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胞质分裂作用因子4过表达慢病毒载体的构建和稳定转染Neuro-2a细胞的建立

吉林大学学报（医学版） 2024年第5期50卷 1322-1329页

作者：李胜男何嘉文廖科棋李友广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室广东湛江524002 广东医科大学附属医院神经病学研究所广东湛江524002

目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限... 详细信息

目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶酶切后,将其与酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-DOCK4过表达重组质粒,PCR法鉴定筛选出与目的基因片段长度大小相近的阳性克隆。将GV492-对照质粒和GV492-DOCK4过表达重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-对照组和GV492-DOCK4组,分别采用GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后采用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))筛选出成功感染GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞生长状态及绿色荧光蛋白表达情况;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA和DOCK4蛋白表达水平。结果:PCR检测,GV492-DOCK4过表达重组质粒的基因片段长度约为691 bp,测序结果显示GV492-DOCK4过表达重组质粒基因序列与设计合成的DOCK4过表达序列一致;GV492-对照组和GV492-DOCK4过表达组慢病毒的滴度分别为2.5×10^(8) TU·mL^(-1)和2.5×10^(8) TU·mL^(-1);荧光显微镜观察,各组Neuro-2a细胞生长状态良好且存在绿色荧光蛋白表达;RT-qPCR法检测,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);Western blotting法检测,各组细胞在相对分子质量225000附近出现特异性条带,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:本研究成功构建DOCK4过表达慢病毒载体,建立了稳定过表达DOCK4的Neuro-2a细胞。

关键词：胞质分裂作用因子4 过表达慢病毒载体 Neuro-2a细胞稳定转染过表达慢病毒

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GJB6基因突变体过表达慢病毒载体的构建及其在HaCaT细胞中的表达

GJB6基因突变体过表达慢病毒载体的构建及其在HaCaT细胞中的表达

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作者：姬灿灿山东大学

学位级别：硕士

目的：构建编码缝隙连接蛋白connexin30(Cx30)的致病基因GJB6及其3种突变体的慢病毒过表达载体,并分析其在人永生化角质形成细胞(HaCaT)中的表达。资料与方法：构建GJB6基因及其突变体(G11R、A88V、V37E)的过表达慢病毒载体,转染入293T... 详细信息

目的：构建编码缝隙连接蛋白connexin30(Cx30)的致病基因GJB6及其3种突变体的慢病毒过表达载体,并分析其在人永生化角质形成细胞(HaCaT)中的表达。资料与方法：构建GJB6基因及其突变体(G11R、A88V、V37E)的过表达慢病毒载体,转染入293T细胞,应用荧光倒置显微镜、Real time定量PCR法(q-pcr)、Western Blot等检测其表达情况,并转染HaCaT细胞,在荧光倒置显微镜下观察荧光表达及蛋白的初步定位。结果：成功构建了该基因野生型及突变体慢病毒表达载体,并将G11R和A88V突变体成功转染HaCaT细胞。构建及转染过程中发现：野生型重组质粒转染293T细胞后有强荧光显示,WB检测强阳性条带；3种突变型重组质粒转染293T细胞后,A88V突变型转染细胞内观察到较强荧光,G11R有弱荧光,而V37E突变型未观察到荧光或较弱,但WB检测均有弱阳性条带,说明目的基因有表达但较野生型低。将构建的G11R和A88V突变体慢病毒表达载体转染Hacat细胞,可观察到弱的荧光；V37E突变型未观察到荧光或较弱,且有HaCaT细胞大量死亡现象。结论：野生型GJB6转染HaCaT细胞后蛋白能够定位于细胞膜,3种突变体中只有G11R和A88V突变体可定位于细胞膜但其编码的Cx30表达量较少,初步推测不同GJB6突变体或不能定位于角质形成细胞膜或不能形成功能性的Cx30,影响了角质形成细胞正常的增殖和分化。

关键词： Cx30 GJB6基因及其突变体过表达慢病毒 Hacat细胞

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GJB6基因突变体过表达慢病毒载体的构建及其在HaCaT细胞中的表达

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中国麻风皮肤病杂志 2015年第1期31卷 11-14页

