检索结果-内蒙古大学图书馆

中国生物化学与分子生物学报 2015年第10期31卷 1017-1024页

作者：许姗赖俊忠陈骐福建师范大学南方生物医学研究中心福州350117

肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的具有自我更新、增殖、分化的部分细胞群,对肿瘤的发生、发展有十分重要的作用.肿瘤干细胞特异的表面分子及其异常活化的信号通路,是其区别于其他肿瘤细胞的特性.寻找和鉴定特异的肿瘤干细胞的表面标志物... 详细信息

肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的具有自我更新、增殖、分化的部分细胞群,对肿瘤的发生、发展有十分重要的作用.肿瘤干细胞特异的表面分子及其异常活化的信号通路,是其区别于其他肿瘤细胞的特性.寻找和鉴定特异的肿瘤干细胞的表面标志物,从而识别肿瘤组织中的肿瘤干细胞,并进行相关信号调控机制研究,是肿瘤早期诊断及肿瘤干细胞靶向治疗的关键.本文简要概述了肿瘤干细胞相关的表面标志物及信号通路的研究进展,旨在为进一步开展针对肿瘤干细胞的抗体靶向治疗提供新思路.

关键词：肿瘤干细胞表面标志物信号通路

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干细胞表面标志物在牙髓干细胞中的表达

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上海口腔医学 2015年第3期24卷 257-262页

作者：高丽江文欣牛晨光何智妍朱彩莲黄正蔚上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院牙体牙髓病科上海市口腔医学重点实验室上海200011

目的:探讨磁珠分选后培养的人牙髓干细胞的表面标记抗原随培养代数增加的变化情况。方法:改良组织块法培养的人牙髓细胞,至第2代(P2)时,用磁珠方法分选出STRO-1阳性细胞,用流式细胞术分别检测P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8代的干细胞表面... 详细信息

目的:探讨磁珠分选后培养的人牙髓干细胞的表面标记抗原随培养代数增加的变化情况。方法:改良组织块法培养的人牙髓细胞,至第2代(P2)时,用磁珠方法分选出STRO-1阳性细胞,用流式细胞术分别检测P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8代的干细胞表面标志物CD73、CD90、CD105、CD166、STRO-1。取P3代细胞,分别进行成骨诱导和成脂诱导。21 d后,分别行茜素红染色和油红O染色,观察矿化物形成情况和脂滴形成情况,同时以未诱导细胞为对照。结果:STRO-1在牙髓干细胞表面随代数增加而下降,CD73、CD90、CD105、CD166的表达比较稳定,茜素红染色可见矿化结节形成,油红O染色显示形成大量脂滴。结论:STRO-1在牙髓干细胞表面随代数增加而下降,其他干细胞标志物比较稳定。

关键词：牙髓干细胞磁珠分选间充质干细胞表面标志物

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肝癌干细胞表面标志物研究进展

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世界华人消化杂志 2016年第31期24卷 4231-4237页

作者：邢龙彬高英堂天津医科大学三中心临床学院天津市300170 天津市人工细胞重点实验室天津市肝胆疾病研究所天津市第三中心医院天津市300170

近年来有许多学者提出肿瘤干细胞理论,认为肿瘤是由少数肿瘤干细胞与大多数的普通肿瘤细胞组成,这让人们从新的角度去了解肝癌.肝癌干细胞(liver cancer stem cell,L C S C)的研究为肝癌的治愈提供新的希望,因而LCSC的分离鉴定显得尤为... 详细信息

近年来有许多学者提出肿瘤干细胞理论,认为肿瘤是由少数肿瘤干细胞与大多数的普通肿瘤细胞组成,这让人们从新的角度去了解肝癌.肝癌干细胞(liver cancer stem cell,L C S C)的研究为肝癌的治愈提供新的希望,因而LCSC的分离鉴定显得尤为重要;因为肿瘤干细胞的分离鉴定主要依据肿瘤干细胞标志物的表达,目前多种肿瘤干细胞标志物已被科学家证实,肝癌也不例外.所以本文主要阐述总结了7种LCSC的表面标志物的特点及对其临床意义.

