检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：赵宇轩华中科技大学

学位级别：博士

光学荧光显微成像技术凭借特异性的荧光标记,成为了研究细胞器生命活动的重要工具。光片显微技术凭借层析精度高,成像速度快,光毒性低等优势,广泛应用于活细胞成像。然而,当前主流的光片仍存在空间占空比不高、旁瓣过高等问题,限制了光... 详细信息

光学荧光显微成像技术凭借特异性的荧光标记,成为了研究细胞器生命活动的重要工具。光片显微技术凭借层析精度高,成像速度快,光毒性低等优势,广泛应用于活细胞成像。然而,当前主流的光片仍存在空间占空比不高、旁瓣过高等问题,限制了光片显微技术对亚细胞结构的高层析精度、长时程观测。此外,由于衍射极限的存在,光学显微技术的分辨率不能随着倍率的增加而无限增大,因而无法对亚细胞结构实现更精细的观测。如何在后期图像处理中,通过计算重建的手段实现在不牺牲时间分辨率的同时,进一步提升成像技术的空间分辨率同样具有重要研究意义。本文围绕活细胞长时程、高时空分辨率三维成像中存在的问题,以实现空间和时间分辨率的解耦合,突破成像的时空分辨率极限为中心,开展以下研究: 首先,在硬件光学中提出并构建了亚微米分辨率的扫描贝塞尔光片显微系统,通过贝塞尔光束与相机电子狭缝的精准同步扫描,在荧光探测端实现了对贝塞尔光束旁瓣的抑制,显著提升了成像的层析精度。在算法上提出了基于双段卷积神经网络的单图超分辨算法,通过与扫描贝塞尔光片显微系统结合,在活细胞的亚细胞结构上实现了单图100×100×300 nm3的分辨率增强。其次针对贝塞尔光束旁瓣高、空间占空比低等问题,在硬件光学中提出并设计了基于强度调制的双环光学掩模,通过精准设计内外环的环宽和直径,对入射线高斯光束进行强度调制,实现低频分量的内环衍射光对外环衍射旁瓣的抑制,最终产生了横向均匀,轴向超薄（450 nm）且低旁瓣（33%）的贝塞尔光片,并依此构建了双环贝塞尔光片显微成像系统。基于该系统,在活细胞中实现了对亚细胞结构的超高速（最高10体积/秒）、长时程（多达26万帧）三维成像。此外,为在活细胞中实现保真度更高、鲁棒性更强的单图超分辨,在算法上提出并发展了多段级联的各向同性卷积神经网络,对光学成像中固有的噪声、光学模糊、欠采样、非均一性等降质问题联合求解,在活细胞中实现了对多达8种亚细胞结构的高保真各向同性100 nm分辨率增强。最后,通过将双环贝塞尔光片显微系统和各向同性卷积神经网络联合,在活细胞中实现了多种亚细胞结构互作的长时程、高时空分辨率三维超分辨成像,并根据成像结果对亚细胞结构互作进行了定量分析。综上,本文发展了高时空分辨率、低光毒性的活细胞三维超分辨显微成像方法,有效的克服了当前超分辨技术时空分辨率相互制约的难题,为生命科学特别是细胞生物学的研究提供了强有力的观测工具。

关键词：光片显微成像技术超分辨显微成像技术单图超分辨活细胞三维超分辨

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基于探测光场时空调制的超分辨显微方法与技术的研究

基于探测光场时空调制的超分辨显微方法与技术的研究

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作者：刘少聪浙江大学

学位级别：博士

在显微成像领域中,电子显微镜受到了广泛的应用,主要原因在于其能够达到几个纳米甚至亚纳米的超高成像分辨率。但是电子显微镜也存在局限性,即对于成像条件的要求非常苛刻,其真空的成像环境决定了电子显微镜无法对生物活细胞进行长时程... 详细信息

