检索结果-内蒙古大学图书馆

基于Tet-On 3G的IFITM3诱导表达MDCK细胞系的建立及功能分析

高等学校化学学报 2017年第5期38卷 770-777页

作者：曹婷婷杜寿文许汪邢彬赵飞王茂鹏朱羿龙白杰英田宇飞刘立明赵翠青周义发李昌金宁一军事医学科学院军事兽医研究所省部共建吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室长春130122 东北师范大学生命科学学院长春130022 温州大学病毒学研究所温州325035 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

利用Tet-On 3G系统构建了含人IFITM3基因的真核表达质粒pTRE3G-IFITM3,并将其与调控质粒pLVX-Tet3G共转染犬肾细胞(MDCK),转染后48 h用G418和嘌呤霉素进行筛选,用多西环素(Dox)对获得的细胞系进行诱导表达鉴定,并进行Dox敏感性分析、IFI... 详细信息

利用Tet-On 3G系统构建了含人IFITM3基因的真核表达质粒pTRE3G-IFITM3,并将其与调控质粒pLVX-Tet3G共转染犬肾细胞(MDCK),转染后48 h用G418和嘌呤霉素进行筛选,用多西环素(Dox)对获得的细胞系进行诱导表达鉴定,并进行Dox敏感性分析、IFITM3^+细胞百分数及定位分析.用含萤光素酶(Luciferase)报告基因的禽流感病毒H5/H7蛋白或VSV G蛋白包裹的假型慢病毒颗粒进行感染实验,检测萤光素酶活性.结果表明,筛选获得了携带人IFITM3的MDCK诱导表达细胞系,且IFITM3表达量与Dox剂量和诱导时间相关;确定Dox工作浓度为2.5μg/mL,诱导12 h时IFITM3^+细胞数达75%以上,且IFITM3在晚期内体/溶酶体存在分布;假型病毒感染及萤光素酶活性分析表明,IFITM3可显著抑制禽流感病毒H5,H7和VSV G蛋白介导的病毒进入,为深入探究其具体的抑制机制奠定了基础.

关键词：干扰素诱导跨膜蛋白3 干扰素刺激基因诱导表达病毒进入抑制

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大鼠心肌缺血预适应诱导表达上调基因的筛选和鉴定

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生物化学与生物物理进展 2003年第3期30卷 390-394页

作者：袁灿吕青兰陈广文刘瑛王尧玲刘海军邹江肖献忠中南大学湘雅医学院病理生理教研室长沙410078

采用反复短时间结扎及松解左冠状动脉前降支构建大鼠心肌缺血预适应动物模型 ,运用抑制消减杂交技术建立大鼠心肌缺血预适应诱导表达上调基因的消减cDNA文库 ,通过反向RNA点杂交对部分文库基因进行差异表达初筛 ,选取表达差异最明显的 8... 详细信息

采用反复短时间结扎及松解左冠状动脉前降支构建大鼠心肌缺血预适应动物模型 ,运用抑制消减杂交技术建立大鼠心肌缺血预适应诱导表达上调基因的消减cDNA文库 ,通过反向RNA点杂交对部分文库基因进行差异表达初筛 ,选取表达差异最明显的 85个基因进行测序 ,获得了 3 1个核编码基因和 18个新基因 (EST) ,核编码基因中有相当一部分与细胞保护或信号转导有关 ,新基因已被GenBank收录 .从已测序基因中任选 5个进行RT PCR检测 ,并任选 2个进行RNA印迹检测 ,均证实在缺血预适应时表达增高 .

关键词：大鼠心肌缺血预适应诱导表达上调基因筛选鉴定抑制消减杂交

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单质粒模式诱导表达载体系统的建立

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生物化学与生物物理进展 2003年第5期30卷 824-825页

作者：刘定燮周晓巍黄培堂军事医学科学院生物工程研究所北京100071

在Invitrogen公司T Rex诱导表达系统的基础上,将目的基因与调控蛋白基因克隆于同一载体上,并在CV1细胞中观察了四环素对该单质粒模式载体报告基因表达的诱导效应.载体在瞬时转染CV1细胞并以四环素诱导 2 4h后目的基因的表达水平提高了 ... 详细信息

在Invitrogen公司T Rex诱导表达系统的基础上,将目的基因与调控蛋白基因克隆于同一载体上,并在CV1细胞中观察了四环素对该单质粒模式载体报告基因表达的诱导效应.载体在瞬时转染CV1细胞并以四环素诱导 2 4h后目的基因的表达水平提高了 8 9倍。

关键词：单质粒模式诱导表达载体系统四环素

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耐热嗜酸古细菌谷氨酰胺合成酶基因的克隆、诱导表达和活性测定

