检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：包正玉扬州大学

学位级别：硕士

A型塞内卡病毒（SenecavirusA,SVA）是近年来出现的引起猪特发性水疱性疾病的新病原体,属于小核糖核酸病毒科塞内卡病毒属。SVA主要感染猪,其特征性症状为口腔、蹄冠等全身多个组织器官出现水疱和溃烂,仔猪的死亡率高达30%-70%。自2015... 详细信息

A型塞内卡病毒（SenecavirusA,SVA）是近年来出现的引起猪特发性水疱性疾病的新病原体,属于小核糖核酸病毒科塞内卡病毒属。SVA主要感染猪,其特征性症状为口腔、蹄冠等全身多个组织器官出现水疱和溃烂,仔猪的死亡率高达30%-70%。自2015年中国广东首次爆发SVA疫情以来,目前已在我国山东、河南、黑龙江、湖北、四川、广东等多个省份相继出现SVA感染的病例。然而,国内外对其流行病学和发病机制的研究有限。鉴于此,本研究首先分离了 2株SVA并完成了其全基因组测序。基于新分离的2株毒株和收集的218条SVA毒株进行了基因分型、毒株进化以及群体规模的分析,这在一定程度上为研究SVA的流行病学特点提供重要的理论参考。进一步,通过猪体攻毒试验得出2株SVA分离株都能成功感染猪只并引起猪体温升高、跛行、鼻唇部和蹄部的水疱、溃疡等SVA的典型临床症状。最后,采用SVA复制子技术结合定点突变发现 L 蛋白的（H42A、Q79A）突变和（△5H、△20G、△34N、△42H、△56R）缺失都可明显抑制报告基因的表达,表明SVAL蛋白对病毒的转录翻译具有重要影响。本研究首次揭示SVAL蛋白具有调控病毒转录和翻译的功能。1.A型塞内卡病毒的分离鉴定及遗传进化分析2020年广西某猪场部分猪只精神萎靡、食欲不振、口唇及蹄部发生水疱、糜烂等临床症状,疑似为SVA感染。为了确定该病的病原体,采取病变部位的水疱皮和水疱液进行RT-PCR检测,2份均为SVA阳性。将SVA阳性的病料研磨、无菌处理后接种生长良好的ST-R细胞进行病毒分离并通过IFA和WB进行鉴定,对鉴定正确的SVA毒株进行全长基因组扩增、测序和拼接,拼接完成后的毒株分别命名为GX84/2020（GenBank:MW117126）和 GX94/2020（GenBank:MW117127）。病毒生长曲线和蚀斑试验显示两个分离株具有相似的生长特性。将GX84/2020和GX94/2020毒株与GenBank收录的218株全长SVA毒株进行基因分型和遗传进化特点分析。基因分型分析结果表明,SVA毒株主要分为两个基因型,Ⅰ型毒株来自1989-2006年,Ⅱ型毒株来自2007-2020年,GX84/2020和GX94/2020属于基因Ⅱ型。遗传进化分析表明,SVA具有随时间进化的特点,且SVA种群历史规模可分为三个阶段:1986-2010年,保持相对稳定;2010-2017年,明显上升态势;2017年以后,出现下降。GX84/2020和GX94/2020毒株属于第三阶段。2.A型塞内卡病毒分离株的致病性分析为了确定广西SVA分离株的致病性,将12头8-10周龄健康仔猪分为三组,即PBS对照组、GX84/2020和GX94/2020感染组,每组4只,进行猪体攻毒试验。结果表明,攻毒组8头猪临床病变程度呈现差异,但均表现出SVA的一种或多种典型症状。其中,GX84/2020组的2头猪表现出现相对严重的临床症状,包括体温升高、鼻唇部的水疱、蹄部水疱和溃疡、以及蹄壳破裂进而重度跛行等,而另外2只猪症状比较轻微,仅观察到发热和蹄部肿胀。相比之下,GX94/2020感染组的猪临床症状比较轻微,除了发热和食欲不振之外,1头猪吻突出现肿胀、水疱;1头猪蹄部趾间肿胀;另外2头猪蹄部溃疡结痂。除此之外,还监测了 0-14天猪鼻拭子排毒量与血清中和抗体水平的变化。鼻拭子排毒结果显示,在攻毒后的第3天,鼻拭子中检测到病毒脱落,第7天达到脱落水平的峰值。中和抗体结果显示,在感染后的第5天开始检测到中和抗体,第5天以后中和抗体滴度上升加快,第7天开始缓慢上升,直至第14天中和抗体仍然存在。值得注意的是,中和抗体滴度在第7天出现上升拐点,正好与鼻拭子病毒在体内消失的时间一致。3.A型塞内卡病毒L蛋白的功能分析L蛋白（先导蛋白）是SVA编码的第一个蛋白,由于其蛋白序列在小RNA病毒中高度变异,功能也极不保守,所以目前对于它在SVA病毒整个生命活动中所发挥的功能还不明确。本研究在SVA感染性克隆pC3-SVA-GD05的基础上,首先将L蛋白进行H5A、H42A、R56A、Q79A 氨基酸突变和△5H、△20G、△34N、△42H、△56R、△69Q氨基酸缺失,然后进行病毒拯救并测定病毒滴度。结果表明△42H、△56R、Q79A对病毒致死;H42A、△20G病毒滴度降低了 5个数量级,对病毒严重致弱;H5A、△5H、△34N、△69Q病毒滴度降低了 2个数量级;R56A病毒滴度降低1个数量级。为了进一步确定L蛋白的作用,本研究建立了 SVA病毒亚基因组复制子并将L蛋白突变和缺失,进而研究L蛋白对病毒复制和转录翻译的影响。研究结果表明,H42A和Q79A突变后SVA复制子细胞内复制产生的RNA 水平降低,说明L蛋白突变影响了病毒复制。L

