本文拟在我国分离到的SINV基础上，建立能特异性检测该病毒核酸的SYBR GREEN I荧光定量PCR检测方法，并初步应用于我国部分地区采集到的病毒性脑炎/不明原因发热病人临床标本和媒介蚊标本的检测，同时以常规RT-PCR检测方法作为对照以对...
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本文拟在我国分离到的SINV基础上，建立能特异性检测该病毒核酸的SYBR GREEN I荧光定量PCR检测方法，并初步应用于我国部分地区采集到的病毒性脑炎/不明原因发热病人临床标本和媒介蚊标本的检测，同时以常规RT-PCR检测方法作为对照以对新方法进行评价，了解SINV在我国部分地区疑似病人及媒介蚊中的流行和分布状况，为将来临床标本和媒介蚊标本中sINV的早期快速检测和调查SINV在我国的流行情况提供新的技术手段。
一、辛德毕斯病毒荧光PCR检测方法的建立。根据SINV基因组核苷酸序列特性设计引物。病毒在BHK-21细胞上繁殖扩增后提取RNA和逆转录。以病毒cDNA为模板分别进行SYBR GREEN I荧光PCR和常规RT-PCR扩增，并对SYBR GREEN I荧光PCR法的灵敏性、特异性、重复性等进行分析。结果最适退火温度为55℃，最适引物浓度为0.5μmol/L。用该方法检测2株SINV株YN87448和XJ160结果均为阳性，而对其他虫媒病毒如甲病毒属Geta病毒、乙脑病毒、Batai病毒、Seadoma病毒、环状病毒及西方马脑炎病毒合成模板检测时结果均为阴性。根据病毒空斑形成实验结果，将YN87448病毒悬液进行连续10倍稀释后，分别用常规PCR和SYBRGREEN I荧光PCR方法进行检测，可见SYBR GREEN I荧光PCR检测敏感性比常规PCR方法高近100倍，检出下限可达0.1PFU/mL。利用4个不同模板浓度样品分别进行5次检测以进行稳定性分析，对Ct值进行统计学分析，得到各样品Ct变异系数均<5％。
二、辛德毕斯病毒荧光PCR检测方法的初步应用。
1.模拟感染血清标本和部分临床脑脊液(CSF)标本的检测应用新建立的方法对模拟感染的人血清标本和7份临床CSF标本进行检测，根据Ct值及熔解曲线分析，结果可见标本中其他成分对检测体系无明显影响，对结果判定无干扰。
2.辛德毕斯病毒荧光PCR检测方法在检测临床标本中的应用用新建立的荧光PCR方法及常规RT-PCR检测方法对2003～2005年间在云南和河南4所医院中采集的248份病毒性脑炎或不明原因发热病人的临床CSF/血清标本进行了检测。结果云南大理州107份标本中，荧光PCR检测7份为阳性，其中3份为病毒性脑炎病人血清标本，4份为不明原因发热病人血清标本，RT-PCR检测6份阳性(经测序证实为SINV，包括在荧光PCR检测阳性结果中);西双版纳州97份标本中，荧光PCR检测17份为阳性，其中3份为病毒性脑炎病人CSF标本，14份为不明原因发热病人血清标本，RT-PCR检测1份阳性(包括在荧光PCR检测阳性结果中);云南昆明、河南郑州医院中采集的疑似病人标本未检出SINV。
3.辛德毕斯病毒荧光PCR检测方法在检测蚊虫标本中的应用用新建立的SINV荧光PCR检测方法及常规RT-PCR检测方法对我国云南、四川、东北地区采集的106份(100只/份)蚊标本进行了检测。结果云南23份蚊标本中荧光PCR检测3份为阳性，RT-PCR检测1份阳性(经测序证实为SINV，包括在荧光PCR检测阳性结果中);四川49份蚊标本中荧光PCR检测4份为阳性，RT-PCR检测1份阳性(经测序证实为SINV，包括在荧光PCR检测阳性结果中);东北地区34份蚊标本中未检出SINV。
综上所述，本研究成功建立了SINV特异性核酸的SYBR GREEN I荧光PCR检测方法，实验结果显示了较好的灵敏性、特异性和广谱性。将新建立的方法初步应用于我国部分地区采集的疑似病人临床标本和蚊标本中的SINV检测，结果云南省大理州和西双版纳州的脑炎病人，尤其是不明原因发热病人标本中检测到多份SINV阳性，说明云南省存在SINv的流行，SINV可能为引起不明原因发热的重要病原体之一;从云南地区蚊标本中检出了SINV特异性核酸，这与既往文献报道云南省曾发现SINV在媒介蚊群中流行一致，四川地区蚊标本中检出SINV特异性核酸，提示这些地区人群中可能存在SINV的潜在感染。两种PCR检测方法比较可看出，新建立的SINV荧光PCR检测方法比常规RT-PCR方法操作简便、快速、检测灵敏度更高，可替代常规RT-PCR方法对SINV进行检测，方法可较好的应用于疑似病人临床标本及蚊虫标本的检测。本研究为今后SINV的临床检测和我国SINV的流行监测与预防控制提供了技术储备。
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