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生物化学与生物物理进展 2002年第5期29卷 745-749页

作者：殷志敏闫淑珍戴谷吴一凡张双全南京师范大学生命科学学院南京210097 江苏教育学院生物系南京210013

采用DEAE Sepharose及SephacrylS 30 0柱分离纯化了耐热嗜酸古细菌Sulfolobusacidocaldarius谷氨酰胺合成酶 (E 6 .3.1.2 ,Sac GS) .SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分子质量为 5 3ku的单一条带 .测定其N端氨基酸序列为PGLPKNEHEALEFLKSNNIKWVDLQ ,与其他古细菌谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列进行比较后 ,发现均存在ATP结合保守序列TFMPKP (I/L/F) (F/P/Y) (G/R) .采用碱基的简并性设计出一对简并引物 ,以Sulfolobusacidocaldarius的基因组DNA为模板进行PCR扩增 ,获得 780bp的DNA片段 ,经克隆测序后确定为谷氨酰胺合成酶基因片段 ,以地高辛标记的该片段为探针 ,将Sulfolobusacidocaldarius基因组DNA用不同的限制性内切酶分别进行单双酶组合切割 ,然后进行DNA印迹分析 ,选出了 2 4kb的BamHⅠ /HindⅢ双酶切片段 ,并克隆到pBluescriptKS+ 质粒中 ,通过菌落原位杂交获得阳性克隆 ,进行DNA全序列测定后 ,得到完整的1 5kb的谷氨酰胺合成酶全基因序列 ,再将其克隆到 pET3c载体中 ,在大肠杆菌BL2 1中进行诱导表达并进行相应的活性测定 ,其酶活力的最适温度为 90℃ .

关键词：耐热嗜酸古细菌谷氨酰胺合成酶基因基因克隆诱导表达活性测定

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诱导表达猪生长激素pGH载体系统构建及其在PK15细胞中表达验证

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农业生物技术学报 2013年第4期21卷 483-488页

作者：白立景周荣敖红鞠辉明王楚端李奎中国农业科学院北京畜牧兽医研究所中国农业大学动物科技学院扬州大学兽医学院

为实现外源生长激素(GH)基因在特定时间、空间的可控表达,本研究构建四环素(TET-ON)表达载体系统,并在细胞水平对该载体系统进行诱导活性验证。结果表明:(1)成功构建了重组载体pTRE-GH12;(2)筛选建立了可诱导表达GH的细胞系;(3)利用强... 详细信息

为实现外源生长激素(GH)基因在特定时间、空间的可控表达,本研究构建四环素(TET-ON)表达载体系统,并在细胞水平对该载体系统进行诱导活性验证。结果表明:(1)成功构建了重组载体pTRE-GH12;(2)筛选建立了可诱导表达GH的细胞系;(3)利用强力霉素(doxycycline,DOX)诱导阳性细胞克隆并检测外源GH的表达,QRT-PCR结果表明,实验组细胞在DOX诱导后表达活性是诱导前264.481倍;对照组细胞在DOX诱导前诱导后表达无明显变化,实验组和对照组细胞间差异极显著(P<0.01),实验组DOX诱导前后差异极显著(P<0.01);(4)Western杂交后灰度分析结果和QRT-PCR趋势一致,实验组和对照组细胞间GH蛋白表达量差异极显著(P<0.01),实验组DOX诱导前后GH蛋白表达量差异极显著(P<0.01)。研究结果提示,四环素(TET-ON)诱导猪生长激素(GH)表达系统实现了可控表达,为以后制备可诱导表达GH的转基因动物提供了技术基础。

关键词：猪生长激素(pGH) 四环素(TET-ON) 诱导表达

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柑橘溃疡病抗性SNP验证及其相关钙依赖性蛋白激酶基因诱导表达

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中国农业科学 2020年第9期53卷 1820-1829页

作者：彭蕴雷天刚邹修平张靖芸张庆雯姚家欢何永睿李强陈善春西南大学/中国农业科学院柑桔研究所国家柑桔品种改良中心

【目的】前期根据转录组数据挖掘柑橘单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,通过关联分析获得14个与柑橘溃疡病耐/感性关联的SNP。以此为基础,本研究利用柑橘杂交群体验证这些位点与柑橘溃疡耐/感性的相关性,以期获... 详细信息

