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大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体及在乳鼠心肌细胞中的表达

中国组织工程研究 2012年第33期16卷 6152-6157页

作者：侯宁袁文常罗承锋刘启才罗健东广州医学院药理学教研室广东省广州市510182 广州心血管疾病研究所广东省广州市510260 解放军兰州军区乌鲁木齐总医院全军临床检验诊断中心新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830000 广州医学院实验医学研究中心广东省广州市510182

背景:过氧化物酶体增生因子活化受体α是调节心脏脂肪酸氧化的重要核转录因子,利用基因工程技术构建其重组腺病毒载体对研究心脏能量代谢障碍机制具有重要意义。目的:构建大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体,评价其... 详细信息

背景:过氧化物酶体增生因子活化受体α是调节心脏脂肪酸氧化的重要核转录因子,利用基因工程技术构建其重组腺病毒载体对研究心脏能量代谢障碍机制具有重要意义。目的:构建大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体,评价其在原代培养的乳鼠心肌细胞中的表达效率。方法:采用RT-PCR法自SD大鼠肝脏扩增过氧化物酶体增生因子活化受体α基因,将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒载体pAd-Track-CMV。线性化重组穿梭质粒载体并转化入含有腺病毒骨架质粒pAd-Easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。用脂质体将线性化的重组腺病毒载体质粒转染于人胚肾293细胞以包装、扩增,纯化病毒后计算滴度。用纯化的重组腺病毒转染心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率;荧光定量PCR、免疫印迹法检测细胞过氧化物酶体增生因子活化受体αmRNA、蛋白表达。结果与结论:成功构建携带大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为3.5×1011pfu/L。重组腺病毒转染心肌细胞的效率达90%以上,被转染细胞目的基因mRNA、蛋白表达显著增高。该载体的成功构建为研究过氧化物酶体增生因子活化受体α基因在心肌能量代谢障碍中的作用奠定基础。

关键词：过氧化物酶体增生因子活化受体α 重组腺病毒心肌细胞转染能量代谢基因治疗

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瘦素诱导心肌细胞肥大的机制研究

瘦素诱导心肌细胞肥大的机制研究

引用

作者：侯宁广州医学院

学位级别：博士

【背景】肥胖是高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭等多种心血管疾病发生发展的重要危险因素。瘦素(Leptin)是ob基因编码的产物,由脂肪细胞分泌入血,调节食欲和能量代谢。数项研究显示在体外瘦素能够直接作用于原代培养的新生大鼠心肌细胞... 详细信息

