检索结果-内蒙古大学图书馆

动物医学进展 2014年第3期35卷 6-10页

作者：温和心龙英全蒋荣华盘宝进贵港出入境检验检疫局广西贵港537100 灵长类国家重点实验室广西南宁530000

为了构建RNA病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)表达系统pET28a(+)-MS,将插入的外源基因诱导表达获得相应的RNA标准物质病毒样颗粒,将MS2噬菌体包膜蛋白和成熟蛋白基因插入表达质粒pET-28a(+),构建pET28a(+)-MS重组子,将带有包装位... 详细信息

为了构建RNA病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)表达系统pET28a(+)-MS,将插入的外源基因诱导表达获得相应的RNA标准物质病毒样颗粒,将MS2噬菌体包膜蛋白和成熟蛋白基因插入表达质粒pET-28a(+),构建pET28a(+)-MS重组子,将带有包装位点序列的外源RNA对应的cDNA插入成熟蛋白基因的下游,经过诱导表达含外源RNA病毒样颗粒。结果表明,pET28a(+)-MS能表达活性的包膜蛋白(49.8ku)和成熟蛋白(14.4ku),能将外源基因RNA包装成病毒样颗粒,该VLP长度约1 500bp,RT-PCR反应性优良,能耐受RNase的降解,在血清中37℃经1个月未有明显降解。

关键词： RNA标准物病毒样颗粒表达系统构建特性

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病毒样颗粒的常用表达系统和应用进展

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中国动物传染病学报 2017年第4期25卷 82-86页

作者：郭慧敏缪秋红谭永贵朱杰刘腾刘光清中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

病毒样颗粒是由病毒的结构蛋白组成,不含感染所必需的核酸成分,没有感染性和复制能力,但是可以同时引起细胞免疫和体液免疫。由于具有与亲本病毒相似的形态和结构的特点,病毒样颗粒受到研究者的极大关注。与其他病毒亚单位疫苗相比,病... 详细信息

病毒样颗粒是由病毒的结构蛋白组成,不含感染所必需的核酸成分,没有感染性和复制能力,但是可以同时引起细胞免疫和体液免疫。由于具有与亲本病毒相似的形态和结构的特点,病毒样颗粒受到研究者的极大关注。与其他病毒亚单位疫苗相比,病毒样颗粒具有安全高效的特点。本综述论述了病毒样颗粒的常用表达系统以及在生物制品方面的应用。

关键词：病毒样颗粒表达系统生物制品

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rDNA介导的解脂耶氏酵母整合表达系统的构建

rDNA介导的解脂耶氏酵母整合表达系统的构建

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作者：姜琼湖北大学

学位级别：硕士

本文根据Genebank中提交的序列设计引物,用PCR方法扩增了解脂耶氏酵母的三段rDNA、三种启动子pXPR2,pTEF、pRPS7以及终止子***产物克隆到PMD18-T载体,测序结果与Genebank中序列一致.同时,用PCR方法从啤酒酵母中克隆了蔗糖转换酶基因SUC2... 详细信息

本文根据Genebank中提交的序列设计引物,用PCR方法扩增了解脂耶氏酵母的三段rDNA、三种启动子pXPR2,pTEF、pRPS7以及终止子***产物克隆到PMD18-T载体,测序结果与Genebank中序列一致.同时,用PCR方法从啤酒酵母中克隆了蔗糖转换酶基因SUC2,并构建了以SUC2基因为选择标记的rDNA介导的解脂耶氏酵母整合表达载体pHBM552+T52.此载体用Tth111I线形化后转化了解脂耶氏酵母菌株2.1502.转化子用PCR方法进行了鉴定,结果正确.构建了包含甘露聚糖酶基因表达单元的解脂耶氏酵母整合表达载体,转化解脂耶氏酵母菌株2.1502,带pRPS7启动子的载体得到的转化子在LBS平板上检测到了甘露聚糖酶活性.而在pXPR2启动子指导下的甘露聚糖酶基因在诱导平板上未能检测到表达.用带啤酒酵母α因子信号肽序列的黑曲霉植酸酶基因置换甘露聚糖酶基因使其置于pRPS7启动子指导下的,并转化解脂耶氏酵母,转化子在添加植酸钙的YPD平板上检测到了植酸酶活性.为了提高载体的稳定性,我们置换了载体上作为整合位点的rDNA,并将载体上的大肠杆菌复制起始位点和氨苄青霉素抗性基因插入到rDNA中间.在转化酵母之前将大肠杆菌复制起始位点和氨苄青霉素抗性基因切除,剩余的片段纯化后转化解脂耶氏酵母.通过这种方法得到了转化子稳定性大大提高了的整合载体.为了提高蛋白质的表达水平,我们构建了一系列基于pXPR2的上游激活序列(UAS)的串联重复和pTEF以及pRPS7启动子的TATA box和ATG的杂合启动子.

