子相互作用。　　由于100F4和65C6的抗体表位是新的表位，且位于受体结合位点以外，我们又进一步研究了抗体100F4与65C6的中和机制。我们发现无论病毒与细胞上的受体结合之前还是之后，抗体均可以与病毒相结合，并可以随着病毒一起被内吞进入细胞直至细胞的核外周区域。抗体100F4主要通过抑制HA介导的低pH诱导的膜融合过程来抑制病毒感染，而抗体65C6不仅能够部分的抑制病毒与细胞受体的结合，其主要的功能同样是抑制膜融合过程。抗体100F4与65C6的表位在HA1头部，却通过抑制HA2部分介导的膜融合过程来发挥作用，这是一个全新的中和机制。　　在对100F4的逃逸株病毒的研究中，我们发现逃逸株病毒ES不可以被抗体100F4中和，在小鼠体内保护实验中也不能被100F4保护。然而抗体100F4却仍能够识别并结合逃逸株病毒ES，并与其一同进入细胞直至核外周区域。基于这些现象，我们对病毒的逃逸机制做了一些初步的探讨。我们发现100F4虽然能够与ES病毒结合，却不能够阻止ES的HA蛋白所介导的低pH诱导的膜融合过程。进一步研究发现100F4对ES的HA蛋白的亲和力比对野生型HA的亲和力低。我们推测100F4与逃逸株病毒ES及野生株SZ的HA蛋白的亲和力差异可能导致了其不能够阻止逃逸株ES的HA构象发生变化释放出融合肽，从而不能阻止后续的膜融合过程。　　这些发现进一步完善了我们对流感抗体中和机制的理解，抗体100F4和65C6的广谱中和表位对于流感广谱疫苗的研发有一定的指导意义。

关键词：高致病性禽流感人源广谱单克隆抗体中和机制表位分析

来源：评论

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猫疱疹病毒Ⅰ型gD蛋白单克隆抗体及荧光微球试纸条的研制

猫疱疹病毒Ⅰ型gD蛋白单克隆抗体及荧光微球试纸条的研制

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作者：甘雅琴华中农业大学

学位级别：硕士

猫疱疹病毒Ⅰ型（Feline herpesvirus-1,FHV-1）可以引起猫科动物急性、高度接触性上呼吸道疾病,是导致猫上呼吸道疾病的最严重病原。目前,FHV-1已呈世界性流行,发病率可达100%,病死率20%～50%,约80%的猫感染该病毒后终身带毒,严重影响... 详细信息