【背景】肥胖是高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭等多种心血管疾病发生发展的重要危险因素。瘦素(Leptin)是ob基因编码的产物,由脂肪细胞分泌入血,调节食欲和能量代谢。数项研究显示在体外瘦素能够直接作用于原代培养的新生大鼠心肌细胞和血管平滑肌细胞,诱导心肌细胞和平滑肌细胞肥大。我们之前的研究也证实在原代培养的新生大鼠心肌细胞,瘦素能够刺激内皮素-1(Endothelin-1, ET-1)分泌,并通过ET-1诱导心肌细胞肥大和细胞内氧活性物质(Reactive oxygen species, ROS)产生。但是,由于ETA受体拮抗剂ABT-627未能完全阻断瘦素诱导的心肌细胞肥大和ROS产生,这就提示仍然存在其他通路介导瘦素的作用。过氧化物酶体增生因子活化受体α(Peroxisome proliferator-activated receptorα, PPARα)在线粒体脂肪酸氧化丰富的组织如心脏,肝脏,骨骼肌等呈高水平表达。PPARα主要影响脂肪酸氧化(Fatty acid oxidation, FAO)循环中3个关键步骤所涉及的基因表达:脂肪酸摄取/酯化,脂肪酸线粒体转运和线粒体β-氧化。最近的研究认为,PPARα作为心脏脂肪酸氧化的关键调控基因,决定了心脏功能障碍发展过程中的能量底物利用转换。动物实验研究发现,由STZ诱导的糖尿病模型和肥胖db/db小鼠,其心脏PPARα活性均明显增高;心脏过度表达PPARα(MHC-PPARα)导致糖尿病样的心肌肥厚。同时,一些临床研究也显示心力衰竭病人心脏脂肪酸摄取增加;终末期舒张性心肌病的病人,其心脏PPARα表达增高,脂肪酸代谢速率增加。尽管PPARα的外源性配体贝特类药物作为降血脂药物在临床上广泛应用,但根据FDA的报告,目前已经有50多种PPAR激动剂由于其心脏毒性等多种毒性作用而被终止使用。这些研究提示PPARα活化诱导的脂肪酸利用上调及对糖代谢的抑制作用能够引起心肌重构,造成严重的心肌病。瘦素,作为PPARα的内源性激动剂,在肝脏、脂肪组织等多种细胞和组织中通过活化PPARα调节能量代谢。因此,我们假设PPARα活化参与了瘦素诱导的心肌细胞肥大。本文用原代培养的新生大鼠心肌细胞进行实验,第一部分主要探讨PPARα活化与心肌细胞肥大的关系;第二部分研究PPARα活化在瘦素诱导心肌细胞肥大中的作用;并从分子水平研究瘦素对PPARα表达的调节作用及具体机制,初步探讨瘦素对心肌细胞脂肪酸代谢的调控作用及相关机制,从而为心肌肥大的机制研究提供新的思路和线索。第一部分PPARα活化与心肌肥大目的探讨PPARα活化与心肌细胞肥大的关系方法用原代培养的新生大鼠心肌细胞进行实验。构建腺病毒载体Ad-CMV-PPARα上调PPARα表达。分别用6.25-100μmol/L PPARα激动剂非诺贝特和腺病毒载体Ad-CMV-PPARα孵育心肌细胞,检测总RNA、胚胎型基因mRNA表达、蛋白合成速率和心肌细胞表面积等心肌肥大指标;同时用上述干预因素处理细胞,ROS敏感的荧光探针DCF-DA检测心肌细胞ROS含量的变化。结果 1. PPARα激动剂非诺贝特(6.25-100μmol/L)能够浓度依赖性的增加心肌细胞总RNA含量;上调心肌细胞胚胎基因ANF mRNA表达;增加心肌细胞蛋白合成速率和心肌细胞表面积(6.25μmol/L组P>0.05,其余全部P<0.05); 2.腺病毒载体Ad-CMV-PPARα特异性诱导心肌细胞PPARα持续高表达,能够上调心肌细胞胚胎基因ANF mRNA表达;增加细胞表面积和蛋白合成速率(P<0.05); 3. PPARα激动剂非诺贝特(6.25-100μmol/L)能够浓度依赖性的诱导心肌细胞DCF-DA荧光强度增加(6.25μmol/L组P>0.05,其余全部P<0.05); 小结 1.心肌细胞PPARα过度活化诱导心肌细胞肥大。 2.心肌细胞PPARα过度活化诱导心肌细胞ROS产生。第二部分PPARα活化介导瘦素诱导的心肌细胞肥大目的 1.研究PPARα活化是否介导瘦素诱导的心肌细胞肥大; 2.探讨瘦素对PPARα表达的调节作用及具体机制。方法 1.分别用PPARα拮抗剂GW6471(0.01-10μmol/L)和RNAi方法抑制心肌细胞PPARα表达。GW6471(0.01-10μmol/L)与瘦素(100 ng/mL)共同孵育细胞 72小时,检测总RNA、总蛋白、胚胎型基因mRNA表达、蛋白合成速率和心肌细胞表面积等心肌肥大指标变化;PPARαsiRNA转染后再

关键词：瘦素过氧化物酶体增生因子活化受体α 心肌肥大

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