关键词：表达系统解脂耶氏酵母 rDNA SUC2基因

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蓝藻热休克诱导高效表达系统的构建

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高技术通讯 2001年第8期11卷 17-21页

作者：章军秦燕欧阳青徐虹黄澜刘仁海周克夫楼士林厦门大学生命科学学院细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室厦门361005

以聚球藻Synechococcussp .PCC794 2作为基因工程受体菌 ,构建了热休克诱导的高效表达系统。用PCR法扩增并克隆出Synechococcussp .PCC794 2自身的热休克基因 groESL操纵子的强启动区 (2 4 0bp) ,并紧靠其后组装上泛素 (UB)融合的胸腺素... 详细信息

以聚球藻Synechococcussp .PCC794 2作为基因工程受体菌 ,构建了热休克诱导的高效表达系统。用PCR法扩增并克隆出Synechococcussp .PCC794 2自身的热休克基因 groESL操纵子的强启动区 (2 4 0bp) ,并紧靠其后组装上泛素 (UB)融合的胸腺素α1(Tα1)目的基因 ,在下游组装有rbcSpolyA终止子。此外 ,还组装了一个完整的卡那霉素抗性基因作为筛选标记基因。这样 ,就构建了完整的蓝藻的基因表达系统。经转化蓝藻Synechococcussp .PCC794 2细胞 ,在 4 2℃热诱导 30min后 ,目的基因UB Tα1得到较高水平表达 ,表达量约占可溶性蛋白的 8.7%

关键词：蓝藻热休克诱导基因表达基因工程表达系统卡那霉素抗性基因

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双歧杆菌表达系统的研究进展

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天然产物研究与开发 2010年第5期22卷 914-918页

作者：崔佳万翠香曾明魏华南昌大学食品科学与技术国家重点实验室南昌330047 中国药品生物制品检定所北京100050

双歧杆菌作为表达外源基因的宿主备受关注,成为近年来研究的热点。本文从双歧杆菌表达系统的组成、外源蛋白的表达等角度综述了近期的研究成果,对该系统在口服疫苗和抗肿瘤方面的研究及应用前景进行了展望。

关键词：双歧杆菌表达系统外源蛋白

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新型枯草杆菌基因敲除和表达系统的构建与纳豆激酶基因的克隆

新型枯草杆菌基因敲除和表达系统的构建与纳豆激酶基因的克隆

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作者：李智沈阳农业大学

学位级别：硕士

纳豆激酶(Nattokinase,NK)是一种早在1987年就由日本的Sumi H科学家在纳豆中发现的碱性丝氨酸蛋白酶,而纳豆是由枯草芽孢杆菌发酵而成的,该产品被誉为“超级健康食品”,是21世纪受众人追捧的营养健康食品。该产品在食品及医药领域的价... 详细信息

纳豆激酶(Nattokinase,NK)是一种早在1987年就由日本的Sumi H科学家在纳豆中发现的碱性丝氨酸蛋白酶,而纳豆是由枯草芽孢杆菌发酵而成的,该产品被誉为“超级健康食品”,是21世纪受众人追捧的营养健康食品。该产品在食品及医药领域的价值极为突出。纳豆激酶对缓解心脑血管类病症,降低血粘度,降血压,降血脂,预防骨质疏松及糖尿病,及对木制纤维和皮毛的降纤作用等方面都有非常显著的效果。为此,针对其进行进一步探索研究,对保健类药物及保健食品的开发具有重要意义。但是目前就我们所知,尽管一直以来它的作用功效一直被大众所追捧,但是在表达水平上仍然有待进一步提高,在底物特异性和活性等方向上也需要进一步优化。本研究采用缺失蛋白酶的WB800枯草芽孢杆菌菌株作为表达菌株,进行纳豆激酶的克隆和表达。该菌株能有效的缓解了以往枯草芽孢杆菌菌株表达产物易于被蛋白酶降解的不足。为了实现纳豆激酶基因在枯草芽孢杆菌基因组中的融合表达,本研究还成功的构建了Knock plasmidnew质粒载体,该载体可以同时满足枯草芽孢杆菌中基因敲入和敲除的需要。利用该质粒通过线性化DNA的胞内同源重组,可有效避免以往基因敲入敲除过程中需要反复构建质粒的复杂操作,可以使操作步骤更加简便化。另外,现有的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒只能够在大肠杆菌中进行复制,然后再在枯草芽孢杆菌中进行表达。但是在构建随机突变库进行高通量筛选的过程中,这一穿梭系统显然效率很低。如果能够在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中同时进行表达,则可以显著减少工作量,而且对酶的定向进化和蛋白突变库的筛选尤为重要。因此,本研究中我们致力于双表达质粒载体pSHUTTLE-1-NATTO的构建工作。该质粒具有大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的复制子,并设计了分别能在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中作用的启动子。此外,对质粒中核糖体识别位点(RBS)进行了改造,使得该RBS兼具大肠杆菌和枯草芽孢杆菌RBS的基本特征。基于以上特点,新构建的重组质粒可能实现在两个菌中都能够蛋白表达。同时,本文还针对纳豆激酶进行了生物信息学分析。上述研究,为纳豆激酶的基因的高效表达,分子定向改造和深入研究奠定了基础。此外,我们对现有的枯草芽孢杆菌基因提取方法进行了改进,建立起了一种更加简便,快速,高效的方法。为了检测该方法的使用范围,我们还将该方法应用于菠菜、鱼和其它微生物总DNA的提取,发现该方法同样有效。所提取的DNA具有产量高、品质好、无污染等优点,而且提取速度和简便程度显著优于以往的其它方法。据了解,目前还没有植物、动物和微生物细胞DNA提取的通用方法,因此本方法的建立不仅为本研究奠定了基础,也为相关研究提供了有益的参考。