在显微成像领域中,电子显微镜受到了广泛的应用,主要原因在于其能够达到几个纳米甚至亚纳米的超高成像分辨率。但是电子显微镜也存在局限性,即对于成像条件的要求非常苛刻,其真空的成像环境决定了电子显微镜无法对生物活细胞进行长时程的观察。相比于电子显微镜,远场荧光光学显微镜是对生物活细胞成像更为合适的选择。远场光学显微镜能够实现对活细胞的无侵入性伤害成像和深度成像,而荧光显微成像中染料的使用也决定了其能够对活细胞进行特异性多参量成像,因此远场荧光光学显微镜是现代生物医学研究的重要工具。远场荧光光学显微镜同样也存在其自身的局限性,由于光学衍射极限的存在,远场光学显微成像分辨率在原理上被限制在半个激发光波长尺度左右,因此无法满足对生物细胞中更小分子成像的需求。为了实现荧光光学显微成像分辨率的提升以满足对分子结构物质的超分辨成像要求,众多超分辨成像技术在近几十年来被陆续提出,其中基于点扫描的超分辨显微技术应用较为广泛。点扫描技术采用聚焦光斑激发样品,聚焦光斑在样品面上扫描实现扫描成像,再利用点激发的样品面与探测面针孔的共轭关系,实现分辨率的提升。然而目前基于点扫描的超分辨荧光显微成像技术在应用上依然存在一定的缺陷,最核心的问题在于成像分辨率依然有限,还包括分辨率与信噪比的相互制约关系、样品的普适性、信息参量单一、成像速度慢等问题。本文围绕对探测光场的时空调制,以并行探测技术和受激辐射损耗(STED)技术作为出发点,旨在实现成像分辨率的提升,简化超分辨成像系统,同时利用荧光信息的多参量特质,获得荧光的时间信息,从另一个维度实现超分辨成像系统的升级。主要的工作和创新点如下:1、提出了基于并行探测空间调制的超分辨显微成像技术,对成像扫描显微成像技术进行深入的理论研究,利用并行探测实现对探测路的光场空间调制,结合像素重组算法和荧光差分技术,同时利用荧光饱和非线性获得成像的高频信息,实现分辨率接近2倍的提升。另一方面,仅使用单路光束即可实现荧光差分成像,优化荧光差分成像系统。2、提出了一种基于并行探测实现快速寿命成像的方法,利用探测器阵列和时间相关单光子计数器(TCSPC)阵列对荧光光子进行接收和计数,获取时间信息,利用阵列探测缓解了探测器和TCSPC的光子探测堆积效应,将寿命成像速度至少提高了 3倍,同时将像素重组技术与寿命成像技术相结合,提升了寿命成像的成像分辨率;将分光谱技术与并行探测技术相结合可以将成像速度进一步的提升一个量级。3、搭建了一套基于自适应光学的STED超分辨成像系统,利用空间光调制器(SLM)对损耗光路进行光学像差矫正,同时利用可变形镜对荧光光路进行光学像差矫正,实现了对探测光场的空间调制,进而实现了 STED成像质量的提升,为STED系统对生物样品进行深度成像提供了可能。4、在STED成像系统中,利用两个门控和延时电路即可获得荧光的寿命信息,实现时间调制;利用荧光寿命信息实现时间门控STED(time-gated STED)成像,提高STED成像的分辨率;同时提出了一种基于门探测的寿命光子重组STED成像技术,降低了 STED技术对损耗光功率的要求,缓解了 STED成像中光漂白对样品的影响。

关键词：超分辨显微成像技术荧光显微成像技术探测光场时空调制并行探测荧光寿命成像技术受激辐射损耗显微成像技术

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基于超分辨显微成像的无膜细胞器动态与功能研究

基于超分辨显微成像的无膜细胞器动态与功能研究

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作者：刘冲中国科学院大学

学位级别：博士

在真核细胞中，存在膜性细胞器或者无膜细胞器以及细胞骨架的“区室化”，不同功能的分子在区室中高效地进行生命活动。膜性细胞器如内质网、线粒体等以膜为平台通过不同的机理介导膜性细胞器之间和与细胞骨架之间的相互作用。无膜细胞... 详细信息