关键词：肝癌肿瘤干细胞表面标志物

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中国HIV/AIDS患者NK细胞及其相关表面标志物研究

中国HIV/AIDS患者NK细胞及其相关表面标志物研究

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作者：姜拥军中国医科大学

学位级别：博士

目的天然免疫系统是机体抵御外来病原体的第一道防线，在此基础上衍生出十分复杂的获得性免疫反应。近二十年来研究者们一直致力于获得性免疫对HIV感染的免疫应答研究，但到目前在免疫治疗和疫苗方面尚无突破性进展。近来研究显示... 详细信息

目的天然免疫系统是机体抵御外来病原体的第一道防线，在此基础上衍生出十分复杂的获得性免疫反应。近二十年来研究者们一直致力于获得性免疫对HIV感染的免疫应答研究，但到目前在免疫治疗和疫苗方面尚无突破性进展。近来研究显示：天然免疫系统在抵御HIV感染中占有非常重要的地位。自然杀伤细胞(Natural killer cells，NK)是天然免疫中的重要细胞，其表达CD56抗原不表达T细胞受体复合物TCR;自然杀伤T细胞(Natural killer T cell，NKT)是近来发现的NK细胞群的另一个组成部分，具有NK细胞表面标志物CD56同时亦表达TCR分子。NK和NKT细胞与HIV感染的关系目前尚无明确研究结果，本文首次研究了中国HIV／AIDS患者NK、NKT细胞及相关标志物的表达，初步探讨NK细胞与HIV感染的关系。方法 1．研究对象由辽宁省疾病预防与控制中心、吉林省疾病预防与控制中心以及中国医科大学艾滋病研究所艾滋病确认实验室经WB试验确认为阳性的HIV／AIDS患者。HIV抗体阴性健康对照，来自健康体检门诊和实验室工作人员，血液系统及肝肾功能检查结果正常，无免疫系统疾病史。 2．淋巴细胞绝对值和比值测定将20ul IriTEST CD3FITC／CD56CD16PE／CD45PerCP或CD4FITC／CD8PE／CD3PerCP试剂加入绝对计数管中，经反向加样法加入50ul抗凝血，室温避光15min，加入免洗溶血素450ul，室温避光15min，FACS MULTISET软件检测并进行自动分析，计算细胞绝对值及相应比值等。以CD45 细胞为门，用CELLQUEST软件分析CD3‘/CD56CD16+/CD45+NKT细胞数及相应比值等。 3.细胞表面染色按照BD公司细胞表面染色说明书操作，应用FACSC亦bur流式细胞仪检测10万个细胞，CELLQUEST软件分析NK细胞上表面标志物的表达。 4.核酸提取应用全自动核酸分离纯化系统(MagNApureLC)和罗氏公司核酸提取试剂盒，提取病毒翩A或人白细胞DNA。 5.病毒载量测定采用RT一PCR方法，按照罗氏公司HIV病毒载量测定说明书进行操作。 ***扩增KIR3DLI和KIR3DSI基因用引物KIR3 DLI(Fo二盯d)CGCTGTGGTGCCTCGA和KIR3DLI(Re- verse)e盯GTGAAeeCeGACATG扩增KIR3DLI基因，得到197bp的片断。用引物KIR3 DSI(Forward):AGCCTGCAGGGAACAGAAG和KIR3DSI( Revers。)GccTGAcTGTGGTGTCG得到一300bp大小的片断。扩增条件为: 94℃3而nl个循环;94℃15 see，65℃15 see，72℃30 see，4个循环;94℃ 15see，60℃15 see，72℃30 see，21个循环;94℃15 see，55℃1 min，72℃2而n， 5个循环，72℃7 min。取5林1 pCR产物经1.5%琼脂糖电泳，与DNA Maker 比对，判断结果。 ***治疗方案按照卫生部《艾滋病标准治疗方案》选取无明显肝、肾功能障碍的病例，进行HAART治疗。口服默沙东公司的依非韦伦600毫克，每日一次，硫酸苟地那韦1000毫克，每日三次。结果 1.中国东北地区健康成年人NK和T淋巴细胞相关参考范围 NK细胞为121一916个/闪，NK%为6一35%。CD4‘T细胞为373- 1350个/闪，CDS+T细胞为240一1320个/闪，CD3‘T细胞为812一2790个/ 闪，CD4/CDS比值为0.66一3.13。 ***患者NK和NKT细胞与正常人的比较比较HIWAIDS患者和正常对照NK、NKT、CD4+T、CDS+T细胞数及相关比值。结果显示:HIWAIDS患者CD4十T细胞平均值为438 .4*290.2 个/林l，显著低于正常对照组CD4+T细胞(851.8土250.8个/林l)，p<0.01;HIWAIDS患者CDS+T细胞平均值为1 1 11 .58土537.3个/闪，显著高于正常对照组CDS‘T细胞(660.4士290.1个/林l)，p<0.01;HIV/AIDS患者NK 细胞平均值为278 .2*234 .5个/闪，显著低于正常对照组NK细胞(407 .0 土222.8个/林l)，p<0.01;HIV/AIDS患者NKT细胞平均值为100.5士65.0 个/闪，低于正常对照组NKT细胞(124.0，91.7个/闪)，p