【目的】前期根据转录组数据挖掘柑橘单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,通过关联分析获得14个与柑橘溃疡病耐/感性关联的SNP。以此为基础,本研究利用柑橘杂交群体验证这些位点与柑橘溃疡耐/感性的相关性,以期获得显著相关的SNP,并对其相关的基因进行柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)和植物激素诱导表达分析。【方法】以抗病和敏感柑橘品种及其杂交F1代群体共143个材料为试材,采用离体叶片针刺接种法进行溃疡病抗性鉴定;利用高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)技术,对F1群体进行SNP分型;使用DPS软件对F1群体的溃疡病耐/感性表型和SNP基因型进行相关分析;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)分析其中一个SNP相关的柑橘钙依赖性蛋白激酶基因(calcium-dependent protein kinase gene,CDPK)的诱导表达模式。【结果】供试杂交F1代群体的病斑面积在0.75—3.29 mm2;病情指数在30.2—100,而抗病品种‘金弹’病情指数为11.1,敏感品种‘冰糖橙’病情指数为100。病情指数较低的杂交后代,其亲本至少有1个为耐病性品种,母本耐病性强的居多。根据病情指数确定免疫材料1个,高抗17个,中抗31个,中感38个,高感56个。SNP分型结果显示,14个SNP位点在143个供试材料间均有多态性,可分为3种不同的基因型,2种纯合型和1种杂合型。简单相关分析结果表明,多个SNP位点的基因型与病斑面积及病情指数相关性显著。典型相关分析结果显示,其中5个SNP位点与病斑面积相关性较高,相关系数绝对值均>0.2,其编号分别为HP31、HP42、HP85、HP87、HP170,可利用这5个SNP位点的基因型预测柑橘溃疡病耐性的强弱。其中SNP位点HP31位于CsCDPK(CAP ID:Cs4g10370)的编码区,对柑橘离体叶片接种溃疡病菌诱导处理6、12、24、48和72 h后进行基因相对表达量分析,发现‘金弹’(高抗)、‘新生系3号椪柑’(中抗)和‘冰糖橙’(高感)中该基因的表达量均呈先升后降趋势,且均在48 h其相对表达量达到最高;接菌处理后12 h,‘金弹’中该基因的相对表达量为对照的3倍,而‘新生系3号椪柑’和‘冰糖橙’中无明显差异。此外,CsCDPK受水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)诱导表达,且在不同溃疡病耐/感性品种中该基因诱导表达的模式不同。【结论】获得5个与溃疡病耐/感性显著相关的SNP,可用作柑橘溃疡病耐/感性筛选标记。SNP位点HP31相关的CsCDPK受溃疡病菌和SA、MeJA和ABA诱导表达,该基因可能在柑橘应答溃疡病菌侵染的信号转导过程中具有重要功能。

关键词：柑橘溃疡病柑橘溃疡病菌单核苷酸多态性钙依赖性蛋白激酶基因诱导表达

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重组木聚糖酶的诱导表达及其定向制备低聚木糖的研究

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林产化学与工业 2020年第5期40卷 99-106页

作者：解静聪蒋剑春高月淑徐浩赵剑卫民中国林业科学研究院林产化学工业研究所生物质化学利用国家工程实验室国家林业和草原局林产化学工程重点实验室江苏省生物质能源与材料重点实验室江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心江苏南京210042

为降低酶法制备低聚木糖的成本并提高产品纯度,围绕重组木聚糖酶的诱导表达条件和酶水解木聚糖的工艺参数进行研究,考察了诱导剂浓度、诱导温度、诱导光密度(OD 600)值和诱导时间等因素对重组大肠杆菌(pTrc99A-podoxyn11-DE3)产重组木... 详细信息

为降低酶法制备低聚木糖的成本并提高产品纯度,围绕重组木聚糖酶的诱导表达条件和酶水解木聚糖的工艺参数进行研究,考察了诱导剂浓度、诱导温度、诱导光密度(OD 600)值和诱导时间等因素对重组大肠杆菌(pTrc99A-podoxyn11-DE3)产重组木聚糖酶的影响,针对酶水解过程中酶用量、酶水解时间及产物分布情况进行了探讨。结果表明:在诱导剂浓度5 mmol/L,诱导温度32℃,诱导OD 600值1.2,诱导时间8 h的最佳诱导条件下,重组酶酶活力可达5.72 U/mL。玉米芯木聚糖质量浓度20 g/L,温度45℃,pH值5.5,重组木聚糖酶用量为60 U/g条件下水解12 h,酶解率可达49.90%,低聚木糖得率21.75%。杨木木聚糖质量浓度20 g/L,温度45℃,pH值5.5,重组木聚糖酶用量35 U/g条件下水解14 h,酶解率可达79.50%,低聚木糖得率73.30%。重组酶水解两种木聚糖的主要产物均为木二糖和木三糖,几乎不产生木糖。