作者：姬灿灿王震英燕鹏荣陈楠吴静张永飞宋亚丽张莉山东大学附属省立医院皮肤科济南250021

目的;明确GJB6目的基因蛋白Cx30在GJB6 3种突变体A88V、G11R和V37E在HaCaT细胞中的表达。方法:构建GJB6基因突变体的慢病毒载体,并转染至HaCaT,应用荧光倒置显微镜检测其表达。结果:突变体中G11R和A88V经过多次转染实验,能够明确观察到H... 详细信息

目的;明确GJB6目的基因蛋白Cx30在GJB6 3种突变体A88V、G11R和V37E在HaCaT细胞中的表达。方法:构建GJB6基因突变体的慢病毒载体,并转染至HaCaT,应用荧光倒置显微镜检测其表达。结果:突变体中G11R和A88V经过多次转染实验,能够明确观察到HaCaT细胞细胞膜上有Cx30蛋白的荧光表达;而V37E突变型荧光表达极弱或无。结论:3种突变体的Cx30表达量不同,初步推测突变体编码的蛋白质或不能定位于角质形成细胞膜或不能形成功能性的Cx30,从而影响了HaCaT细胞正常的增殖和分化。

关键词： Cx30 GJB6基因及其突变体过表达慢病毒 HaCaT细胞

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锌指蛋白146(RNF146)对吡柔比星引起的小鼠睾丸精原细胞DNA损伤的保护作用

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细胞与分子免疫学杂志 2016年第7期32卷 945-949页

作者：程建华杨晓霞杨慧莹关立锋丁敬宾丁娟赵薇宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室宁夏医科大学总医院麻醉科宁夏医科大学总医院烧伤整形科宁夏医科大学基础医学院生理学系宁夏银川750004

目的评价锌指蛋白146(RNF146)对化疗药吡柔比星引起的GC-1小鼠睾丸精原细胞DNA损伤的保护作用。方法采用1.0μg/m L吡柔比星处理的方法复制DNA损伤的小鼠GC-1精原细胞模型。构建小鼠rnf146慢病毒过表达载体p CDHrnf146并包装rnf146过表... 详细信息

目的评价锌指蛋白146(RNF146)对化疗药吡柔比星引起的GC-1小鼠睾丸精原细胞DNA损伤的保护作用。方法采用1.0μg/m L吡柔比星处理的方法复制DNA损伤的小鼠GC-1精原细胞模型。构建小鼠rnf146慢病毒过表达载体p CDHrnf146并包装rnf146过表达慢病毒,感染GC-1细胞上调rnf146的表达,Western blot验证过表达效率。评价RNF146对吡柔比星引起的GC-1细胞增殖抑制、凋亡增多及DNA损伤的保护作用。结果成功构建了p CDH-rnf146重组质粒并包装具有良好感染效率的RNF146过表达慢病毒。溴脱氧尿苷(Brd U)掺入标记显示RNF146能够减轻吡柔比星引起的GC-1增殖抑制。原位末端转移酶标记技术(TUNEL)提示RNF146能够抑制吡柔比星诱导的GC-1细胞凋亡。彗星实验显示RNF146过表达能够有效保护吡柔比星作用下GC-1细胞DNA的完整性。结论 RNF146对化疗药吡柔比星引起的小鼠睾丸精原细胞损伤具有保护作用。

关键词：锌指蛋白146(RNF146) 过表达慢病毒 GC-1细胞系吡柔比星 DNA损伤

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舌鳞癌组织内CEACAM1过表达调控中性粒细胞浸润、功能影响其恶性表型及预后的研究

舌鳞癌组织内CEACAM1过表达调控中性粒细胞浸润、功能影响其恶性...