在真核细胞中，存在膜性细胞器或者无膜细胞器以及细胞骨架的“区室化”，不同功能的分子在区室中高效地进行生命活动。膜性细胞器如内质网、线粒体等以膜为平台通过不同的机理介导膜性细胞器之间和与细胞骨架之间的相互作用。无膜细胞器如应激颗粒、核仁等是由蛋白质、RNA等通过弱多价相互作用形成的“液-液”相分离(liquid-liquid phase separation，LLPS)聚集体。最近研究发现膜性细胞器会参与胞浆中无膜细胞器的生成，证明无膜细胞器与膜性细胞器之间存在物质信息交流。无膜细胞器内部与外界环境之间存在着广泛的物质交流，其异常将导致细胞代谢异常。对无膜细胞器动态和功能的研究将揭示无膜细胞器之间、无膜细胞器与膜性细胞器之间的物质信息交流规律以及无膜细胞器自身功能的稳态，对理解无膜细胞器在细胞功能异常和疾病发生中的作用具有重要意义。　　本论文利用3D-结构照明显微镜(3D-SIM)、掠入射结构照明显微镜(GI-SIM)、晶格光片显微镜(LLSM)等超分辨显微技术，结合细胞生物学、生物化学、高通量测序、蛋白质组学等生物学方法，研究了多种无膜细胞器之间、无膜细胞器与膜性细胞器之间的动态互作与功能，并取得以下生物学发现和进展:　　(a)本论文发现核斑定位的长链非编码RNA MALAT1含有成簇的m6A甲基化修饰，其作为脚手架将m6A修饰“阅读器”蛋白YTHDC1及其互作蛋白招募至核斑，对核斑的组分、形态及其与基因组DNA的相互作用起重要作用。核斑附近为活性转录区域，因此，核斑与基因组的互作影响数个关键的原癌基因和促进侵袭转移基因的表达，最终影响肿瘤细胞的侵袭转移能力。该研究揭示单一lncRNA的m6A修饰在调控基因表达中的功能，同时揭示了MALAT1m6A修饰在无膜细胞器动态和功能调控中的作用。　　(b)cGAS-STING通路是细胞抵御病原体侵染的重要天然免疫通路。cGAS感应胞浆中的DNA并与DNA形成相分离颗粒进而激活下游的信号通路。本研究发现，疱疹病毒间质蛋白ORF52、VP22等与DNA形成相分离颗粒，且病毒蛋白可与cGAS-DNA相分离颗粒相互作用，抑制后者的相分离颗粒，进而影响cGAS的酶活，抑制宿主细胞对疱疹病毒的天然免疫反应，获得病毒对宿主细胞的免疫逃逸。本研究首次从相分离的角度阐释了病毒蛋白抑制cGAS-STING天然免疫信号通路的保守机制，为宿主与病原的相互作用研究提供崭新的视角;此外，本研究拓宽了我们对无膜细胞器LLPS调控的认识和理解。　　(c)线粒体DNA与线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)通过LLPS形成线粒体拟核，线粒体拟核与线粒体嵴存在高度的动态，现有的荧光成像技术很难捕获拟核与线粒体嵴的动态互作。本研究利用新发展的DFCAN/DFGAN-SIM技术，观察线粒体嵴与线粒体拟核高度动态的相互作用，发现线粒体拟核存在融合和分裂的现象，且其融合和分裂与线粒体嵴的融合与断裂协同进行;类似于内质网，线粒体内膜也可以辅助无膜细胞器的融合或分裂。本研究首次观察到线粒体拟核的融合与分裂现象，以及与线粒体内膜的相互作用。　　(d)核仁是细胞核内的无膜细胞器，是核糖体DNA转录和核糖体组装的场所。最近研究表明核仁是核仁蛋白B23、Fibrillarin等与rRNA，及RNA PolⅠ转录复合物与rDNA通过LLPS形成多层生物大分子聚集体。本研究利用LLSM-SIM技术，通过活细胞成像实现有丝分裂过程中核仁解聚和重建的可视化。本研究发现，有丝分裂末期新核仁重建时，rDNA转录开始，RNA PolⅠ转录复合物首先形成核仁聚集体，随后Fibrillarin、B23被招募至核仁区对新转录的pre-rRNA进行加工;该部分工作仍需要进一步研究。　　(e)本论文还对细胞核内转录机器可视化与基因组标记方法进行了初步探索，进展如下:过表达MED1和RNA PolⅡ及内源性MED1荧光成像，可看到转录机器簇状分布;利用CRISPR-Imaging技术，分别在人源和鼠源细胞中，对基因组重复序列DNA标记，并对非重复序列的标记方法进行了探索，通过串联MS2-PP7扩大信号方法，实现对含有6个sgRNA重复的基因组位点的荧光标记，为实现非重复序列基因组位点的标记以及基因组的动态研究提供新的方案。

