检索结果-内蒙古大学图书馆

生物技术通报 2020年第12期36卷 75-81页

作者：徐洲范晨龙丁燏广东海洋大学水产学院湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室湛江524088 广东省水产经济动物病害控制重点实验室湛江524088

旨为构建溶藻弧菌HY9901 PepA蛋白的原核表达载体、优化其表达条件,并分析该蛋白是否存在乙酰化调控。首先设计特异性引物经PCR克隆pepA基因,构建表达载体pET-28a-PepA并将其转入大肠杆菌BL21(DE3),然后用SDS-PAGE和Western blot分析蛋... 详细信息

旨为构建溶藻弧菌HY9901 PepA蛋白的原核表达载体、优化其表达条件,并分析该蛋白是否存在乙酰化调控。首先设计特异性引物经PCR克隆pepA基因,构建表达载体pET-28a-PepA并将其转入大肠杆菌BL21(DE3),然后用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达及乙酰化情况。结果显示,表达菌株可以正确表达重组蛋白(60.7 kD),其最佳表达条件为:体积分数为0.1%的IPTG,37℃诱导5 h;Western blot结果表明,PepA蛋白是乙酰化蛋白,且在体外不存在去乙酰化。

关键词：溶藻弧菌 PepA蛋白表达条件优化乙酰化

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Klenow(exo-)的表达、活性测定及其在焦磷酸测序中的应用

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药物生物技术 2016年第3期23卷 201-207页

作者：蒋宗英邹秉杰刘云龙宋沁馨周国华中国药科大学生命科学与技术学院江苏南京210009 南京大学医学部附属金陵医院药理科江苏南京210002 中国药科大学药物分析教研室江苏南京210009

野生的Klenow聚合酶具有3'-5'外切酶活性,会对引物进行切割而造成焦磷酸测序产生错误的延伸信号。为了制备缺失3'外切酶活性的Klenow聚合酶用于焦磷酸测序反应,该研究全合成了外切酶活性缺失突变的Klenow酶基因编码序列,将... 详细信息

野生的Klenow聚合酶具有3'-5'外切酶活性,会对引物进行切割而造成焦磷酸测序产生错误的延伸信号。为了制备缺失3'外切酶活性的Klenow聚合酶用于焦磷酸测序反应,该研究全合成了外切酶活性缺失突变的Klenow酶基因编码序列,将其插入到表达载体p ET28a(+)中构建重组质粒,并转化到大肠杆菌中,表达外切酶活性缺失的Klenow酶(Klenow(exo-))。通过优化诱导温度、诱导时间与诱导剂浓度,得到了Klenow(exo-)的最佳表达条件为30℃时诱导表达5 h且IPTG浓度为0.1 mmol/L。利用Ni+柱亲和层析法纯化得到了相对分子质量约为67 000的重组Klenow(exo-)酶,并建立了基于生物发光的酶活测定方法,最终将其用于焦磷酸测序反应。结果表明,制备的重组酶具有良好的聚合酶活性但缺失了3'外切酶活性,可成功测定DNA待测模板序列,为焦磷酸测序技术提供了一个有效的关键酶。

关键词： Klenow酶.夕h切酶活性焦磷酸测序重组表达表达条件优化 Ni+柱亲和层析法生物发光

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谷氨酸棒杆菌表达大肠杆菌来源海藻糖酶

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食品研究与开发 2022年第24期43卷 181-187页

作者：满在伟崔慧慧李锦张迎阳张建波张建涛常州大学生物与食品工程学院江苏常州213164 山东恒仁工贸有限公司山东枣庄277533

对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum,***)表达大肠杆菌(Escherichia coli,***)来源海藻糖酶进行研究。构建重组***菌株Cgtrl表达*** BL21来源海藻糖酶。菌株Cgtrl海藻糖酶最适表达条件:诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isoprop... 详细信息