猫疱疹病毒Ⅰ型（Feline herpesvirus-1,FHV-1）可以引起猫科动物急性、高度接触性上呼吸道疾病,是导致猫上呼吸道疾病的最严重病原。目前,FHV-1已呈世界性流行,发病率可达100%,病死率20%～50%,约80%的猫感染该病毒后终身带毒,严重影响着宠物猫及野生猫科动物的健康。国内主要使用灭活疫苗免疫以保护动物机体免受FHV-1感染,然而目前尚无获批兽药证书的抗体检测试剂盒,也无特异性治疗药物。因此,研制中和抗体和更加方便、快捷的检测方法,对于预防和治疗FHV-1感染具有重要意义。因此,本研究以实验室前期构建的FHV-gD中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary Cell,CHO）细胞系表达FHV-gD蛋白,免疫BALB/c小鼠后,利用传统杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体,并筛选中和单克隆抗体,通过鉴定中和抗体识别的表位分析其保守性,评估其作为FHV-1特异性治疗药物的潜力。同时将FHV-gD蛋白进行荧光微球标记和包被在检测线、以单克隆抗体作为质控线划线抗体,建立双抗原夹心时间分辨荧光微球试纸条,以检测FHV-1抗体。本研究的主要研究结果如下: 1、FHV-gD单克隆抗体的研制以实验室前期构建的FHV-gD CHO细胞系分泌表达FHV-gD蛋白,纯化浓缩后浓度可达3.374 mg/m L,纯度达98%。通过蛋白与猫FHV-1阳性血清的Western blot实验,说明FHV-gD具有良好的免疫反应性。将FHV-gD蛋白作为免疫原免疫小鼠,免疫鼠血清抗体效价达到1:10000后进行细胞融合,分别采用蛋白与病毒包被的ELISA板对阳性细胞进行双重筛选,最终获得5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,命名为2D-1、5E-6、2E-11、2A-12、7C-13。染色体计数实验结果显示5株单克隆抗体染色体数目分别为:89条、102条、99条、100条、99条,为融合细胞。亚类鉴定结果显示5E-6、2A-12的重链为Ig G1,2D-1、2E-11、7C-13的重链为Ig G2a,5株单抗轻链均为kappa链;ELISA检测5株单抗腹水效价为10-6～10-8;间接免疫荧光结果显示,研制的单克隆抗体与猫杯状病毒（Felinecalici virus,FCV）、猫细小病毒（Felineparvo virus,FPV）不反应,能够特异性识别FHV-1。 2、FHV-gD中和单克隆抗体识别表位的鉴定本研究Western blot结果显示,5株单抗均能与FHV-gD蛋白特异性结合,证明5株单抗识别的表位均为线性表位;利用中和试验检测5株单抗,发现5E-6具有中和效果,其腹水中和效价为10-3;将FHV-gD全长氨基酸序列截短后进行重组蛋白表达,其中截短蛋白f1、f6与5E-6单抗的Western blot均呈阳性反应,证明5E-6单抗识别的表位位于这两个片段的交叠区域,即308PIIISDDDVP318;将鉴定的表位序列与报导的FHV-gD氨基酸序列进行比对,结果显示5E-6单抗表位高度保守。 3、FHV-1时间分辨荧光微球试纸条抗体检测方法的建立为检测FHV-1疫苗免疫后的抗体水平,本研究建立了双抗原夹心荧光微球试纸条。将FHV-gD蛋白与荧光微球偶联,以FHV-gD蛋白作为检测线包被抗原,5E-6单抗作为质控线划线抗体,建立时间分辨荧光微球试纸条。以研制的试纸条检测猫FCV、FPV、FHV-1阳性血清,结果显示试纸条仅与猫FHV-1阳性血清反应,具有良好特异性;将猫FHV-1阳性血清进行梯度稀释,以本研究制备的试纸条检测不同稀释度,结果显示其敏感性为1:256;以研制的试纸条和间接免疫荧光试验两种方法检测34份猫临床血清,结果显示试纸条与间接免疫荧光实验试验的检测结果符合率为95%。本研究建立的试纸条检测方法具有良好的特异性和敏感性,可用于FHV-1抗体的快速检测。本研究以FHV-gD真核蛋白为免疫原,成功研制了5株单克隆抗体,其中1株具有中和效果,并成功鉴定其识别的中和表位,该中和表位高度保守。基于FHV-gD蛋白和研制的单克隆抗体成功建立双抗原夹心荧光微球试纸条以检测FHV-1抗体。

关键词：猫疱疹病毒Ⅰ型 gD蛋白单克隆抗体表位分析检测方法

来源：评论

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基孔肯雅病毒E2蛋白单克隆抗体制备与ELISA方法建立

基孔肯雅病毒E2蛋白单克隆抗体制备与ELISA方法建立

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作者：吴建超昆明医科大学

学位级别：硕士

【背景】基孔肯雅热（Chikungunya Fever,CHIKF）是由埃及伊蚊和白纹伊蚊作为传播媒介传播的基孔肯雅病毒（Chikungunya virus,CHIKV）感染引起的疾病,主要症状表现为发热和关节疼痛等。自2000年以来,CHIKF在全球发生多次大规模暴发,造... 详细信息