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作者：王宁山东大学

学位级别：博士

前言口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma, OSCC)属全球十大常见恶性肿瘤之一,也是头颈部最常见的恶性肿瘤。舌鳞状细胞癌(Tongue squamosus cell carcinoma, TSCC)是最常见的口腔鳞癌类型,且由于其手术范围相对局限,肿瘤易发... 详细信息

前言口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma, OSCC)属全球十大常见恶性肿瘤之一,也是头颈部最常见的恶性肿瘤。舌鳞状细胞癌(Tongue squamosus cell carcinoma, TSCC)是最常见的口腔鳞癌类型,且由于其手术范围相对局限,肿瘤易发生侵袭、转移,导致舌鳞癌易复发预后不良。因此,深入阐述、揭示舌鳞癌恶性生物学表型产生的机制,寻找有效的阻断靶点是提高舌鳞癌临床治疗疗效的重要途径。越来越多的资料表明,炎症参与了恶性肿瘤的演进和异质化,并且是被称为肿瘤发展史上的第七大标志。炎细胞的种类繁多,其中中性粒细胞是外周血白细胞中占据最大比例的细胞成分。由于其抗病原微生物特性,中性粒细胞传统上被认为是抗肿瘤的。然而,目前已有很多资料表明,在一系列恶性肿瘤内(如肾癌,肝癌,胃癌等)存在着丰富的中性粒细胞浸润,并且其浸润与较差的临床结局和较短的生存期有关。另外,相关研究还发现中性粒细胞在肿瘤恶性生物学行为中发挥着重要的作用,它可以促进肿瘤的侵袭、转移和血管生成等,因此许多学者称其为肿瘤相关中性粒细胞(Tumor associated neutrophils, TANs)。而中性粒细胞在舌鳞癌组织中的浸润情况及意义却鲜见报道。并且大量中性粒细胞浸润的原因以及中性粒细胞促进肿瘤演进的机制研究甚少。癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)是属于超级球蛋白家族的一名成员,并且广泛表达于多种细胞,包括上皮细胞,内皮细胞,血细胞等。CEACAM1蛋白的功能呈多样化特点,比如调节细胞生长,血管生成,免疫反应,肿瘤侵袭及病原微生物感染等。最近的一个研究表明：细胞因子诱导的角质细胞上高表达的CEACAM1可以促进中性粒细胞的生存；而另外一个研究显示：黑色素瘤细胞表达的CEACAM1可以抑制NK细胞的细胞毒性功能。以上结果提示：肿瘤组织来源的CEACAM1对于调控肿瘤内中性粒细胞的浸润及其功能可能有重要的作用,并从而能影响肿瘤的生物学行为。然而肿瘤细胞来源的CEACAM1蛋白对于中性粒细胞作用的相关研究报道甚少。因此在本课题中,我们利用免疫组化技术研究了舌鳞癌组织中中性粒细胞的浸润及CEACAM1的表达情况,分析了二者相关性,以及二者与病人生存预后的关系。体外实验中,利用慢病毒技术,研究了舌鳞癌细胞系Cal-27过表达CEACAM1-4L和CEACAM1-4S两亚型后对癌细胞自身增殖、侵袭和迁移能力的影响,以及对中性粒细胞的浸润和其功能改变的影响。以期为舌鳞癌恶性生物学行为的遏制找到关键的靶分子。第一部分中性粒细胞在舌鳞癌中的浸润及其与CEACAM1表达的相关性研究目的 1.研究中性粒细胞在舌鳞癌组织中的浸润情况及意义, ***1在舌鳞癌中的表达及意义； 3.探讨CEACAM1的表达与中性粒细胞浸润的相关性。方法 1.标本收集：收集2005-2010年间,在青岛大学医学院附属医院进行舌鳞癌首次根治性手术切除的肿瘤标本共74例,并在取得书面知情同意书后,对病人进行了随访。所有病人均进行了淋巴结清扫术。所有的病理诊断参照《头颈部肿瘤病理学和遗传学》(世界卫生组织分类及诊断标准)进行。患者术前均未行放疗、化疗以及其它干预治疗。 2.组织芯片和免疫组化：选取74例舌鳞癌组织及17例癌旁组织内典型的区域各两块(避开出血和坏死组织),制作成组织芯片。利用免疫组织化学方法检测了舌鳞癌及癌旁组织中CD15+中性粒细胞的浸润密度和CEACAM1的表达情况,分析了二者与临床病理参数及病人生存预后的关系,以及两者的相关性。结果***1在舌鳞癌中的表达及与临床病理参数及病人生存的关系。CEACAM1主要表达于癌细胞的胞浆内,少数呈胞膜表达。CEACAM1在舌鳞癌组织中的表达较癌旁组织明显升高(P=0.003)。在淋巴结转移组内CEACAM1的表达高于非淋巴结转移组(P=0.000),并且较高临床分期组的CEACAM1表达亦高于低临床分期组(P=0.001)。而CEACAM1的表达与病人性别、年龄、病理学分级、肿瘤大小及有无复发均无关。单因素及多因素生存分析结果显示：CEACAM1的过表达与较短的累计癌症相关生存期有关(P=0.032),但它不是一个独立的生存预后因子。 ***15阳性中性粒细胞在舌鳞癌中的浸润情况及其意义在舌鳞癌组织中,存在着大量的中性粒细胞浸润,其浸润丰度显著高于癌旁组织(P=0.038)。大量的中性粒细胞浸润与舌鳞癌的高临床分期(P=0.037)、淋巴结转移(P=0.01)和肿瘤复发(P=0.024)有关系,而与病人的性别、年龄、病理学分级机肿瘤大小