关键词：无膜细胞器超分辨显微成像技术互作机制生物学功能

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基于照明调控的移频超分辨光学显微方法研究

基于照明调控的移频超分辨光学显微方法研究

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作者：刘秋兰浙江大学

学位级别：博士

作为一种成像仪器,光学显微镜由于其分辨率高、成像速度快、样品无损、操作方便以及可实现特异性成像等优点,在材料、生物与医学成像中具有广泛的应用。然而由于受到光学衍射极限的影响,在可见光波段内,其横向与轴向分辨率被限制于200 n... 详细信息

作为一种成像仪器,光学显微镜由于其分辨率高、成像速度快、样品无损、操作方便以及可实现特异性成像等优点,在材料、生物与医学成像中具有广泛的应用。然而由于受到光学衍射极限的影响,在可见光波段内,其横向与轴向分辨率被限制于200 nm和500 nm左右。与此同时,随着材料学与生命科学的发展,对光学显微镜的分辨率提出了更高的要求。在过去的几十年里,科学家致力于光学显微技术分辨率的提升,经过不懈的努力终于开启了通往超分辨的大门。然而,任何一项技术的提出至其完善都有很长的路要走,各种超分辨显微成像技术亦如此。时至今日,为解决各种超分辨显微技术中存在的问题和不足,相关的研究仍在如火如荼的进行之中。本文基于照明调控实现移频,提高光学显微成像系统的分辨率进行了一系列的研究,根据相干与非相干光学显微成像系统的特点,各自提出了相应的突破衍射极限的理论与方法:对于相干成像系统通过引入大横向波矢的表面波照明;而对于非相干成像系统则采用非均匀照明法。全文对两者实现物体频谱的搬移进行了详细的理论分析与实验验证,并通过算法实现了各个频带的拼接与融合从而获得了系统通频带的扩展。此外,在实现二维超分辨成像的基础上,本文还对非相干成像中三维分辨率的提升进行了研究,实现了三维超分辨成像。本文的主要创新点如下:(1)在相干成像中,利用表面波(倏逝波与表面等离子体波)具有大的横向波矢的特点,提出了采用表面波进行照明的方法;结合傅里叶域层叠算法对各个方向获得的频带进行拼接融合,在无需参考光进行干涉的情况下,获得了约λ/3分辨率的非标记样品的超分辨强度与相位分布;同时利用表面等离子体波场增强的特性实现了图像对比度的提升。(2)针对相干成像中存在激光散斑的问题,提出了多角度环形扫描照明的方法,消除了激光散斑对成像质量的影响,获得了成像信噪比的提升。(3)在非相干成像中,利用条纹照明对样品进行非均调制,提出了一种新的条纹照明傅里叶域层叠显微成像方法,该方法通过更新光学传递函数可实现系统的数字像差校正,并具有较好的抗噪鲁棒性;在实现超分辨成像的同时,时间分辨率达0.5 fps,可实现生物样品的活体成像。(4)在非相干成像中,设计了一套基于扫描振镜的双对置物镜架构I5S三维结构照明超分辨显微镜,实现了相对于传统光栅型结构照明系统的成像速度、以及相对于空间光调制器型结构照明系统的光能利用率两者的同时提升;将荧光饱和效应应用于该I5S的三维成像之中,获得了横向和轴向均约为λ/9的三维成像分辨率。

关键词：超分辨显微成像技术照明调控移频表面波非均匀照明

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基于VSPI算法的STORM超分辨图像重构研究

基于VSPI算法的STORM超分辨图像重构研究

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作者：熊佳深圳大学

学位级别：硕士

受光学系统衍射极限的影响,传统的光学显微镜无法分辨尺寸小于200 nm的生物结构。为了突破光学衍射极限,超分辨显微成像技术应运而生。近年来出现的超分辨成像技术可分为基于受激辐射损耗的显微成像技术、基于频域调制的结构光照明显微... 详细信息