对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum,***)表达大肠杆菌(Escherichia coli,***)来源海藻糖酶进行研究。构建重组***菌株Cgtrl表达*** BL21来源海藻糖酶。菌株Cgtrl海藻糖酶最适表达条件:诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)添加量为0.5 mmol/L,诱导温度为22℃,诱导时间为12 h。在最适表达条件下重组海藻糖酶酶活为9.1 U/mL。重组海藻糖酶酶学性质研究表明,未经纯化的重组海藻糖酶具有较好的底物特异性能,专一性水解海藻糖,海藻糖水解率在96%以上,低温条件下稳定性较好,能够长时间低温保存,最适作用温度为45℃,最适作用pH值为6.6。

关键词：谷氨酸棒杆菌大肠杆菌海藻糖酶表达条件优化酶学性质

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几丁质裂解性多糖单加氧酶的表达及应用研究

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中国酿造 2022年第8期41卷 97-104页

作者：徐倩倩马春桐姚莹莹徐伟周秀玲张扬聊城大学生命科学学院山东聊城252059

以具有几丁质降解能力菌株Chitiniphilus sp. LY72的裂解多糖单加氧酶(Cs LPMO)为研究对象,在克隆Cs LPMO全长基因的基础上对其进行生物信息学分析,利用3种表达质粒p ET-22b、pET-28a和pCold,构建Cs LPMO异源表达菌株EBL-22、EBL-28和EB... 详细信息

以具有几丁质降解能力菌株Chitiniphilus sp. LY72的裂解多糖单加氧酶(Cs LPMO)为研究对象,在克隆Cs LPMO全长基因的基础上对其进行生物信息学分析,利用3种表达质粒p ET-22b、pET-28a和pCold,构建Cs LPMO异源表达菌株EBL-22、EBL-28和EBL-Co。重组Cs LPMO蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,筛选最佳表达质粒,对其表达条件进行优化。结果表明,Cs LPMO是一种裂解性多糖单加氧酶,隶属于AA10家族。3株重组菌中,纯化重组酶蛋白相对含量分别为5.9%、4.1%、5.4%,比酶活力分别为155.42 U/mg、80.26 U/mg、148.29 U/mg,因此,确定最佳质粒为pET-22b,菌株EBL-22表达条件为:OD600 nm值至0.4时,添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.4 mmol/L后,在25℃下诱导表达16 h。在优化条件下,其可溶性蛋白含量为928.32 mg/L,比酶活力为3.34 U/m L。Cs LPMO的加入可使还原糖的产量提高1.67倍。

关键词：几丁质裂解性多糖单加氧酶蛋白质表达表达条件优化

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鼠抗人DCP单克隆抗体的类型转换与表达

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2024年第3期45卷 72-81页

作者：廖凯张智萍丁笠张新跃扬州大学生物科学与技术学院江苏扬州225009

为建立抗体类型转换和表达体系,以最新制备的1株IgM类抗体——鼠抗人DCP单克隆抗体7C2为研究对象,首先从7C2杂交瘤细胞中克隆IgM轻重链可变区,再将IgM可变区序列与鼠IgG1恒定区序列融合克隆至真核表达载体,并转入293细胞系中。利用蛋白... 详细信息

为建立抗体类型转换和表达体系,以最新制备的1株IgM类抗体——鼠抗人DCP单克隆抗体7C2为研究对象,首先从7C2杂交瘤细胞中克隆IgM轻重链可变区,再将IgM可变区序列与鼠IgG1恒定区序列融合克隆至真核表达载体,并转入293细胞系中。利用蛋白质免疫印迹技术,成功检测到IgG1抗体在细胞内的表达并分泌至培养上清。在进一步优化密码子、宿主细胞和信号肽等影响抗体表达的因素后,建立了双质粒瞬转和基于双顺反子表达方式的稳转表达体系,可用于将鼠源IgM类抗体转换为IgG类抗体并进行表达。该研究为拓展非IgG类抗体的应用范围提供重要途径,同时为提高重组抗体在真核体系中的表达效率提供参考。