关键词： HIV/AIDS患者 NK细胞 NKT细胞表面标志物

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食管癌肿瘤干细胞表面标志物的筛选与鉴定

食管癌肿瘤干细胞表面标志物的筛选与鉴定

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作者：张楠郑州大学

学位级别：博士

食管癌是常见的恶性消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。我国是世界上食管癌高发地区之一，食管癌位居我国肿瘤死亡的第4位，每年平均病死约15万人。食管癌多为鳞癌，是一种侵袭性很强的肿瘤，它的预后差，临床进展迅速，多... 详细信息

食管癌是常见的恶性消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。我国是世界上食管癌高发地区之一，食管癌位居我国肿瘤死亡的第4位，每年平均病死约15万人。食管癌多为鳞癌，是一种侵袭性很强的肿瘤，它的预后差，临床进展迅速，多伴淋巴结转移，且易复发。早期食道癌治疗方法主要是手术治疗和放射治疗，由于种种原因食道癌发现大多已中晚期，早已不宜手术，因此中晚期食管癌治疗多以放化疗相结合的综合性治疗办法。　　随着肿瘤研究的深入，人们逐渐发现肿瘤也是一种干细胞病，目前在多种肿瘤组织中发现了干细胞，如乳腺癌、结肠癌、胰腺癌等，2005年日本科学家在食管癌中也发现了干细胞。由于肿瘤干细胞的存在，使得化疗效果不尽如人意，因为肿瘤干细胞和干细胞一样具有极强的耐药性，化疗药物仅能杀死普通的肿瘤细胞，而不能杀死肿瘤干细胞，由于肿瘤干细胞的自我更新、增值、分化，会形成新的肿瘤组织，从而引起肿瘤的复发。如果能够针对肿瘤干细胞用药，杀死肿瘤干细胞，肿瘤就会逐渐消亡，最终消失，从而取得治疗成功。因此肿瘤干细胞是肿瘤治疗中的一个有效的靶点。　　要对肿瘤干细胞进行研究，首先就要将其从肿瘤细胞中分离出来，并给以鉴定，目前在肿瘤干细胞的分离中，多采用以下三种方法：1、流式细胞仪分选法;2、磁性分选仪分选法;3、侧群细胞（side-population cells，SP细胞）分选法，其中前两者是利用肿瘤细胞的特异性表面标志物，将其与相对应的抗体结合，使用流式细胞仪或磁性分选仪将其分选出来，而SP细胞分选法则是利用SP细胞与肿瘤干细胞具有较多的共性，SP细胞被认为是具有干细胞样的细胞群落，在某些没有发现特异性标志物的肿瘤中，由于无法通过前两种方法分选出肿瘤干细胞，SP细胞就会通过使用流式细胞仪分选出，来作为研究肿瘤干细胞的替代品，但SP细胞只是具有干细胞样的细胞，并不能认为SP细胞就是肿瘤干细胞。　　对以上三种分选方法进行比较，SP细胞分选法，具有适用性广泛，试剂价格低廉的优点，目前在食管癌、胃癌、甲状腺癌等肿瘤中分选出了SP细胞，但这种方法前期准备工作复杂，且由于在分选过程中使用到了有毒性的荧光染料，所以分选出的细胞活性差，难以存活。因此在肿瘤干细胞的分选中，寻找特异性的表面标志物，仍是无法绕过去的难题。目前在多种肿瘤细胞株中找到的特异性表面标志物，如 CD44+CD24-/low的乳腺癌细胞被认为是乳腺癌干细胞， CD133+表型的脑肿瘤细胞被命名为脑肿瘤干细胞，但在食管癌中尚未能发现特异性的表面标志物。　　P75NTR（P75 neurotroph in receptor，P75NTR）是一个神经影响因子受体，表达于在神经细胞的早期发育过程中，其通过不同信号转导通路诱导以神经细胞为主的细胞增殖、迁移、分化、凋亡、突触的建立及神经的形成。近年来在食管癌研究中，有学者发现，P75NTR阳性细胞具有无限增殖、自我更新和多向分化的能力，而这些特点与肿瘤干细胞极其相似，因此认为 P75NTR可能是食管癌干细胞的特异性表面标志物，但后续的研究显示：p75NTR不能单独作为人食管肿瘤干细胞表面标志物，其原因为：1.部分食管癌细胞株中 p75 NTR阳性细胞高达30.1％，远高于肿瘤干细胞正常比例。2.它的阴性细胞也有一定成瘤能力。结合目前肿瘤干细胞表面标志物多为一个肿瘤细胞标志物与一个干细胞标志物相联合，我们考虑为p75 NTR找一个搭档，首先它必须是膜蛋白，还是一个干细胞的标志物，其次考虑肿瘤干细胞的多药耐药性，它最好是一个耐药蛋白。　　乳腺癌耐药蛋白（Breast cancer resistance protein1， BCRP1）是SP细胞主要的转运蛋白，它是一个膜蛋白，其转运能力较P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多药耐药相关蛋白（ Multidrug related protein， MRP）、肺相关蛋白（ Lung relatedprotein，LRP）、热休克蛋白（Hot shock protein，HSP）等其他耐药蛋白高出5-50倍，且BCRP1在不同来源的SP中均呈高表达，其功能被认为是参与肿瘤细胞的多药耐药性，因此被认为是一个干细胞的标志物。　　为观察P75NTR与BCRP1联合能否作为食管癌干细胞表面标志物，本研究使用流式细胞仪在食管癌TE-2细胞株中分选出SP细胞与非SP细胞亚群，使用磁性分选仪分选出p75NTR+/BCRP1+双阳性细胞与阴性细胞，然后通过观察p75NTR+/BCRP1+细胞在细胞增值能力、分化能力、体外成瘤能力、细胞肿瘤球形成情况与阴性细胞的差异，并通过比较其与 SP细胞在以上方面的差异，判断 p75NTR与BCRP1联合作为TE-2细胞株干细胞标志物的可能，从而为食管癌的临床治疗提供有效的靶点。　　方法：　　1、常规