受光学系统衍射极限的影响,传统的光学显微镜无法分辨尺寸小于200 nm的生物结构。为了突破光学衍射极限,超分辨显微成像技术应运而生。近年来出现的超分辨成像技术可分为基于受激辐射损耗的显微成像技术、基于频域调制的结构光照明显微成像技术以及基于单分子定位的超分辨显微成像技术等,为研究尺寸在衍射极限之下的生物目标提供了强有力的手段,迅速引起研究者的极大关注。随机光学重构显微成像技术(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)作为单分子定位超分辨成像技术之一,通过调控荧光染料分子的开关态,定位精度可以达到20 nm,可实现超高的空间分辨率。在该成像技术中,除需要可以光致闪烁的新型荧光探针外,图像重构算法在高分辨图像数据的后处理中发挥重要作用。传统的单分子定位超分辨重构算法要求光学探针分子低密度标记目标,避免荧光探针分子的光斑重叠,这需要采集数千帧闪烁图像才能重构一副超分辨图像,图像采集和重构时间均较长,导致超分辨成像时间分辨率低,在活细胞超分辨成像应用中存在困难;针对该问题发展的多分子定位分析算法,可以进行多高斯拟合分析光斑重叠的数据,但当探针标记密度过高,达到多分子定位分析算法的所能处理的标记密度上限时,不仅无法获得理想的重构图像,图像分辨率反而会降低,限制了活细胞动态过程的超分辨成像。为了解决上述问题,研究人员先后开发了多种高密度数据的定位算法,但目前均还未成熟。本论文针对STORM超分辨图像的预处理算法开展了相关研究工作,将一种基于调制图像与虚拟图像的积分值等价关系的预处理算法,即虚拟单像素成像(virtual single pixel imaging,VSPI)算法应用到STORM数据预处理当中,该算法可以将荧光分子标记密度过高、间距过小(100 nm)的重叠光斑数据进行稀疏化预处理,然后结合多分子定位算法进行图像重构,比传统的K因子算法预处理并采用相同重构算法的结果更优。进而,将VSPI算法用于新型STORM荧光探针的闪烁数据预处理,结合现有的超分辨图像重构算法,开展活细胞线粒体超分辨图像重构研究,在保证空间分辨率不变的前提下通过提高标记密度减少图像的采集帧数,从而达到提高成像时间分辨率的目的,为活细胞的超分辨成像研究提供了一种有效工具。本论文的主要工作包括:1.将VSPI预处理算法用于高密度STORM超分辨数据的稀疏化预处理。首先将仿真数据和荧光珠实验数据用VSPI处理,验证其稀疏化处理效果,结果表明其处理效果优于K因子算法;其次,将VSPI算法与多分子定位算法Thunder STORM结合,用于分析仿真实验数据和固定细胞实验数据,并比较VSPI算法对数据进行预处理前后的超分辨重构结果,定量分析不同密度数据重构的超分辨结果的差异,为进一步将VSPI算法应用到活细胞数据处理当中做好准备。2.研究新型STORM荧光探针的光物理性质(包括吸收、发射光谱)、光致闪烁性质(包括饱和激发功率、平均闪烁时间、占空比、抗漂白性等)和细胞特异性标记,然后将其作为活细胞线粒体的STORM探针,采集活细胞STORM超分辨成像数据,为VSPI预处理算法提供活细胞数据支持。3.将VSPI算法用于活细胞实验数据处理,并用于多分子定位算法FALCON超分辨重构,并与未进行预处理的重构结果对比,研究VSPI算法在活细胞STORM超分辨成像中的应用。

关键词：超分辨显微成像技术随机光学重构显微成像技术虚拟单像素成像算法活细胞超分辨成像

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近代显微成像技术的研究进展与应用

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中国医疗设备 2018年第2期33卷 107-110页

作者：狄伶上海交通大学分析测试中心上海200240

本文简述显微成像技术的发展历史,介绍荧光成像、共聚焦显微成像和超分辨显微成像技术的工作原理及应用。超分辨显微成像技术中主要介绍受激发射损耗技术。随着计算机技术和光电技术的飞速发展,新一代显微成像技术对活细胞微观生命活动... 详细信息

本文简述显微成像技术的发展历史,介绍荧光成像、共聚焦显微成像和超分辨显微成像技术的工作原理及应用。超分辨显微成像技术中主要介绍受激发射损耗技术。随着计算机技术和光电技术的飞速发展,新一代显微成像技术对活细胞微观生命活动实现了分子和离子水平的形态定位、实时动态观察、三维结构重组、荧光定量分析和四维动态分析。

关键词：显微成像技术共聚焦显微镜受激发射损耗超分辨显微成像技术

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