关键词：单克隆抗体基因工程抗体类型转换表达条件优化

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蜡状芽孢杆菌CZ亮氨酸氨肽酶的克隆表达与分离纯化

蜡状芽孢杆菌CZ亮氨酸氨肽酶的克隆表达与分离纯化

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作者：李慧华南理工大学

学位级别：硕士

经济的发展,人民的物质文化需求也日益增长。尤其对食品的需求从吃饱过渡到要求品质,这增加了对安全有效的食品添加剂的需求。蛋白质经水解游离出小肽及氨基酸片段,使其热稳定性、溶解性及营养性都得到明显提高,是当今食品加工市场的重... 详细信息

经济的发展,人民的物质文化需求也日益增长。尤其对食品的需求从吃饱过渡到要求品质,这增加了对安全有效的食品添加剂的需求。蛋白质经水解游离出小肽及氨基酸片段,使其热稳定性、溶解性及营养性都得到明显提高,是当今食品加工市场的重要原料。氨肽酶是一种可以有效切除蛋白末端氨基酸残基的外肽酶,从而可以脱除蛋白水解液的苦味。因此,对氨肽酶进行研究,将对整个食品加工行业及人们的高品质生活发挥重要意义。本论文旨在利用两个不同的表达载体,分别转化三个不同的表达宿主,探究最适合亮氨酸氨肽酶异源表达的载体与宿主。本论文通过比对蜡状芽孢杆菌CZ的16SrRNA,设计引物扩增出了其亮氨酸氨肽酶全长基因CZ-lap,成功构建了重组克隆载体pMD18-T-LAP和两个重组表达载体pEASY-E2-LAP及pET22b-LAP,成功获得五株重组表达菌株pEASY-E2-LAP-BL21(pEASY-B)、pEASY-E2-LAP-OrigamiTM(pEASY-O)、pEASY-E2-LAP-Rosetta(pEASY-R)和pET22b-LAP-BL21(pET22b-B)、pET22b-LAPOrigamiTM(pET22b-O),其中pEASY-O、pET22b-B及pET22b-O三株表达菌株异源表达并检测到酶活。因氨肽酶是金属酶,故对其进行了金属离子激活作用研究,结果表明0.5 mM的Ni2+对pEASY-O菌株的激活作用最好,高达14.5倍。又对该菌株进行了表达条件优化的初步研究,结果表明,在菌体OD为1.0-1.2之间加入IPTG诱导表达,在28℃诱导4 h,表达效果最好,酶活可达22.40 U/mL。最后,为了探索蜡状芽孢杆菌CZ中含有几种亮氨酸氨肽酶,对其进行了分离纯化。分别使用硫酸铵沉淀、Sephadex G50凝胶层析进行了初步纯化,利用HiTrapCapto DEAE阴离子交换层析和Phenyl Fast Flow进行了中度纯化,利用Phenyl HP疏水层析进行了精细纯化。每一步之后的SDS-PAGE蛋白胶都清晰看到蛋白总条带的减少。最终亮氨酸氨肽酶的纯化度达到93.56倍。

关键词：亮氨酸氨肽酶蜡状芽孢杆菌表达条件优化分离纯化

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东亚钳蝎抗神经兴奋肽表达、纯化及部分性质

东亚钳蝎抗神经兴奋肽表达、纯化及部分性质

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作者：惠长野沈阳药科大学

学位级别：硕士

对东亚钳蝎抗神经兴奋肽(ANEP)同源性分析表明：ANEP与蝎昆虫抑制性神经毒素高度同源，ANEP应属于这一家庭，它们都作用于钠离子通道，是钠离子通道抑制剂。蛋白质同源建模软件WHAT—IF对ANEP三维结构及二硫键进行预测，ANEP空间结构与... 详细信息