关键词：纳豆激酶枯草芽孢杆菌表达系统基因敲除

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毕赤酵母表达系统研究进展

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中国生物工程杂志 2002年第6期22卷 45-47页

作者：齐连权陈薇来大志于长明王海涛军事医学科学院微生物学流行病学研究所北京100071

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。该表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题 ,也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题 ;并能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键... 详细信息

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。该表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题 ,也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题 ;并能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等过程的翻译后蛋白加工。至今已有多种外源蛋白在该表达系统中成功表达。下面对毕赤酵母表达系统的特点及研究进展作一简要综述。

关键词：毕赤酵母表达系统研究进展

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汉森酵母表达系统构建及血管生成抑制素表达

汉森酵母表达系统构建及血管生成抑制素表达

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作者：许奕阳中山大学

学位级别：硕士

该论文应用PCR技术从MOX完整基因上克隆到MOX的启动子和终止序列,经核苷酸序列鉴定正确,重组进质粒pSp72获得重组质粒pSM13.将来源于汉森酵母的HpLeu2基因插入到pSM13中构建了含有MOX表达盒的整合型汉森酵母载体pSML12.另外,将MOX启动... 详细信息

该论文应用PCR技术从MOX完整基因上克隆到MOX的启动子和终止序列,经核苷酸序列鉴定正确,重组进质粒pSp72获得重组质粒pSM13.将来源于汉森酵母的HpLeu2基因插入到pSM13中构建了含有MOX表达盒的整合型汉森酵母载体pSML12.另外,将MOX启动子和终止子从pSM13上切下,插入到含Scleu2基因的酿酒酵母载体YEplac181中构建含MOX表达盒的自主复制型汉森酵母载体YRpM7.为了对整合型载体pSM12和自主复制型载体YRpM7在汉森酵母中表达外源基因的能力进行考察,将黑曲霉葡萄糖淀粉酶(GAI)cDNA分别引入两载体中,得到含GAI基因的表达载体pSMG1和YRpMG72;经转化汉森酵母A16(leu)通过对所形成的淀粉水解圈的观察以及对表达产物的酶活测定,证实GAI基因在两个载体中均获得了表达,说明构建的两种表达载体均具有在汉森酵母表达外源基因的能力.该论文将hAGN cDNA分别引入上述的整合型载体pSML12和自主复制型载体YRpM7中,构建了整合型hAGN表达载体pSMA17和自主复制型表达载体YRpMA19,分别转化汉森酵母A16(leu)后,对转化菌株进行诱导表达.通过对发酵上清进行的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和酶联免疫吸附反应(ELISA)鉴定,证实hGAN在两个载体中均获得了表达,表达产物在MF-α1信号肽的引导下可分泌到胞外培养基中.