关键词：食管癌肿瘤干细胞表面标志物生物学鉴定

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肝癌干细胞表面标志物的初步筛查及其临床应用研究

肝癌干细胞表面标志物的初步筛查及其临床应用研究

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作者：闫伟伟中国人民解放军军医进修学院

学位级别：硕士

目的探讨肝癌干细胞表面标志物的表达情况及与普通肝癌细胞相比有无差异,明确其高表达的某些分子标志物与临床有无相关性,对临床有无指导意义。方法第一部分我们通过细胞爬片、细胞免疫组化法研究了普通肝癌细胞HepG2细胞、Hep-11细胞... 详细信息

目的探讨肝癌干细胞表面标志物的表达情况及与普通肝癌细胞相比有无差异,明确其高表达的某些分子标志物与临床有无相关性,对临床有无指导意义。方法第一部分我们通过细胞爬片、细胞免疫组化法研究了普通肝癌细胞HepG2细胞、Hep-11细胞与肝癌干细胞Hep-12细胞三种细胞株中CD34、CD56、CD117、AFP、P53及***4、SOX2抗原的表达情况。第二部分我们根据第一部分筛查出的肝癌干细胞表面标志物CD34、CD117,通过免疫组化法检测55例肝癌组织中上述两种抗原的表达情况,并将其表达情况与临床病理参数结合进行统计学分析,探讨CD34、CD117对肝癌术后复发的影响。结果1、与HepG2、Hep-11细胞相比,Hep-12细胞高表达cD34、CD117、AFP及P53抗原；2、CD34、CD117抗原在肝癌中的表达较肝硬化及正常肝组织明显增高；3、55例肝癌患者CD34阳性组较CD34阴性组的无瘤生存时间缩短(P=0.043),CD117阳性组的无瘤生存时间较CD117阴性组也明显缩短(P=0.000)；4、经单因素及多因素分析发现,CD117抗原表达、血清AFP水平及肿瘤大小是肝癌患者术后无瘤生存时间的独立预后因素。结论肝癌干细胞较普通肝癌细胞具有特异性表面分子标志物cD34、CD117、AFP及P53。在肝癌术后复发过程中,CD34可能通过促进肿瘤血管生成进而促进肝癌的生长及转移,CD117可能通过诱发肝癌复发进而影响无瘤生存时间。通过我们从细胞学及组织学两方面对CD34、CD117免疫组化的研究,初步阐明了肝癌干细胞表面标志物CD34、CD117对肝癌术后出现复发、转移可能存在的影响及临床意义。

