检索结果-内蒙古大学图书馆

吉林大学学报(医学版) 2025年第1期51卷 1-8页

作者：吴钊淳李友何嘉文廖科棋李胜男广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室广东湛江524002 广东医科大学附属医院神经病学研究所广东湛江524002

目的:构建PR锌指区域蛋白(PRDM)5基因的过表达慢病毒载体,建立稳定转染的小鼠神经瘤母细胞Neuro-2a,为探讨PRDM5在缺血性脑卒中(IS)发病机制中的作用奠定基础。方方法法:在NCBI上搜索PRDM5的序列并设计引物,PCR法扩增获取PRDM5基因序列... 详细信息

目的:构建PR锌指区域蛋白(PRDM)5基因的过表达慢病毒载体,建立稳定转染的小鼠神经瘤母细胞Neuro-2a,为探讨PRDM5在缺血性脑卒中(IS)发病机制中的作用奠定基础。方方法法:在NCBI上搜索PRDM5的序列并设计引物,PCR法扩增获取PRDM5基因序列,将其与Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶双酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-PRDM5过表达重组质粒,采用PCR法筛选并鉴定出的与目的基因片段长度相近的阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序正确的GV492-control质粒和GV492-PRDM5过表达重组质粒分别转染至人胚胎肾细胞HEK293T中,转染48 h后离心收集慢病毒,分别为GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒,采用慢病毒滴度测定法检测上述2种慢病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-control组和GV492-PRDM5组,分别使用GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后使用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))对成功感染GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的Neuro-2a细胞进行筛选,通过荧光显微镜观察GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态及绿色荧光蛋白的表达情况。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平;Western blotting法检测2组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平。结果:PCR法,GV492-PRDM5重组质粒阳性转化子的长度约为684 bp,GV492-PRDM5过表达重组质粒基因序列与设计合成的PRDM5过表达序列一致;GV492-control慢病毒和GV492-PRDM5过表达慢病毒的滴度均为2.5×108 TU·mL^(-1)。荧光显微镜,GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞的生长状态均良好,且能观察到绿色荧光蛋白的表达。RT-qPCR法,与GV492-control组比较,GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。Western blotting法,GV492-control组和GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞在相对分子质量为75000附近出现特异性条带;与GV492-control组比较,GV492-PRDM5组Neuro-2a细胞中PRDM5蛋白表达水平升高(P<0.01)。结论:成功构建PRDM5过表达慢病毒载体,建立了稳定转染的GV492-PRDM5-Neuro-2a细胞。

关键词： PR锌指区域蛋白过表达慢病毒载体稳定表达 Neuro-2a细胞

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胞质分裂作用因子4过表达慢病毒载体的构建和稳定转染Neuro-2a细胞的建立

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吉林大学学报（医学版） 2024年第5期50卷 1322-1329页

作者：李胜男何嘉文廖科棋李友广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室广东湛江524002 广东医科大学附属医院神经病学研究所广东湛江524002

目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限... 详细信息

目的:构建胞质分裂作用因子4(DOCK4)过表达慢病毒载体,建立DOCK4稳定过表达的Neuro-2a细胞。方法:在美国国家生物信息中心(NCBI)查找DOCK4的序列并设计合成引物,采用聚合酶链式反应(PCR)法扩增获取DOCK4基因序列,通过Bam HⅠ和AgeⅠ限制性内切酶酶切后,将其与酶切后的慢病毒载体GV492进行连接,构建GV492-DOCK4过表达重组质粒,PCR法鉴定筛选出与目的基因片段长度大小相近的阳性克隆。将GV492-对照质粒和GV492-DOCK4过表达重组质粒分别转染至HEK293T细胞中,转染48 h后收集慢病毒进行包装并测定病毒滴度。将Neuro-2a细胞分为GV492-对照组和GV492-DOCK4组,分别采用GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒感染Neuro-2a细胞,慢病毒感染复数(MOI)为100,感染72 h后采用嘌呤霉素(10 mg·L^(-1))筛选出成功感染GV492-对照组慢病毒和GV492-DOCK4过表达慢病毒的Neuro-2a细胞,荧光显微镜观察各组Neuro-2a细胞生长状态及绿色荧光蛋白表达情况;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测各组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA和DOCK4蛋白表达水平。结果:PCR检测,GV492-DOCK4过表达重组质粒的基因片段长度约为691 bp,测序结果显示GV492-DOCK4过表达重组质粒基因序列与设计合成的DOCK4过表达序列一致;GV492-对照组和GV492-DOCK4过表达组慢病毒的滴度分别为2.5×10^(8) TU·mL^(-1)和2.5×10^(8) TU·mL^(-1);荧光显微镜观察,各组Neuro-2a细胞生长状态良好且存在绿色荧光蛋白表达;RT-qPCR法检测,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);Western blotting法检测,各组细胞在相对分子质量225000附近出现特异性条带,与GV492-对照组比较,GV492-DOCK4组Neuro-2a细胞中DOCK4蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:本研究成功构建DOCK4过表达慢病毒载体,建立了稳定过表达DOCK4的Neuro-2a细胞。