对东亚钳蝎抗神经兴奋肽(ANEP)同源性分析表明：ANEP与蝎昆虫抑制性神经毒素高度同源，ANEP应属于这一家庭，它们都作用于钠离子通道，是钠离子通道抑制剂。蛋白质同源建模软件WHAT—IF对ANEP三维结构及二硫键进行预测，ANEP空间结构与大部分长链蝎神经毒素相似，二硫键的配对高度保守，由一段a螺旋和三段反平行的β片层构成一个紧密的结构核心，三段反平行的β片层形成一个强疏水面，而C端为无规则卷曲，肽链相对比较延伸。ANEP在大肠杆菌内单独表达二硫键不能形成，多肽以包涵体形式存在于胞浆，将编码序列插入pSYPU-1b，营造胞质氧化环境，该多肽得到了高效可溶性表达。利用His tag对重组多肽进行一步镍柱亲合层析，在非变性、变性条件下，通过改变pH及氯化铵等洗脱条件，可得到电泳纯样品。结合多肽空间结构考察了纯化标签在肽链不同末端的纯化效果，表明空间结构对His tag的屏蔽效应显著影响纯化结果，ANEP在C端融合His tag纯化效果最佳，通过优化纯化条件，ANEP一步镍柱可达到电泳纯，每升发酵液可得目的多肽3mg，而N端融合时收率为0.8mg／L。对于用IPTG、乳糖诱导的由T7 lacUV5启动子控制的重组目的产物的表达规律进行了研究。借助SDS-PAGE分析目的多肽表达量并结合菌体生长状况，比较了诱导的起始阶段、所需的诱导物浓度、诱导持续时间等参数对重组产物表达的影响，确立了两种诱导剂的最佳发酵条件。并考察了葡萄糖抑制效应对乳糖诱导作用的影响，葡萄糖抑制效应对本实验所用质粒影响非常显著，只有在对数生长中后期加入乳糖才可以看到目的蛋白的微量表达，而IPTG的诱导效果不受葡萄糖影响。考察本实验重组质粒稳定性表明，该质粒稳定性较好，重组菌较空宿主菌相比并无生长劣势，培养重组菌每12小时转接一次，在有抗性选择性压力情况下，转接20次质粒突变率为0.317‰，多次传代后蛋白表达量并没有明显变化，满足大规模发酵用重组质粒要求。

关键词：抗神经兴奋肽分离纯化表达条件优化

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阿尔茨海默症治疗型单链抗体的构建、表达优化与体内外活性研究

阿尔茨海默症治疗型单链抗体的构建、表达优化与体内外活性研究

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作者：匡宇竹吉林农业大学

学位级别：硕士

阿尔茨海默症(Alzheimer disease,AD),俗称老年性痴呆,是一种神经退行性疾病,是导致痴呆症的主要原因。其主要临床表现为记忆减退、思维能力下降以及行为异常。由于AD的致病因素复杂,目前尚无药物能够治愈该疾病或者逆转该疾病进程。因... 详细信息