关键词：肝细胞癌肿瘤干细胞表面标志物免疫组化法

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肾综合征出血热患者不同临床阶段NK细胞及其相关表面标志物的研究

肾综合征出血热患者不同临床阶段NK细胞及其相关表面标志物的研究

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作者：李敏中国医科大学

学位级别：硕士

前言 　　肾综合征出血热(hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS)是由汉坦病毒引起的一种历史悠久、流行广泛、危害性严重的自然疫源性疾病。该病的主要临床特征有发热、出血和肾损害，其病理改变包括微血管出血... 详细信息

前言 　　肾综合征出血热(hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS)是由汉坦病毒引起的一种历史悠久、流行广泛、危害性严重的自然疫源性疾病。该病的主要临床特征有发热、出血和肾损害，其病理改变包括微血管出血、急性血小板减少、低血压休克以及肾衰竭等。目前，我国HFRS的发病率和病死率仍居世界首位，是重灾区。HFRS具有如此高的发病率及病死率，但发病机制尚未完全清楚。在汉坦病毒的感染中，免疫细胞及其表面相关标志物的研究不容忽视。 　　病毒感染人体后能导致感染细胞功能和结构的损害，另一方面也能诱发人体的免疫应答和各种细胞因子的释放。自然杀伤细胞是天然免疫系统的主要组成部分，免疫反应中可显著地发挥抗病毒作用。NK细胞是一群CD3表达阴性、CD56表达阳性或CD16表达阳性的淋巴细胞，具有较强的杀伤功能和免疫调节功能。NK细胞表面受体包括杀伤抑制受体和活化受体。这些受体能够与靶细胞表面相应的配体相结合而产生抑制信号或活化信号，决定着NK细胞是否对靶细胞发挥杀伤功能。 　　CD8+T细胞是介导细胞免疫的效应T细胞，经抗原致敏后可以特异性杀伤携带致敏抗原的靶细胞，通过其表面的受体TCR和CD8分子同抗原提呈细胞提呈的MHC-肽复合物结合从而传导活化信号，进而对靶细胞进行杀伤。同时，有研究表明，CD8+T细胞也可表达一些抑制性或活化性的NK相关受体。但目前对于HFRS患者体内CD8+T细胞表面NKR的表达情况，报道较少。 　　因此，本实验对HFRS患者不同临床阶段NK细胞亚群的精细划分、特定NK细胞亚群表面受体的表达，HFRS患者体内CD8+T表面NKR的表达情况进行深入研究，以期为阐明HFRS患者的免疫机制、寻找有效地疾病防御防控措施提供依据。 　　方法 　　一、实验标本采集 　　按照2008年修订的“全国流行性出血热防治方案”(WS278-2008)中临床诊断及分型标准，所有病例经特异性HFRS—IgM、IgG检查均为阳性，临床表现典型。阴性的健康对照者来自健康体检门诊和实验室工作人员，血常规、肝、肾功能正常，无免疫系统疾病史。在患者知情并同意的情况下抽取外周血5ML肝素钠抗凝。同时对健康人群以同样的方法取血作对照。 　　二、淋巴细胞分离 　　1)取5ml抗凝全血与5mlPBS缓冲液，加入10ml人淋巴细胞分离液离心20分钟，取中间白色云雾状狭窄层（PBMC层），放入4-5mlPBS缓冲液的试管中，离心10分钟。吸去上清液，沉淀经过反复洗涤2次即得所需淋巴细胞。 　　2)将分离淋巴细胞置于液氮罐中保存以备后续分析。 　　三、细胞复苏 　　从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入40度水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化，将细胞悬液移入离心管中，缓慢加入1640培养液，离心两次，去除二甲基亚砜。 　　四、细胞表面染色 　　向流式细胞仪专用试管中加入0.1mlPBMC悬液，按照BD公司细胞表面染色试剂盒说明书操作分别加入相应的抗体，并设立单标管与阴性对照管。染色半个小时后加每管加入2mlPBS缓冲液进行洗涤，离心10分钟，用缓冲液重悬细胞，流式细胞仪进行检测。 　　五、流式细胞检测 　　为保证实验准确性，检测机器的准确性，然后再对之前制备好的样本进行测定，用流式分析软件对数据进行分析。 　　六、统计学分析 　　使用SPSS11.0统计分析软件进行统计。样本采用独立样本t检验对数据做统计分析。 　　实验结果 　　一、HFRS患者NK细胞变化 　　HFRS患者的NK细胞水平明显高于正常对照组，并且具有统计学差异。对四个不同临床发病阶段的患者同正常对照组进行比较分析发现，在四个发病阶段内两种细胞水平也都处于升高状态，且少尿期高于发病初期与末期。 　　二、HFRS患者NK细胞活化与抑制受体表达变化 　　对NK细胞抑制受体NKG2A和活化受体NKG2D进行了分析。结果患者抑制受体NKG2A表达总水平有下降趋势，并且在少尿期下降的比较明显。但是NK细胞活化受体NKG2D表达有上升的趋势。对不同发病阶段患者活化受体表达进行比较发现少尿期略有升高。 　　三、HFRS患者NK细胞亚群变化 　　对HFRS患者NK细胞的3个NK细胞亚群进行检测，发现所有患者的CD56-CD16+和CD56briC