关键词：胞质分裂作用因子4 过表达慢病毒载体 Neuro-2a细胞稳定转染过表达慢病毒

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miR-186过表达慢病毒载体的构建及鉴定

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吉林大学学报（医学版） 2019年第5期45卷 997-1002,I0001页

作者：李胜男王梦旭胡伟东陈少凤陈杏兰李友广东省衰老相关心脑疾病重点实验室广东湛江524002 广东医科大学附属医院神经病学研究所广东湛江524002

目的:构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞(HEK)293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法:以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin... 详细信息

目的:构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞(HEK)293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法:以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin的慢病毒载体FV040中,经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切及测序鉴定后获得重组慢病毒载体。利用Lipofectamine2000将重组慢病毒质粒FV040Vector和FV040miR-186分别与辅助质粒通过共转染至HEK293T细胞中,48h后收集慢病毒,以FV040Vector慢病毒作为对照组,FV040miR-186作为实验组,分别感染HEK293T细胞。感染48h后,观察HEK293T细胞中绿色荧光的分布情况,并采用实时荧光定量PCR法检测miR-186的表达水平。结果:测序分析,miR-186过表达慢病毒与GenBank上公布的miR-186序列完全一致。与对照组(0.838 7±0.145 6)比较,实验组HEK293T细胞中miR-186表达水平(12.640 0±0.788 4)明显升高(t=14.72,P<0.01),约为对照组的15.07倍。结论:成功构建miR-186过表达慢病毒载体并包装出慢病毒,miR-186慢病毒成功感染HEK293T细胞,miR-186表达水平在HEK293T细胞中明显升高。

关键词： miR-186 慢病毒 HEK293T细胞过表达慢病毒载体绿色荧光蛋白

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大鼠Tmub1基因过表达慢病毒载体的构建

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重庆医学 2016年第13期45卷 1744-1746页

作者：赵晓彪李光耀刘孟刚范霞陈平第三军医大学大坪医院野战外科研究所肝胆外科重庆400042 第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室重庆400042

目的构建Tmubl基因的过表达慢病毒载体（LV—Tmubl），为研究Tmubl蛋白在肝细胞增殖过程中的作用提供实验材料。方法化学合成Tmubl基因序列，用BamHI／AgeI酶切化学合成含有目的基因的质粒及GV287载体，PCR产物连接入线性化表达的载体。... 详细信息

目的构建Tmubl基因的过表达慢病毒载体（LV—Tmubl），为研究Tmubl蛋白在肝细胞增殖过程中的作用提供实验材料。方法化学合成Tmubl基因序列，用BamHI／AgeI酶切化学合成含有目的基因的质粒及GV287载体，PCR产物连接入线性化表达的载体。PCR鉴定引物，再对PCR鉴定阳性的克隆进行DNA测序和比对分析。使用构建的LV—Tmnbl，转染293T细胞，荧光法检测构建的慢病毒滴度。结果成功构建了LV-Tmubl，并获得相应的病毒，病毒滴度为2×10^8TU／mL。结论LV-Tmubl为进一步研究Tmubl蛋白在肝细胞增殖中的作用提供了实验基础。

关键词： Tmub1 基因过表达慢病毒载体大鼠

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MAFA-PDX1过表达慢病毒感染人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的分化

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中国组织工程研究 2024年第7期28卷 1000-1006页