关键词： A型塞内卡病毒生物信息学致病性复制子转录和翻译

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小麦谷氨酰胺合成酶基因克隆及其苗期表达调控

小麦谷氨酰胺合成酶基因克隆及其苗期表达调控

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作者：李高飞河南农业大学

学位级别：硕士

氮素利用效率取决于氮素的吸收、同化和转移再利用过程。小麦生长发育过程中谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase)与氮代谢的过程密不可分。GS2参与氮素同化,GS1与氮素的转移再利用密切相关。氮素形态影响GS同工酶的表达调控,影响其在... 详细信息

氮素利用效率取决于氮素的吸收、同化和转移再利用过程。小麦生长发育过程中谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase)与氮代谢的过程密不可分。GS2参与氮素同化,GS1与氮素的转移再利用密切相关。氮素形态影响GS同工酶的表达调控,影响其在氮素吸收、同化及转移再利用的作用。因此克隆小麦GS基因,研究氮素形态对GS表达的影响,必将为通过转基因技术或优化氮素运筹措施提高氮素利用具有重要意义。具体研究内容如下:根据不同植物GS同工酶基因保守区序列设计引物,通过RT-PCR获得了小麦GS1和GS2同源序列;在此基础上,利用RACE技术获得了小麦GS1和GS2的全长cDNA序列。序列分析显示小麦GS1 cDNA全长为1494bp,其中5′UTR长74bp,3′UTR长349bp,ORF长1071bp,可编码356个氨基酸。小麦GS2的cDNA全长为1631bp,其中5′UTR为104bp,3′UTR为243bp,ORF长1284bp,可编码427个氨基酸。利用砂基水培试验,研究了氮素形态对小麦苗期叶片和根系生长发育过程中GS同工酶在转录和翻译水平的变化动态,以及GS活性、可溶性蛋白含量的动态影响。在叶快速伸长期,叶GS1-mRNA和GS2-mRNA大量转录,Native-PAGE结合活性染色在叶片分离到3种GS同工酶:GS同工酶活性:GS2>GS1>GSx;western-blot结果显示叶片具有44kD的GS2亚基和39kD的GS1亚基,亚基含量GS2>GS1。在叶片定长期,GS1-mRNA和GS2-mRNA转录减少;GS2和GSx活性增强,GSx活性较强几乎与GS2相似;GS1活性降低明显,活性表现为GS2>GSx>GS1;叶片GS1亚基含量降低,GS2亚基含量增加;GS活性和可溶性蛋白含量增加。叶片衰老期过程中,GS1-mRNA大量转录,GS2-mRNA转录停止;GS1同工酶活性增强,GS2和GSx活性降低明显,活性表现为GS1>GSx>GS2;GS活性略有增加,可溶性蛋白含量下降。在叶片生长发育过程中,根系GS1-mRNA含量无明显改变;根系仅分离到GS1,其活性在叶片定长期很弱;根系仅有39kD的GS1亚基表达,亚基表达趋势变化与同工酶活性变化趋势一致;根系GS活性无明显变化,在叶片衰老时略有降低。在叶片定长期,根系可溶性蛋白含量较低。无论是酶活性还是亚基表达以及可溶性蛋白,叶片比根系都要高得多。氮素形态对叶片和根系GS亚基的表达影响明显。硝态氮能诱导叶片快速伸长期GS2-mRNA和GS2同工酶的表达,抑制衰老期GS2的表达同工酶;硝态氮促进叶片保持较高的GS活性,但叶片可溶性蛋白含量较低。铵态氮能够促进根系GS1-mRNA的转录,在叶片快速伸长期使根系GS1亚基表达。在叶片定长期尿素促使根系GS1亚基表达。氮素形态对根系GS活性、可溶性蛋白含量影响不明显。