关键词：肾综合征出血热 NK细胞表面标志物临床阶段

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ART治疗后免疫无应答者NK表面标志物及功能变化的研究

ART治疗后免疫无应答者NK表面标志物及功能变化的研究

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作者：雷洁中国医科大学

学位级别：硕士

目的:抗逆转录病毒鸡尾酒疗法(Antiretroviral therapy,ART)是目前绝大部分HIV感染者所接受的治疗措施,虽然ART治疗可以恢复大多数HIV感染者的CD4T细胞计数,但仍有约1/3的ART治疗者CD4T细胞计数恢复不良。根据CD4T细胞恢复情况将ART治... 详细信息

目的:抗逆转录病毒鸡尾酒疗法(Antiretroviral therapy,ART)是目前绝大部分HIV感染者所接受的治疗措施,虽然ART治疗可以恢复大多数HIV感染者的CD4T细胞计数,但仍有约1/3的ART治疗者CD4T细胞计数恢复不良。根据CD4T细胞恢复情况将ART治疗者分为免疫应答者(Immunological Responder,IR)和免疫无应答者(Immunological Non-Responder,INR)。目前认为INR人群胸腺输出功能减弱,T细胞凋亡增加并伴有线粒体功能障碍等一系列变化。免疫系统中另一重要细胞—NK细胞在固有免疫中发挥重要作用,与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节密切相关,但是对INR人群自然杀伤细胞(Nature killer cell,NK cell)的研究却相对较少,尤其是NK细胞功能变化尚未见研究。因此本实验拟对ART治疗2年以上的INR及IR患者进行研究比较,明确INR人群NK细胞表面标志物表达变化,探索了INR人群NK细胞功能变化,并研究其与疾病进展的关系。研究方法:1、NK细胞表面标志物检测:PBMC中加入Percp-Cy5.5-CD3、PE-cy7-CD56、Apc-cy7-CD16、BB515-NKG2D、Apc-LFA-1、PE-PD-1、BV786-CD69、BV421-TIGIT等荧光抗体。4℃避光染色30分钟,PBS洗细胞(350g,5min),使用流式细胞仪检测。2、NK胞内储存穿孔素及颗粒酶B的检测:PBMC中加入Percp-Cy5.5-CD3、PE-cy7-CD56、Apc-cy7-CD16等荧光抗体,4℃避光染色30分钟。加入破膜剂孵育20min,破膜洗液洗细胞(500g,5min)。加入PE-Perforin、APC-GranzymeB荧光抗体,4℃避光染色30分钟,破膜洗液洗细胞,使用流式细胞仪检测。3、NK细胞分泌及脱颗粒功能检测:IL-12(10ng/ml)、IL-15(50ng/ml)、IL-18(100ng/ml)刺激PBMC,同时并加入PE-CD107a,培养24小时,培养结束前6小时加入Golgi-stop。加入Live/Dead染色20min。加入Percp-Cy5.5-CD3、PE-cy7-CD56、Apc-CD16荧光抗体,4℃避光染色30分钟。加入破膜剂孵育20min,破膜洗液洗细胞。加入FITC-IFN-γ,4℃避光染色30min,破膜洗液洗细胞,使用流式细胞仪检测。4、NK细胞增殖能力检测:用磁珠负选出NK细胞。加入Violet荧光染料,37℃摇床染色30min。细胞加入96孔培养板(0.5million/200μl)。IL-12(10ng/ml)、IL-15(50ng/ml)、IL-18(100ng/ml)刺激细胞5天。5天后离心去上清,7AAD染色4min,使用流式细胞仪检测。5、NK细胞趋化能力检测:负选出NK细胞后RPMI1640重悬。8μm-Transwell板下室加入600μl SDF-1(100ng/ml),上室加入100μl细胞。37℃孵育3小时后吸取Transwell板下室液体,细胞计数仪计数迁移细胞总数。6、NK细胞肌动蛋白及丝切蛋白检测:负选出NK细胞。一半细胞与破膜剂共孵育20min。加入Phalloidin室温染色30min,洗细胞,流式细胞仪检测。剩余一半细胞加入1.5%多聚甲醛,室温孵育10min,500g离心5min。再加入冰甲醇4℃孵育10min后洗细胞,加入P-cofilin抗体室温孵育60min后洗细胞。加入第二抗体,室温避光孵育30min后洗细胞,流式细胞仪检测。结果:1、NK细胞亚群分布及表面标志物表达分析1.1 NK细胞亚群分布情况分析NK细胞CD56CD16亚群在INR中所占比例显著低于NC(P<0.01),CD56CD16在三组人群中所占比例基本一致。INR的CD56CD16占比明显高于NC和IR(P<0.01,P<0.05),并且CD56CD16占比与CD4T细胞计数有显著的负向相关关系(r=0.4769,P<0.01)(图1B,C)。1.2 NK细胞表面标志物表达情况分析INR人群CD69表达显著高于NC和IR(P<0.01,P<0.01)(图1C);INR表达LFA-1明显增多(P<0.01,P<0.05),而IR与NC的表达量基本相同(图1D);INR的NK细胞表达PD-1和TIGIT比例明显高于NC和IR(P<0.001,P<0.001;P<0.05,P<0.05),尤其是PD-1差异显著(图1E,F);NKG2D在三组人群中并没有显著差异(图1G)。2、NK细胞表面标志物与疾病进展的相关性分析CD69、LFA-1、PD-1与CD4T细胞计数具有显著的负向相关关系(P<0.0