阿尔茨海默症(Alzheimer disease,AD),俗称老年性痴呆,是一种神经退行性疾病,是导致痴呆症的主要原因。其主要临床表现为记忆减退、思维能力下降以及行为异常。由于AD的致病因素复杂,目前尚无药物能够治愈该疾病或者逆转该疾病进程。因此,AD仍是当今及未来人类所面临的最大的全球公共健康和社会保健的挑战之一。AD患者尸检结果发现,β淀粉样蛋白(Amyloid-β,Aβ)聚积形成的斑块、高度磷酸化的微管结合蛋白聚集形成神经元纤维缠结(Neurofibroustackles,NFT)和神经元的丢失是AD的特征性病理改变。目前,研究者普遍认为Aβ是AD的主要致病物质。因此,通过AD被动免疫疗法,向患者体内注射Aβ特异性抗体,促进患者脑中Aβ的清除是目前最具潜力的AD免疫治疗策略。目前AD治疗性抗体的研究已经取得了一定的进展。2021年6月,Biogen研发的阿杜卡奴单抗(Aducanumab,商品名Aduhelm)获得FDA批准上市,用于治疗阿尔茨海默症源性轻度认知障碍(MCI)及轻度AD。这是过去18年来FDA批准的首个AD治疗新药,极大的鼓舞了AD治疗领域的研究者。但这类药物的应用依旧存在一些问题,如全抗体分子量大,血脑屏障透过率低,限制了其治疗效果;而全抗体的Fc段,在脑中易引起免疫细胞激活,引起炎症反应等。单链抗体(single chain fragment variable,scFv),是一种基因工程抗体,只含有抗体重链以及轻链的可变区。由于其相对分子质量较小,相比于全抗体,能够更好地透过血脑屏障,与致病性Aβ结合。此外,scFv不含Fc段,不易引起非感染性脑炎,在AD的治疗领域有着独特的优势。本研究在两种AD治疗性抗体(Aducanumab、Gantenerumab)的基础上,对其进行改造,构建能够识别Aβ寡聚体与原纤维的单链抗体Aducanumab-scFv和Gantenerumab-scFv。我们利用大肠杆菌表达系统对两种单链抗体进行了表达,并对其表达条件进行了优化,确定其最佳培养的条件,在其最佳培养条件下进行大量的表达,并利用镍柱亲和层析法对其进行纯化。在获得两种高纯度单链抗体后,我们利用ELISA法、MTT法对两种单链抗体的体外活性进行检测,此外,我们利用免疫组化法以及抗体注射对两种单链抗体的体内活性进行了检测。结果显示,两种单链抗体能与Aβ寡聚体有效结合,对Aβ寡聚体产生的细胞毒性能够起到很好的抑制作用;此外,两种单链抗体能够与AD模型鼠脑内的Aβ斑块沉积结合,显示出了优秀的治疗潜力。综上所述,我们成功的制备了两种AD治疗型单链抗体,该抗体具有较好的生物学活性,为AD的免疫治疗提供了新思路。

关键词：阿尔茨海默症 β淀粉样蛋白单链抗体表达条件优化免疫治疗

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一个灰葡萄孢菌拮抗基因的生物信息学分析、克隆及表达

一个灰葡萄孢菌拮抗基因的生物信息学分析、克隆及表达

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作者：李凤霞山东理工大学

学位级别：硕士

番茄灰霉病是一种重要的植物病害,由半知菌亚门灰葡萄孢属(Botrytis cinerea)真菌引起。近年来人们通过大量筛选并加以改良利用抗灰霉病的生防菌,使生物防治技术日益成为控制灰霉病的一条重要而且有效的途径。通过宏基因组技术可以大大... 详细信息

番茄灰霉病是一种重要的植物病害,由半知菌亚门灰葡萄孢属(Botrytis cinerea)真菌引起。近年来人们通过大量筛选并加以改良利用抗灰霉病的生防菌,使生物防治技术日益成为控制灰霉病的一条重要而且有效的途径。通过宏基因组技术可以大大提高生防基因的筛选范围,进而对拮抗基因及其蛋白的拮抗机理进行深入研究。本研究在刘舒等人构建的番茄灰霉病病株根际土壤宏基因组文库的基础上,探讨文库中拮抗活性很强的9“克隆子对Botrytis cinerea的拮抗机理。本研究首先对9“克隆子的稳定遗传性进行了检测,经过传代培养10次后,9#克隆子对Botrytis cinerea仍然具有较强的拮抗活性,说明9#克隆子的拮抗性能够稳定遗传。通过提取9#克隆子重组pBluescript II KS+质粒DNA,经PstI和HindⅢ双酶切检测和测序后,证明重组质粒上插入了一段大小2215bp的外源DNA。结合生物信息学工具和软件,对该外源DNA序列进行分析,主要包括DNA序列同源性比对,最大开放阅读框(ORF)的查找,编码蛋白序列的同源性及蛋白的一二三级结构分析。结果表明,该序列在Genebank中进行blastn比对,同源性很低,只有4%,推测可能是新拮抗基因；该序列含有一个612bp的最大ORF,编码一个小分子量疏水性脂溶蛋白,分子量为22.2kDa,与AMP核苷酶序列的同源性较高；模体搜索表明该序列含有5个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和3个N-豆蔻酰化位点,推测该基因可能在拮抗灰葡萄孢菌过程的信号转导中发挥重要作用。为了进一步验证该序列表达产物对Botrytis cinerea的拮抗性,即该序列的最大ORF能否成功表达。以重组pBluescript II KS+质粒DNA为模板,用引物PST-F和HIND-R进行PCR,扩增出外源DNA片段,然后以外源DNA片段为模板,在最大ORF两端设计引物EcoRI-F和SalI-R,经PCR扩增出最大ORF,与pET-32a(+)构建重组表达载体,转化感受态*** BL21(DE3)并用IPTG诱导表达,得到相对分子量约为42kDa的融合蛋白,理论推测值与实际表达值相符合。通过对重组菌诱导表达条件的优化,获得了融合蛋白的高效表达条件：在37℃下,50mL LB液体培养基(300mL锥形瓶)中,振荡培养8h获得种子液,种子液按照1：100的比例接种于LB液体培养基(含100μg/mL Amp),37℃下振荡培养3.5h, IPTG诱导4h,获得较高的目的融合蛋白表达量。