作者：邱晓燕李碧欣黎敬弟范垂钦马廉王鸿武汕头大学医学院第二附属医院儿科广东省汕头市515041 深圳市儿童医院儿科研究所广东省深圳市518038 广州医科大学第三附属医院(广州医科大学妇女儿童医院) 广东省广州市512000 汕头大学医学院干细胞研究中心广东省汕头市515041

背景:干细胞来源胰岛β细胞移植被认为是治疗1型糖尿病的有效手段。人脐带间充质干细胞是理想的细胞来源,但其向胰岛β细胞分化的效率不高。目的:研究MAFA、PDX1修饰促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能。方法:构建MAFA-P... 详细信息

背景:干细胞来源胰岛β细胞移植被认为是治疗1型糖尿病的有效手段。人脐带间充质干细胞是理想的细胞来源,但其向胰岛β细胞分化的效率不高。目的:研究MAFA、PDX1修饰促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能。方法:构建MAFA-PDX1过表达慢病毒载体,用细胞形态学、RT-qPCR法、双硫腙染色比较3种方案[方案A:单纯慢病毒组;方案B:先药物(尼克酰胺、β-巯基乙醇)诱导再加慢病毒组;方案C:慢病毒和药物诱导同时进行组]诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的效率和潜能。结果与结论:(1)细胞形态学改变:经3种方案诱导后细胞形态均发生了改变,方案B在诱导第11天细胞聚集生长最为明显,出现聚集生长的胰岛样细胞团;(2)RT-qPCR检测胰岛相关基因的表达差异:同一诱导时间点3种方案横向比较,在诱导第5天,方案C的MAFA和PDX1基因表达量最高,方案B的GCG基因表达量最高;在诱导第11天,方案B的MAFA、PDX1基因表达量以及INS和GLUT2基因表达量最高;(3)双硫腙染色鉴定锌离子:3种方案诱导第11天部分细胞被双硫腙染成棕红色,其中方案B中部分小岛状细胞被染成棕红色,颜色较深(阳性表达);(4)结果表明,MAFA和PDX1共过表达可促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化;MAFA-PDX1基因修饰联合药物诱导方案优于单纯基因修饰方案。

关键词：脐带间充质干细胞 MAFA PDX1 过表达慢病毒载体胰岛素分泌细胞糖尿病诱导分化

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HTRA1基因突变对血管平滑肌细胞功能的影响及其与氧化还原反应关系研究

HTRA1基因突变对血管平滑肌细胞功能的影响及其与氧化还原反应关...

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作者：石瑜第二军医大学

学位级别：博士

CARASIL是一种直接影响脑小血管的单基因疾病,是由编码Htr A丝氨酸肽酶/蛋白酶1(HTRA1)的HTRA1基因突变引起。CARASIL在成年早期发病,多发生于男性,其确切发病率尚不清楚。主要临床表现为缺血性脑卒中或逐步恶化的脑功能、痴呆、早秃和... 详细信息