关键词： HIV-1 IR INR NK细胞表面标志物杀伤功能趋化

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脐血与外周血来源CIK细胞表面标志物及其功能的研究

脐血与外周血来源CIK细胞表面标志物及其功能的研究

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作者：张震郑州大学

学位级别：硕士

目的恶性肿瘤的发生率与致死率依然呈上升趋势,作为一种有可能治愈肿瘤的新型方法,过继免疫治疗得到广泛关注,其中细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells, CIK)免疫治疗已被广泛应用。目前,临床上主要应用的是外周血来... 详细信息

目的恶性肿瘤的发生率与致死率依然呈上升趋势,作为一种有可能治愈肿瘤的新型方法,过继免疫治疗得到广泛关注,其中细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells, CIK)免疫治疗已被广泛应用。目前,临床上主要应用的是外周血来源的CIK细胞,但外周血CIK细胞免疫治疗存在一定的缺陷性,如增殖速率低、体内存活时间短,抗凋亡能力差。本研究主要比较了脐血与肿瘤患者外周血来源CIK细胞的增殖、免疫表型、免疫原性、激活型和抑制型表面标志物、耐药基因ABCG2的表达及化疗药物处理后的抗凋亡能力；并建立食管癌的移植瘤模型,比较两种CIK细胞在体内杀伤肿瘤细胞的能力。方法使用Ficoll-Plaque淋巴分离液分离脐血单个核细胞(cord blood mononuclear cell, CBMC)及肿瘤患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC),重悬于RPMI1640培养基(含10%胎牛血清),加入细胞因子IFN-γ (interferon-γ),抗CD3单抗和IL-2(interlukin-2)诱导培养CIK。使用流式细胞术检测脐血与外周血CIK的增殖、免疫表型、免疫原性、激活型表面标志物(CD28、CD27)和抑制型表面标志物(PD-1)的表达；采用Annexin V/PI双染法检测顺铂处理后CIK细胞的凋亡情况；使用qRT-PCR检测耐药基因ABCG2的表达；使用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测IFN-γ、IL-2、TNF-α (tumor necrosis factor-α)的分泌；使用流式细胞术检测CIK细胞CD107a的表达；另外,购买5周龄的Balb/c裸鼠,随机分为3组,每组5只。裸鼠.皮下接种1×107个KYSE70细胞,成瘤后,通过尾静脉分别输注磷酸盐缓冲液(Phosphatate buffered salin, PBS)、脐血CIK细胞、外周血CIK细胞一次,然后观察皮下肿瘤体积变化。结果脐血CIK培养第10d时增殖指数(proliferation index, PI)显著高于外周血CIK [(251.52±16.76) vs (158.00±43.19), P<0.05]。