关键词：重组木聚糖酶诱导表达低聚木糖酶水解条件

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1株古细菌海藻糖合成酶系在枯草芽孢杆菌中的诱导表达

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食品科学 2016年第21期37卷 124-130页

作者：王珊瑛李由然顾正华张梁丁重阳石贵阳江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

来源于古细菌嗜酸硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosylterhalose synthase,MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyltrehalose trehalohydrolase,MTHase)联合作用,可以利用淀粉为底物生成海藻糖。本研究构建了6种枯草芽孢杆菌一大肠杆菌穿梭表达载体,将密码子优化后的MTSase和MTHase编码基因在木糖异构酶基因的启动子及其阻遏蛋白介导下实现了在枯草芽孢杆菌中的功能表达,木糖启动子分别来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。在以5 g/L甘油为碳源,24 g/L蛋白胨为氮源时,菌体培养8 h后加入终质量浓度为6 g/L的木糖,37℃诱导16 h后重组MTSase、MTHase产生联合作用,海藻糖转化率达到33.57%。实现了MTSase、MTHase在枯草芽孢杆菌中的功能表达。

关键词：穿梭质粒嗜酸硫化叶菌枯草芽孢杆菌诱导表达

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口蹄疫病毒样颗粒诱导表达型载体的构建及其BHK-21细胞池的筛获

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生物工程学报 2023年第12期39卷 4849-4860页

作者：谭书桢董虎孙世琪郭慧琛中国农业科学院兰州兽医研究所/兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室甘肃兰州730000 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 云南省畜牧兽医科学院云南热带亚热带动物病毒重点病实验室云南昆明650224

瞬时表达是目前利用哺乳动物细胞表达口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白的主流方法。为实现染色体稳定表达FMDV衣壳蛋白并高效组装出病毒样颗粒(virus like particles,VLPs),本研究构建了piggy Bac(PB)转座-组成... 详细信息

瞬时表达是目前利用哺乳动物细胞表达口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)衣壳蛋白的主流方法。为实现染色体稳定表达FMDV衣壳蛋白并高效组装出病毒样颗粒(virus like particles,VLPs),本研究构建了piggy Bac(PB)转座-组成型表达、PB转座-四环素(tetracycline,Tet)诱导型表达两套质粒。利用荧光蛋白标记技术,验证了质粒的功能。通过抗生素筛选得到了组成型表达P12A3C(WT/L127P)基因的BHK-21细胞池(C-WT、C-L127P)和诱导型表达P12A3C(WT/L127P)基因的BHK-21细胞池(I-WT、I-L127P)。荧光观察和PCR检测证明了绿色荧光蛋白、3C蛋白酶、反向四环素转录激活因子等基因的稳定整合。Western blotting、酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)实验证明了细胞池I-L127P具有更强的衣壳蛋白和VLPs生产能力。本研究首次实现了哺乳动物细胞染色体诱导表达FMDV衣壳蛋白,有助于推动哺乳动物生产FMDV VLPs疫苗的技术工艺,也为构建其他蛋白的哺乳动物细胞诱导型表达系统提供了参考。

关键词：口蹄疫病毒病毒样颗粒质粒构建细胞池诱导表达

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鹿角灵芝三萜合成关键酶GaSQS基因的克隆与诱导表达

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华北农学报 2021年第3期36卷 33-40页

作者：王丹丹刘晓红宫远航辽东学院农学院辽宁丹东118003

为进一步研究SQS基因在鹿角灵芝三萜合成途径中的作用机制及茉莉酸甲酯(MeJA)对GaSQS基因的表达调控,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆鹿角灵芝鲨烯合酶基因GaSQS,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行数据分析,采用MeJA对GaSQS基因... 详细信息

为进一步研究SQS基因在鹿角灵芝三萜合成途径中的作用机制及茉莉酸甲酯(MeJA)对GaSQS基因的表达调控,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆鹿角灵芝鲨烯合酶基因GaSQS,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行数据分析,采用MeJA对GaSQS基因诱导表达。结果显示,该基因全长1969 bp,开放阅读框(ORF)长度为1515 bp,编码504个氨基酸,分子量为58.2 ku,具有1个跨膜结构域和3个保守区,为无信号肽的亲水性蛋白;GaSQS蛋白二级结构包括α-螺旋(59.52%)、无规则卷曲(28.37%)、延伸链(8.53%)和β-转角(3.57%);系统进化分析显示,鹿角灵芝GaSQS蛋白与灵芝SQS蛋白(ABF57213.1)具较高的同源性(99%);String蛋白互作网络分析显示,GaSQS蛋白互作的蛋白质共有10个,均为三萜、甾醇等萜烯类生物合成过程的重要物质;qRT-PCR分析表明,鲨烯合酶(SQS)的表达量与产量在原基和子实体初期高于其他发育阶段;在不同浓度MeJA诱导下,SQS蛋白均能高效表达,在200μmol/L时达到峰值效果最佳。

关键词：鹿角灵芝灵芝三萜 GaSQS MeJA 克隆诱导表达

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