CARASIL是一种直接影响脑小血管的单基因疾病,是由编码Htr A丝氨酸肽酶/蛋白酶1(HTRA1)的HTRA1基因突变引起。CARASIL在成年早期发病,多发生于男性,其确切发病率尚不清楚。主要临床表现为缺血性脑卒中或逐步恶化的脑功能、痴呆、早秃和严重腰痛、变形性脊椎病和椎间盘突出等。影像学特征表现是通过头部CT扫描和脑磁共振成像观察到位于基底节和丘脑的弥漫性白质改变、多发腔隙性脑梗死。在组织病理学上,CARASIL主要表现为小穿通动脉的动脉硬化伴随着内膜增厚、血管平滑肌细胞损失和中膜透明变性。HTRA1基因位于10q26区域,包含有9个外显子,CARASIL相关的等位基因变异体出现在外显子1、3、4和6上,共有11个突变位点,包括7个错义突变、1个移码突变、2个无义突变和1个缺失突变。HTRA1是一种分泌型丝氨酸蛋白酶,可以促进细胞外基质蛋白的变性,也起着重要的生理作用,与关节炎、癌症疾病、家族性缺血性脑小血管病、年龄相关性黄斑变性和阿尔茨海默氏病等有关。HTRA1蛋白酶功能丧失导致CARASIL,但确切的机制尚不完全明确。2007年,我们报道了国内首例CARASIL家系,经基因检测分析,发现了在外显子6上的一个新的HTRA1基因错义突变:1091T>C(点突变)。前期的研究发现,该位点突变的HTRA1基因可以导致HTRA1m RNA及其蛋白的表达减少,并引起TGF-β1/Smads/CTGF信号通路的表达上调。在本实验中,我们利用HTRA突变型和野生型基因慢病毒表达载体感染人脑血管平滑肌细胞,观察该细胞的功能及氧化还原反应情况,以此来探讨CARASIL的发病机制。第一部分HTRA1基因过表达慢病毒载体构建研究目的:构建针对HTRA1基因以及其1091T>C突变基因(HTRA1-Mut)的过表达慢病毒载体。研究方法:利用NCBI Genbank数据库设计并构建HTRA1基因的引物,利用PCR法钓取并扩增野生型和突变型HTRA1基因并酶切慢病毒载体GV287,将HTRA1基因重组入GV287并转化预先培养好的感受态细胞。挑选克隆行PCR初步鉴定HTRA1重组的情况,对PCR鉴定阳性的细胞送基因测序,与Genbank数据库中的HTRA1序列进行比对,验证慢病毒载体构建成功。将制备好的GV287载体同两种装载慢病毒辅助原件的载体抽提后共同转染293T细胞系,并用western blot进行检测转入的HTRA1基因表达情况,荧光法和Elisa法检测病毒滴度。结果:通过设计的引物PCR扩增得到HTRA1基因以及HTRA1-Mut基因的目的片段,同GV287进行酶切后成功转化细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析显示与Genbank数据库中的HTRA1基因以及HTRA1-Mut基因序列一致。HTRA1/HTRA1-Mut表达载体转染293T后,细胞内可观察到明显的荧光,测定病毒滴度为:2E+8TU/ml。结论:成功构建了HTRA1基因及HTRA1-Mut基因真核表达载体;成功对HTRA1及HTRA1-Mut慢病毒进行了包装与滴度检测。第二部分HTRA1基因慢病毒载体感染血管平滑肌细胞模型的建立研究目的:对人脑血管平滑肌细胞(HBVSMC)进行HTRA1及HTRA1-Mut过表达慢病毒载体感染。研究方法:对HBVSMC进行细胞培养,α-SMA抗体荧光染色进行表型鉴定;对培养后生长良好的HBVSMC进行HTRA1及HTRA1-Mut过表达慢病毒载体感染。结果:HBVSMC生长状态良好,光镜下细胞形态正常,对细胞行,α-SMA抗体染色细胞荧光显色良好;HTRA1及HTRA1-Mut过表达慢病毒载体感染后HBVSMC有荧光表达,并且荧光率达80%以上。结论:成功培养HBVSMC细胞系并进行了初步鉴定成功;成功建立HTRA1及HTRA1-Mut基因慢病毒载体感染血管平滑肌细胞模型。第三部分HTRA1基因突变对人脑血管平滑肌细胞的增殖、迁移、凋亡的影响研究目的:检测HTRA1及HTRA1-Mut基因慢病毒载体转染HBVSMC后,HBVSMC的增殖、迁移及凋亡的变化。研究方法:将HBVSMC分为三组,NC正常的人脑血管平滑肌细胞组,OE-WT HTRA1野生型病毒感染细胞组及OE-MU HTRA1突变型病毒感染细胞组,细胞培养良好后分别行CCK-8检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞的迁移,细胞凋亡用流式细胞术检测。结果:相比正常的人脑血管平滑肌细胞(NC),HTRA1野生型病毒感染细胞(OE-WT)增殖无明显变化,HTRA1野生型病毒感染细胞(OE-MU)增殖减缓。与正常的人脑血管平滑肌细胞(NC)相比,HTRA1野生型病毒感染细胞(OE-WT)Transwell转移率无明显差异(P>0.05),HTRA1突变型病毒感染

关键词： HTRA1基因过表达慢病毒载体质粒基因突变血管平滑肌细胞慢病毒载体感染细胞培养血管平滑肌细胞增殖迁移凋亡 CCK-8 血管平滑肌细胞活性氧 NADPH NOX4