脐血CIK经诱导培养13d后HLAⅠ、HLAⅡ的表达显著低于外周血CIK[(18.86±±9.76)%vs(65.63±10.02),(14.53±3.34)%vs(67.20±±4.50)%,P<0.01],其中CD8HLAⅡ、CD4HLAⅡ和CD8HLAⅠ的表达较外周血CIK低[(5.86±0.53)%vs(51.20±4.85)%,(2.32±±0.34)%vs(12.42±±3.65)%,(17.56±±1.85)%vs(52.10±±5.72)%,P<0.05], CD4HLAⅠ的表达无差异(P>0.05)。脐血CIK中CD3+CD56+细胞比例较外周血CIK高[(21.20±±4.82)%vs(10.06±±3.46)%,P<0.05]；脐血CIK中激活型CD4+CD28+、CD4+CD27+和CD8+CD27+T细胞比例较外周血CIK中高[(32.40±±16.81)%vs(18.65±±9.23)%,(27.48±±13.53)%vs(0.98±±0.55)%,(41.76±13.98)%vs(2.58±±2.10)%,P<0.05或P<0.01]；而抑制型CD8+PD-1+T细胞的含量明显较低[(3.25±2.13)%vs(8.05±±9.23)%,P<0.01],两者中CD8+CD28+、CD4+PD-1+T细胞的含量无显著差异(P>0.05)。此外,脐血CIK高表达耐药基因ABCG2。顺铂处理13d后的脐血CIK细胞凋亡率显著低于外周血CIK细胞[(10.10±4.20)%vs (27.12±12.18)%, P<0.05]。 ELISA检测显示脐血CIK分泌的IFN-γ、IL-2较外周血CIK高(P<0.01),TNF-α的分泌无显著差异[(4.70±0.44)pg/ml vs (4.82±0.51)pg/mL, P>0.05]。脐血CIK上CD107a的表达显著高于外周血CIK细胞[(9.16±±1.58)%vs(2.36±±0.86)%,P<0.01]。裸鼠体内试验表明,脐血CIK杀肿瘤的能力显著高于外周血CIK。结论与外周血CIK相比,脐血CIK增殖能力强、活化水平高、抗凋亡能力强、细胞因子分泌水平高,并且对肿瘤的杀伤功能强、治疗效果好,具有较佳的临床应用潜能。

关键词：细胞因子诱导杀伤细胞脐血外周血表面标志物耐药基因ABCG2 顺铂细胞因子裸鼠

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宫颈癌干细胞表面标志物的研究进展

引用

现代妇产科进展 2011年第12期20卷 990-992页

作者：万丽娟吴楠中国人民解放军北京军区总医院妇产科北京100700

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,随着TCT及阴道镜病理活检的广泛应用,我国宫颈癌的早期发现、早期治疗均取得了很大进展,但晚期宫颈癌患者的治疗,目前方法不多,效果也欠佳。随着干细胞技术的兴起和发展,学者们发现,肿瘤细胞表现出的... 详细信息

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,随着TCT及阴道镜病理活检的广泛应用,我国宫颈癌的早期发现、早期治疗均取得了很大进展,但晚期宫颈癌患者的治疗,目前方法不多,效果也欠佳。随着干细胞技术的兴起和发展,学者们发现,肿瘤细胞表现出的增生和分化能力与干细胞极其相似。本文现对宫颈癌干细胞可能的来源、肿瘤标志物及治疗前景做一简单综述,旨在为探讨宫颈癌发病机制提供新思路,为宫颈癌的病因、诊断及治疗策略开辟新的方向。

关键词：宫颈癌宫颈癌干细胞表面标志物靶向治疗宫颈储备细胞

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