【背景】基孔肯雅热（Chikungunya Fever,CHIKF）是由埃及伊蚊和白纹伊蚊作为传播媒介传播的基孔肯雅病毒（Chikungunya virus,CHIKV）感染引起的疾病,主要症状表现为发热和关节疼痛等。自2000年以来,CHIKF在全球发生多次大规模暴发,造成巨大的经济损失。然而,由于CHIKV感染引起的临床症状与登革病毒感染的很相似,且这两种病毒常常发生共感染,CHIKV的感染常常被误诊为登革病毒感染。因此,建立CHIKV感染特异性的检测方法对于CHIKF的预防和控制有着极为重要的意义。【目的】制备对CHIKV具有高亲和力,且能与不同谱系CHIKV有交叉反应的单克隆抗体。通过制备的抗体建立酶联免疫吸附法（ELISA）,为CHIKV感染的快速和准确的诊断提供工具。【方法】（1）用基孔肯雅病毒包膜蛋白E2（CHIKV-E2）重组蛋白作为抗原免疫小鼠,通过常规的杂交瘤方法制备抗CHIKV-E2单克隆抗体。（2）用真核表达系统表达3种基因型CHIKV的E2蛋白,通过Western blot分析单克隆抗体与不同基因型的CHIKV-E2结合特性。（3）以CHIKV-E2重组蛋白作为抗原,分别通过间接ELISA和生物膜干涉技术（Bio-Layer Interferometry,BLI）分析单克隆抗体与CHIKV-E2的结合亲和力。（4）将单克隆抗体进行两两组合,通过双抗体夹心捕获抗原ELISA筛选出最佳的抗体组合。（5）将筛选出的最佳抗体组合通过双抗体夹心法ELISA,对梯度稀释的CHIKV-E2重组蛋白进行捕获,分析检测的灵敏度。并用其它虫媒病毒的蛋白作为抗原,分析检测方法的特异性。（6）最后,以CHIKV-E2蛋白不同结构域缺失突变体或CHIKV-E2肽库作为抗原,通过Western blot和ELISA分析单克隆抗体作用的具体表位,并通过生物信息学的方法分析这些抗原表位的保守性。【结果】本研究通过传统的杂交瘤技术获得了25株能与CHIKV-E2抗原反应的单克隆抗体,其中ELISA的S/N值在10以上有6株单克隆抗体。亚型分析表明这6株抗体均为Ig G1。Western blot分析表明,这6株单克隆抗体能与不同谱系的CHIKV-E2蛋白结合。间接ELISA分析抗体的EC50表明,6株抗体中有5株的EC50（ng/m L）(1F1:18.62;2F10:6.724;3B9:5.512;3F4:19.43;4G10:3.02)高于市售抗体CHK265（EC50=33.94ng/m L）,抗体1G10的EC50（ng/m L）最低（61.13）。进一步的BLI分析发现,抗体的KD（n M）值为1.17x10-8至9.43x10-10,均低于10-7,这些结果表明6个抗体与CHIKV-E2蛋白之间较高的亲和力。6个抗体经两两组合和双抗体夹心ELISA分析后表明,以2F10为捕获抗体和1G10为检测抗体的组合,检测CHIKV-E2重组蛋白,可以得到最高的S/N值,检测CHIKV-E2重组蛋白的最低浓度为771.7pg/m L。特异性分析表明,2F10和1G10组合只与CHIKV-E2蛋白反应,而与实验中其它虫媒病毒不发生反应。最后,我们通过WB和ELISA确定了抗体1G10和2F10分别识别CHIKV-E2蛋白的C结构域（281aa-294aa）和B结构域（190aa-203aa）。【结论】本研究获得了一对针对CHIKV-E2蛋白保守表位的高亲和力单克隆抗体,以这对抗体建立的ELISA检测方法能用于特异性地检测不同谱系的CHIKV-E2蛋白。因此,本研究为进一步开发高特异性和高灵敏度CHIKV的ELISA检测方法奠定了一定基础。

关键词：基孔肯雅 E2蛋白单克隆抗体酶联免疫检测表位分析

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细粒棘球蚴重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162的表达、鉴定纯化及抗原表位预测分析

细粒棘球蚴重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162的表达、鉴定纯化及抗原表...