关键词：小麦谷氨酰胺合成酶氮素形态转录和翻译动态影响

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A型塞内卡病毒的演化分析及其L蛋白的功能研究

A型塞内卡病毒的演化分析及其L蛋白的功能研究

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作者：姬永琛扬州大学

学位级别：硕士

A型塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）是小RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员,近年来被鉴定为猪特发性水疱病（Porcine idiopathic vesicular disease,PIVD）的病原体。SVA主要感染各个年龄段的猪,引起皮肤、口鼻部和冠状动脉带上的水疱... 详细信息

A型塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）是小RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员,近年来被鉴定为猪特发性水疱病（Porcine idiopathic vesicular disease,PIVD）的病原体。SVA主要感染各个年龄段的猪,引起皮肤、口鼻部和冠状动脉带上的水疱和糜烂等特征性症状,尤其1～4日龄的仔猪可出现急性死亡,死亡率可达30%～70%。SVA早期在美国、英国、澳大利亚、意大利等国家零星爆发,因当时并未查明病因,未能引起养猪业的足够重视。直至2014年末2015年初,SVA在巴西多个区域的养猪场暴发,随后形成全球流行的态势,主要分布在北美洲、南美洲、欧洲、亚洲等地区,对全球养猪业造成了较大的经济损失。现如今,中国超过半数的省市都已有SVA感染的相关报道。尽管SVA是在20年前发现的,但关于SVA的演变和传播历史仍不十分清晰。因此,本研究对SVA的重组、系统发育、自然选择和演化动力学进行了综合分析,以说明SVA的起源、演化和时空格局。 L蛋白作为SVA基因组编码的第一个蛋白,与其他小RNA病毒的L蛋白差异性较大,且高度可变。口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus,FMDV）、脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus,EMCV）等的L蛋白是一种多功能蛋白,可发挥拮抗宿主抗病毒反应、抑制应激颗粒的组装等多种关键的生物学功能。然而,因L蛋白巨大的序列差异性,目前还不清楚SVA L蛋白的生物学功能。因此,本研究利用原核表达系统和细胞融合技术制备了L蛋白的单克隆抗体,为L蛋白的功能研究提供强有力的免疫学工具。此外,进一步对SVA感染性克隆质粒L蛋白中相对保守的氨基酸位点进行突变,并利用复制子技术对L蛋白的功能进行初步探究。 1.A型塞内卡病毒的演化分析为更进一步了解SVA的演化特征以及传播历史,本研究对其进行了综合分析,包括重组检测、系统发育、选择分析、演化动力学和系统地理学分析。选用下载的238株SVA全基因组序列进行重组检测,共鉴定出5株重组毒株且均来自于中国。去除重组毒株后,利用贝叶斯推断（BI）法进行系统发育分析表明,SVA分为两个主要分支:分支Ⅰ（2007年之前的毒株）和分支Ⅱ（2007年之后的毒株）,遗传距离为0.0713±0.0030。进一步分析SVA分支Ⅰ和分支Ⅱ的遗传多样性,发现共存在544个特异性氨基酸替代,77个Shannon熵差异位点,表明两个分支间存在明显的演化差异。选择压力分析发现,SVA的绝大多数位点处于负选择,仅存在27个正选择位点,表明正选择和负选择共同驱动SVA的演化。SVA演化动力学分析的结果显示,SVA的最近共祖时间（TMRCA）为1986年（分支Ⅰ和Ⅱ的TMRCA分别为1986和2004年）,全基因组的演化速率是3.3522×10-3核苷酸替代每位点每年（nucleotide substitutions/site/year）。群体历史规模分析表明,SVA的有效种群数量呈逐渐增加的趋势,在2017年之前略有波动,随后急剧下降。值得注意的是,系统地理学分析推断巴西可能是2015年以来SVA全球传播的源头。总之,这些数据为SVA演变和传播历史的基本理解提供了新的思路。 2.A型塞内卡病毒L蛋白的单抗制备和功能研究单克隆抗体可作为有力的免疫学研究工具。本研究针对SVA L蛋白全长进行原核表达,并纯化得到L重组蛋白免疫原。将重组蛋白免疫小鼠,随后经细胞融合、IFA筛选和亚克隆得到一株分泌L蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为36-B3。将其扩大培养并注射小鼠腹腔,大量制备L单抗腹水。后续的生物学鉴定结果表明,该单克隆抗体适用于IFA试验以及外源性L蛋白的Western Blot检测。此外,利用L单克隆抗体进行亚细胞定位发现,SVA L蛋白主要定位于内质网中。 L蛋白序列在小RNA病毒科中的巨大差异性提示其功能保守性较差,而目前尚不清楚SVA L蛋白在其生命周期中发挥的具体功能。本研究首先对小RNA病毒中部分的L蛋白氨基酸序列进行比对,选取了13个相对保守位点。在SVA感染性克隆质粒（pC3-SVA-GD05）的基础上对L蛋白的这些位点进行突变,随后拯救病毒并测定其滴度。结果发现,唯有SVA L蛋白（L70A）突变使病毒致死,而其余突变位点对病毒滴度的影响较小。为进一步探究L蛋白的功能,选取了本实验室先前发现的使病毒致死或使病毒滴度明显减弱的突变和缺失位点（H42A、Q79A、Δ42H、Δ56R）以及本研究中发现的L70A突变位点替换到SVA复制子质粒（SVA-GD05-Rep）中,进行荧光定量PCR以及双荧光素酶报告基因检测,以研究L蛋白突变或缺失对于SVA复制和转录翻译的影响。结果表明,SVA L蛋白突变（H42A、