关键词：舌鳞状细胞癌 CEACAM1 中性粒细胞预后 Cal-27 过表达慢病毒增殖迁移侵袭 HL-60 趋化共培养杀伤能力类型转化

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锌指蛋白146对小鼠精原细胞化疗后DNA损伤的保护作用研究

锌指蛋白146对小鼠精原细胞化疗后DNA损伤的保护作用研究

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作者：程建华宁夏医科大学

学位级别：硕士

睾丸是对化疗药物高度敏感的器官,化疗后出现不同程度睾丸功能损伤的患者越来越多,严重影响男性生殖健康。吡柔比星(pirarubicin,THP)是血液系统及泌尿系统恶性肿瘤[1,2]治疗常用的化疗药。针对体内异常增殖的肿瘤细胞,THP能够造成细胞... 详细信息

睾丸是对化疗药物高度敏感的器官,化疗后出现不同程度睾丸功能损伤的患者越来越多,严重影响男性生殖健康。吡柔比星(pirarubicin,THP)是血液系统及泌尿系统恶性肿瘤[1,2]治疗常用的化疗药。针对体内异常增殖的肿瘤细胞,THP能够造成细胞DNA损伤,诱导肿瘤细胞凋亡。然而,体内分裂活跃的细胞,如生殖细胞,对于化疗药物表现出高度敏感性。锌指蛋白146(Ring finger protein,RNF146)是一种新近发现的具有E3泛素连接酶活性的DNA损伤反应蛋白[3]。预实验中我们发现其在成年雄性小鼠睾丸组织中高表达。RNF146在新生小鼠睾丸组织中表达极低,随着性发育表达水平迅速升高。这一现象引起了我们的重视,然而仍有一些问题需要深入探索。RNF146在成年小鼠睾丸精原细胞中高表达的意义是什么?小鼠化疗后精原细胞的DNA损伤与RNF146之间存在联系吗?RNF146能否作为化疗后改善精原细胞DNA损伤的靶点呢?为此,我们进行了下列两部分研究工作:第一部分RNF146在小鼠睾丸组织中的表达及定位特点目的:明确DNA损伤反应蛋白RNF146在小鼠睾丸组织中的表达规律及细胞定位特点。方法:取成年雄性C57小鼠8只,分别提取包括睾丸在内的主要组织器官总蛋白,通过Western-blot实验评价RNF146表达的组织特异性。取新生、7日龄、1月龄、3月龄和1年龄雄性C57小鼠各5只,提取一侧睾丸组织总蛋白,经Western-blot观察C57小鼠睾丸组织中RNF146的表达规律,另一侧睾丸组织制备石蜡切片。通过HE染色、免疫组化和免疫荧光染色明确小鼠睾丸组织中RNF146与生精细胞发育的关系及成年小鼠睾丸曲精小管中RNF146细胞定位特点。结果:Western-blot结果提示在成年雄性C57小鼠全身各脏器中,RNF146主要表达于肺、睾丸、脑和脾等脏器中,肝、肾及胃中表达水平极低;随着小鼠的性发育,睾丸组织中RNF146表达水平迅速升高,老年鼠睾丸组织中RNF146表达降低。免疫组化和免疫荧光染色提示成年雄性小鼠睾丸组织中RNF146主要定位在曲精小管精原细胞上,间质血管及支持细胞几乎不表达。结论:RNF146在正常成年雄性C57小鼠各器官中表达具有组织特异性,肺、睾丸及脑是其主要表达脏器。睾丸中RNF146的表达水平随小鼠性发育迅速升高,老年阶段降低。