关键词：汉森酵母表达系统血管生成抑制素

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不同RNA沉默抑制子对马铃薯X病毒载体表达系统的作用研究

不同RNA沉默抑制子对马铃薯X病毒载体表达系统的作用研究

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作者：董洁宁夏大学

学位级别：硕士

植物RNA病毒载体表达体系是在植物中生产外源蛋白的一种有潜力的平台，病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)是目前此类表达系统表达量普遍偏低的根本原因。在植物和病毒长期的互作中，病毒可通过自身编码RNA沉默抑... 详细信息

植物RNA病毒载体表达体系是在植物中生产外源蛋白的一种有潜力的平台，病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)是目前此类表达系统表达量普遍偏低的根本原因。在植物和病毒长期的互作中，病毒可通过自身编码RNA沉默抑制因子(RNA silencingsuppressors，RSSs)来抑制VIGS反应，因而认为RSSs具有提高外源基因在植物中表达水平的作用。但是不同RSSs的作用效果以及不同类型RSSs组合是否具有协同作用等问题尚无明确的答案。此外，马铃薯X病毒(Potato Virus X，PVX)表达载体PVXdt是一种生物安全性、表达量和应用潜力高的新型病毒表达载体，为其寻找适合的“RSSs伴侣”具有重要的现实意义。基于此，我们构建了7种类型8个植物病毒编码的RNA沉默抑制子表达载体，利用农杆菌渗滤技术与PVXdt病毒表达载体共接种寄主植物本氏烟草(Nicotiana benthamiana)，通过对病毒载体表达的报告基因绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的定性和定量分析，期望在探讨上述问题的同时，也为PVXdt寻找到合适的RSSs伴侣。\n 通过Time Course实验证明与PVXdt共接种后的第5天是寄主基因沉默与RSSs反沉默相互作用的起始时间，也是RSSs作用效果评价时间。RSSs与PVXdt共表达实验结果表明，RSSs对共接种病毒载体PVXdt介导的外源蛋白表达确实有增效作用，这种增效作用是通过RSSs抑制寄主基因沉默来实现的；不同RSSs的增效作用强弱和作用持续时间长短显著不同，TBSV-P19的增效作用最强(最高7倍左右)且持续时间最长(25天)，而ACMV-AC2和RYMVTEV-P1几乎无增效作用；确定TBSV-P19是PVXdt病毒表达载体的一个合适的RSSs伴侣。RSSs组合实验结果说明，部分组合样品确有协同作用。初步推测，作用机制相似的RSSs组合无协同作用，作用机制不同的部分RSSs组合能产生一定程度的协同作用。在上述研究结果的基础上我们还对RSSs伴侣选择的原则和RSSs组合协同作用进一步研究策略等问题做了深入讨论。\n 综上所述，本研究对目前RSSs研究中存在的部分问题进行了初步探索，也为PVXdt病毒载体寻找到了合适的RSSs伴侣TBSV-P19。研究结果对于深入了解RSSs作用效果，加深植物RNA病毒表达载体系统的了解和今后指导具有商品化和工业化生产前景的外源基因表达奠定坚实的理论基础。

关键词：马铃薯病毒载体表达系统基因沉默 RNA沉默抑制子

来源：评论

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红法夫酵母来源crtE、crtI、crtYB基因的克隆与表达系统构建

红法夫酵母来源crtE、crtI、crtYB基因的克隆与表达系统构建

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作者：盛枝泉云南大学

学位级别：硕士

β-胡萝卜素为类胡萝卜素之一,是橘黄色脂溶性物质。由于β-胡萝卜素良好的理化性质,β-胡萝卜素在食品、饲料、化妆品、医疗方面应用广泛,市场需求越来越旺盛,经济价值日益显著。β-胡萝卜素主要来源为化学合成和天然提取。天然提取的... 详细信息

β-胡萝卜素为类胡萝卜素之一,是橘黄色脂溶性物质。由于β-胡萝卜素良好的理化性质,β-胡萝卜素在食品、饲料、化妆品、医疗方面应用广泛,市场需求越来越旺盛,经济价值日益显著。β-胡萝卜素主要来源为化学合成和天然提取。天然提取的β-胡萝卜素安全性更高,应用更广泛。本文从红法夫酵母中扩增目的基因crtE、crtI、crtYB基因,将目的基因克隆进p426GPD中构建表达盒子GAP-crtE-CYCl、GAP-crtI-CYCl、GAP-crtYB-CYC1。之后进一步将表达盒子整合在pRS406表达载体中,构建最终表达载体。本实验实验结果是:将GAP-crtE-CYC1利用Kpnl和Clal双酶切,连接进入pRS406表达载体中,获得第一步表达载体pRS406-crtE载体。之后将pRS406-crtE用EcoRI酶切补平末端后和目的片段GAP-crtYB-CYCl平末端连接,获得pRS406-crtE-crtYB表达载体。之后利用Notl酶切平末端连接GAP-crtI-CYC1片段获得最终的pRS406-crtE-crtYB-crtl最终表达载体。

关键词：红法夫酵母 β-胡萝卜素表达系统克隆

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