关键词： A型塞内卡病毒演化分析 L蛋白单克隆抗体转录和翻译

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谈谈真核生物与原核生物的基因表达过程的区别于共同点

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东西南北·教育 2014年第12期 124-124页

作者：尊追西藏日喀则地区第一高级中学

高中生物教学中原核生物和真核生物有关的知识既是面广又是琐碎，学生对这一方面的知识的掌握情况很不透彻，而且是高考当中每年都涉及相关知识点的基础知识的考察，是很重要考点，尤其是基因表达的过程本来内容很抽象，再加上不同细胞... 详细信息

高中生物教学中原核生物和真核生物有关的知识既是面广又是琐碎，学生对这一方面的知识的掌握情况很不透彻，而且是高考当中每年都涉及相关知识点的基础知识的考察，是很重要考点，尤其是基因表达的过程本来内容很抽象，再加上不同细胞中基因的结构及表达过程具有相同之处也有一定的区别，之所以学生对这一方面的知识的掌握难上加难。在真核生物体细胞和原核生物体细胞内基因的表达知识由系统性的总结和讨论，学生对真核原核细胞的基因表达的知识够正确的认识和了解有所帮助。

关键词：原核细胞真核细胞基因表达 mRNA DNA 转录和翻译

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真核生物与原核生物基因表达过程的区别与共同点

引用

学园 2014年第31期7卷 129-129页

作者：遵追西藏日喀则地区第一高级中学

高中生物教学中原核生物和真核生物涉及的知识面广且琐碎，学生对这一方面知识的掌握情况很不理想，而且是高考当中重点考查点，尤其是基因表达过程的内容很抽象，因此，本文着重探讨了细胞中基因的结构及表达过程的相同之处与区别。

关键词：原核细胞真核细胞基因表达 mRNA DNA 转录和翻译

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