成年小鼠睾丸组织中RNF146主要定位在曲精小管的精原细胞区域,提示其可能与精原细胞的功能有关。第二部分RNF146对吡柔比星引起的小鼠睾丸精原细胞DNA损伤的保护作用目的本实验以小鼠睾丸精原细胞株GC-1为细胞模型,通过包装RNF146过表达慢病毒及对照病毒,感染GC-1细胞,采用吡柔比星干预的方法复制精原细胞DNA损伤模型。观察基因rnf146是否对化疗药吡柔比星干预所引起的精原细胞株GC-1 DNA损伤具有保护作用。方法以小鼠睾丸组织总RNA为模板反转录合成c DNA,设计引物PCR扩增rnf146片段,将片段与载体p CDH连接以构建p CDH-rnf146重组质粒,以Lipofectamine?3000为介质将重组质粒p CDH-rnf146、载体对照质粒p CDH-egfp以及包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转H E K293T细胞包装病毒。以小鼠睾丸精原细胞株GC-1为观察对象,设置Blank、Lenti-EGFP及Lenti-RNF146三组GC-1细胞,采用L enti-RN F146过表达慢病毒感染的方法复制RNF146过表达的GC-1细胞模型,无关病毒Lenti-EGFP感染组为平行对照,通过Western blot鉴定Lenti-RNF146在GC-1细胞中的过表达效率。采用吡柔比星处理的方法复制GC-1细胞的DNA损伤模型,Brd U掺入标记实验评价吡柔比星对GC-1细胞增殖的影响并确定最佳干预浓度,彗星实验评价吡柔比星对GC-1细胞DNA完整性的影响,Tunel染色分析吡柔比星对GC-1细胞凋亡的影响。在吡柔比星干预的GC-1、L enti-EG FP/GC-1和Lenti-RNF146/GC-1三种细胞模型中,通过彗星实验、T UN EL染色分析RNF146对吡柔比星引起的GC-1细胞增殖抑制、凋亡增多及D NA损伤的保护作用。结果成功构建了小鼠p CDH-rnf146重组质粒并包装得到了RNF146过表达慢病毒,Western blot结果提示Lenti-RNF146过表达慢病毒能够显著上调GC-1细胞中RNF146的表达效率。1.0μg/m L为吡柔比星干预GC-1细胞的最佳处理浓度。Brd U掺入标记显示RNF146能够减轻吡柔比星引起的GC-1细胞增殖抑制。TUNEL染色提示RNF146能够缓解吡柔比星诱导的GC-1细胞凋亡。彗星实验

关键词：锌指蛋白146 精原细胞睾丸 C57BL/6小鼠过表达慢病毒 GC-1细胞株吡柔比星 DNA损伤

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过表达TRPV6基因对小鼠破骨细胞钙转运及凋亡相关基因表达的影响

过表达TRPV6基因对小鼠破骨细胞钙转运及凋亡相关基因表达的影响

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作者：崔军南京农业大学

学位级别：硕士

钙和体内骨稳态息息相关。骨细胞内的Ca2+是一种重要的第二信使。胞内Ca2+水平的细微变化可影响正常的骨稳态,胞内钙离子浓度的改变会导致钙离子参与细胞凋亡。TRPV6是TRP家族中的一员,对钙离子有高度选择性,由细胞内低钙水平激活;是钙... 详细信息