引用

作者：孔慧芳新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:克隆基因CTLA-4IgV、EgG1Y162-2、EgG1Y162,构建重组质粒pET30a-CTLA-4IgV、pET30a-EgG1Y162-2、pET30a-EgG1Y162、pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2、pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162;探索最优的诱导表达纯化条件获得大量重组蛋白;通过生物信息学方法分析各重组蛋白的蛋白三级结构及T/B抗原表位并进行比较,为后期细粒棘球蚴重组亚单位疫苗的免疫动物实验创造条件。方法:1)利用生物信息学技术确定绵羊CTLA-4（NM001009214）的胞外区,设计引物从被ConA活化的新疆绵羊外周血淋巴细胞cDNA中提取总RNA,mRNA逆转录为cDNA,利用PCR的方法以cDNA为模板扩增 CTLA-4胞外区基因序列,构建pMDTM19-T-CTLA-4IgV重组质粒。经PCR、测序鉴定后,将测序正确的CTLA-4IgV酶切后连接入原核表达载体pET-30a（+）中,构建质粒pET30a-CTLA-4IgV;2)从原头蚴cDNA中分别扩增出EgG1Y162-2和EgG1Y162基因,构建pMD TM19-T-EgG1Y162-2和pMDTM19-T-EgG1Y162重组质粒。经PCR、酶切及测序鉴定后,将测序正确的EgG1Y162-2和EgG1Y162酶切后连接入原核表达载体pET-30a（+）中,构建质粒 pET30a-EgG1Y162-2 和 pET30a-EgG1Y162;3)分别将 pET30a-EgG1Y162-2和 pET30a-EgG1Y162 双酶切后连入 pET30a-CTLA-4IgV 载体,构建pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2和pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162;4)将构建的 5个重组质粒分别转化入BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞,采用IPTG诱导表达蛋白,裂解后采用SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达的重组蛋白;5)使用HisTrap纯化柱探索不同的纯化条件并对各重组蛋白进行纯化;6)利用生物信息学方法分析抗原蛋白表位情况。结果:1)琼脂糖凝胶电泳及测序结果显示新疆绵羊CTLA-4IgV（369bp）编码基因扩增成功,片段大小符合设计长度,成功构建pET30a-CTLA-4IgV重组质粒。使用clusterX对NCBI上多个地区羊的CTLA4-IgV氨基酸序列进行多序列比对,发现新疆绵羊的CTLA4-IgV有其独特的氨基酸序列;2)扩增出EgG1Y162-2（197bp）和 EgG1Y162（354bp）基因,成功构建 pET30a-EgG1Y162-2 和pET30a-EgG1Y162 重组质粒;3)成功构建 pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2 重组质粒和pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162重组质粒;4)SDS-PAGE显示各个重组表达质粒（pET30a-CTLA-4IgV、pET30a-EgG1Y162-2、pET30a-EgG1Y162、pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2、pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162）在诱导条件分别为（0.2mmol IPTG 28℃ 培养 4h、0.5mmol IPTG 37℃ 培养 4h、0.2mmol IPTG 28℃ 培养 6h、0.2mmol IPTG28℃ 培养 4h、0.2mmol IPTG 28℃/37℃ 各培养 2h）时均能在菌液中高效表达重组蛋白。表达的目的蛋白CTLA-4IgV、EgG1Y162-2、EgG1Y162、CTLA-4IgV-EgG1Y162-2、CTLA-4IgV-EgG1Y162 经 Western blotting 验证分子量约为 21kDa、15kDa、20.5kDa、29kDa、34.3kDa,重组蛋白 EgG1Y162-2、EgG1Y162、CTLA-4IgV-EgG1Y162-2、CTLA-4IgV-EgG1Y162 利用 CE 病人/正常人血清鉴定,特异性依次为 0、85.7%、88.9%,100%;5)针对各重组蛋白（EgG1Y162-2、EgG1Y162、CTLA-4IgV-EgG1Y162-2、CTLA-4IgV-EgG1Y162）,分别采用咪唑浓度（200mM、20mM、200/300mM、200/300mM）进行纯化时,可以达到较好的效果。对重组蛋白进行大量纯化,浓缩后均得到5mg蛋白;6)通过生物信息学预测,在重组蛋白的N端插入CTLA-4IgV并不影响其后EgG1Y162/EgG1Y162-2蛋白的正确表达及抗原表位所在区域。结论:成功克隆出新疆绵羊CTLA-4IgV、囊型包虫原头蚴EgG1

关键词：细粒棘球蚴 CTLA-4IgV-EgG1Y162抗原蛋白表达纯化表位分析

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