关键词： 9~#克隆子灰葡萄孢菌生物信息学分析原核表达表达条件优化

来源：评论

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牛朊蛋白3个单氨基酸变异体的原核表达及其包涵体蛋白的变性与复性

牛朊蛋白3个单氨基酸变异体的原核表达及其包涵体蛋白的变性与复性

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作者：陈建华甘肃农业大学

学位级别：硕士

【目的】本研究拟以牛朊蛋白正常基因和其含单个氨基酸突变的3 个变异体基因克隆为实验材料,构建牛朊蛋白基因重组表达质粒pGEX-BoPrP(93～241)、pGEX-BoPrP(93～241)(S154N)、pGEX-BoPrP(93～241)(A129V)和pGEX-BoPrP(93～241)(Q234R)及其各原核表达重组菌,以获得4 种有活性的牛重组朊蛋白,进而为牛朊蛋白基因突变与其蛋白结构和性质变化关系的研究提供实验材料。【方法】应用DNA 重组技术,正确地构建牛朊蛋白基因的1 个正常重组朊蛋白和3 个单氨基酸变异体的原核表达载体,经转化*** BL21 (DE3),以获得重组菌*** GST-BoPrP (93～241)、GST-BoPrP(93～241)(S154N)、GST-BoPrP(93～241)(A129V)和GST-BoPrP(93～241)(Q234R),在诱导表达优化条件下诱导各重组菌进行表达,裂菌后对所产生的不溶性包涵体用0.1%温和去污剂Triton X-100 和中低浓度尿素进行洗涤提纯,包涵体提纯物经8 mol/L尿素处理,使其溶解变性后对包涵体裂解产物进行透析复性,并对GST-BoPrP(93～241)(Q234R)复性产物进行GSTrap FF 柱层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting 观察其提纯和复性效果。【结果】成功构建了重组菌*** GST-BoPrP(93～241)、GST-BoPrP(93～241)(S154N)、GST-BoPrP(93～241)(A129V)和GST-BoPrP(93～241)(Q234R),分别可表达预期分子质量约为42.4 ku的与单抗4C11 发生反应的融合蛋白;在37℃以1 mmol/L IPTG诱导表达6 h的优化条件下,各重组菌可产生表达量占细菌总蛋白量30%～45%的目的蛋白;各重组菌诱导表达后所产生的目的蛋白以包涵体的形式存在于菌体内;裂菌后提纯目的包涵体蛋白,经尿素变性处理和透析复性,获得分子质量约为42.4 ku的与单抗4C11 发生反应的融合蛋白,复性产物具有较高纯度;GST-BoPrP(93～241)(Q234R)复性产物经GSTrap FF 柱层析纯化后,可获分子质量约为42.4 ku 的目的蛋白并具有良好的免疫反应性;对比复性产物与纯化产物,发现GSTrap FF 柱层析可除去复性产物中分子质量约为31～40 ku间的杂蛋白,但出现了分子质量约为26 ku的条带,表明GSTrap FF 柱层析可获得高纯度的目的蛋白。

关键词：牛朊蛋白单氨基酸变异体原核细胞表达表达条件优化包涵体变性复性纯化

来源：评论

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