钙和体内骨稳态息息相关。骨细胞内的Ca2+是一种重要的第二信使。胞内Ca2+水平的细微变化可影响正常的骨稳态,胞内钙离子浓度的改变会导致钙离子参与细胞凋亡。TRPV6是TRP家族中的一员,对钙离子有高度选择性,由细胞内低钙水平激活;是钙离子跨细胞转运的限速门控通道。本文旨在通过过表达TRPV6慢病毒感染成熟小鼠破骨细胞进而研究TRPV6过表达对破骨细胞钙转运相关基因及细胞凋亡相关基因表达的影响,为探究破骨细胞钙离子转运及凋亡提供理论依据。采用PCR扩增方法获得TRPV6全基因片段,随后将TRPV6全基因片段交换入已酶切的慢病毒载体构建重组质粒。将重组质粒转化入感受态细胞进行菌落PCR鉴定。将鉴定出的阳性克隆转化子培养测序。将测序结果与TRPV6基因序列一致的菌液继续培养并抽提质粒。随后将GV365质粒、pHelper1.0和pHelper 2.0载体质粒及转染试剂与293T细胞共培养并进行质粒表达检测。最后进行慢病毒浓缩与纯化以用于后续试验研究。取5～6周龄小鼠,拉颈处死,置于75%酒精中浸泡3～5 min消毒。取下股骨和胫骨放入含双抗的4℃的PBS中,随后转移至超净台。用2mL注射器双向冲洗骨髓腔多次,采用Ficoll分离单核细胞。用含100 ng/mL M-CSF的完全细胞培养液重悬,细胞计数,调整细胞密度为2×105/mL,向96孔板中以0.2 mL/孔加入上述细胞悬液。放入5%CO2恒温培养箱中,37℃培养3d,期间观察细胞生长情况,每两天更换完全细胞培养液。用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色以鉴定破骨细胞。选取生长状态良好的破骨细胞,分为空白细胞组、阴性对照组(慢病毒转染)和过表达TRPV6慢病毒转染试验组。单核细胞在RANKL和M-CSF刺激下分化为成熟破骨细胞,于第五天进行转染试验,转染后第三天于荧光倒置显微镜下观察慢病毒转染效果。结果显示破骨细胞荧光表达丰度较高,感染效率95%左右且细胞生长良好,可用于后续试验。随后通过荧光定量PCR和Western-blot分别于mRNA水平和蛋白水平测定TRPV6过表达时破骨细胞钙转运相关基因与细胞凋亡相关基因表达水平变化。利用Annexin V-APC/PI双染色于流式细胞仪测定TRPV6过表达对细胞凋亡率的影响。荧光定量PCR结果显示,与空白对照组相比,过表达慢病毒LV-TRPV6组TRPV6、CaBP-D28k、NCX1 基因 mRNA 表达水平显著增加(P<0.05),PMCA-1B mRNA表达水平无明显差异;阴性对照组钙转运相关基因mRNA表达水平无明显差异。线粒体凋亡途径相关基因Bax、Apaf-1、C9基因mRNA表达水平极显著降低(P<0.01),Bcl-2基因mRNA表达水平无明显变化;阴性对照组线粒体凋亡途径相关基因mRNA表达水平无明显差异。死亡受体凋亡途径相关基因FasL、Fas基因mRNA表达水平显著增加(P<0.05),C8、C3基因mRNA表达水平显著降低(P<0.05)Western-blot结果显示,与空白对照组相比,过表达慢病毒LV-TRPV6组TRPV6、CaBP-D28k及NCX1基因蛋白表达水平显著增加(P<0.05);阴性对照组钙转运相关基因蛋白表达水平无明显差异。与空白对照组相比,过表达慢病毒LV-TRPV6组Bax、C8、C3基因蛋白表达水平极显著降低(P<0.01);阴性对照组细胞凋亡相关基因蛋白表达水平无明显差异。流式细胞仪结果显示,与空白对照组相比,Annexin V-APC/PI双染色后,TRPV6过表达导致破骨细胞凋亡率显著降低(P<0.05);阴性对照组无明显差异。结论:本试验成功构建过表达TRPV6慢病毒载体,且对小鼠破骨细胞转染效果良好。破骨细胞过表达TRPV6基因导致钙转运相关基因表达增加并抑制破骨细胞凋亡。

关键词：鼠破骨细胞 TRPV6 过表达慢病毒转染钙转运细胞凋亡

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