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转录激活因子3在肝细胞癌发生发展中的作用及其相关机制研究

转录激活因子3在肝细胞癌发生发展中的作用及其相关机制研究

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作者：李小燕福建医科大学

学位级别：博士

目的：检测转录激活因子3（Activating Transcription Factor3,ATF3）在肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma, HCC）组织中的表达，结合临床病理特征，探讨ATF3与HCC发生发展的相关性；构建并制备过表达ATF3的慢病毒载体，观察其介导的... 详细信息

目的：检测转录激活因子3（Activating Transcription Factor3,ATF3）在肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma, HCC）组织中的表达，结合临床病理特征，探讨ATF3与HCC发生发展的相关性；构建并制备过表达ATF3的慢病毒载体，观察其介导的过表达ATF3对肝癌细胞株HepG2生物学行为的影响，阐明ATF3在HCC发生发展中的作用机制；筛选及验证肝癌细胞中与ATF3相互结合的蛋白质，探讨在HCC发生发展过程中调控ATF3发挥生物学功能的分子机制。方法：（1）应用RT-PCR，IHC和WB检测并对比ATF3在肝癌标本及正常肝组织中的蛋白及基因水平，结合相关的临床病理参数，探讨ATF3与HCC形成的相关性；（2）构建并制备过表达ATF3的慢病毒载体，感染HepG2后进行MTT实验，Transwell实验，FCM检测细胞周期及细胞凋亡，对比过表达前后细胞增殖、迁移能力、周期状态及凋亡情况的变化，探讨ATF3在HCC发生发展中的作用及相关细胞学机制；（3）应用IP方法沉淀出HepG2细胞中与ATF3相互结合的蛋白，并经变性聚丙烯凝胶分析，与阴性对照比对，挑选出差异性的电泳条带并进行蛋白质谱分析，以筛选出ATF3可能的结合蛋白，再通过co-IP验证二者是否相互结合。利用肝癌组织，结合IHC及WB检测并分析ATF3和筛选出的蛋白质在HCC发生发展中的作用，探讨二者的相互作用与HCC发生发展可能的分子机制。结果：（1）RT-PCR相对定量检测了53对HCC和10例正常肝组织中ATF3基因的水平，结果示ATF3在肝癌组织中的基因水平明显低于远癌肝组织及正常肝组织（P＜0.0001），远癌肝组织与正常肝组织之间差异无显著性（P＝0.6240）；临床病理特征分组中，包膜侵犯的癌组织中ATF3基因水平低于无侵犯组（P＜0.05），而患者性别，肿瘤大小，脉管转移，组织学分级，组织学类型，乙肝表面抗原状态，AFP水平，BCLC分期，生存时间各分组中ATF3基因水平差异无显著性（P＞0.05）；（2）IHC检测了20对HCC和10例正常肝组织中ATF3蛋白的表达，结果示ATF3蛋白定于细胞核内，阳性表达呈核内棕褐色弥漫性表达，在肝癌组织中的染色弱于远癌肝组织及正常肝组织；（3）WB相对定量检测了53对HCC和10例正常肝组织中ATF3蛋白的水平，结果示ATF3在肝癌组织中的蛋白水平明显低于远癌肝组织及正常肝组织（P＜0.05），远癌肝组织与正常肝组织之间差异无显著性（P＝0.3260）；临床病理特征分组中，包膜侵犯的癌组织中ATF3蛋白水平低于无侵犯组（P＜0.05），而患者性别，肿瘤大小，脉管转移，组织学分级，组织学类型，乙肝表面抗原状态，AFP水平，BCLC分期，生存时间各分组中ATF3蛋白水平差异无显著性（P＞0.05）；（4）成功构建过表达ATF3的慢病毒载体，进行慢病毒包装及滴度测定后，感染肝癌细胞株HepG2，随即进行MTT实验，Transwell实验，细胞周期及细胞凋亡检测，结果显示过表达ATF3的HepG2细胞出现了增殖速度减慢，细胞凋亡加速，生长周期阻滞（P＜0.05），而细胞迁移能力改变不明显（P＝0.262）；（5）将过表达ATF3的HepG2细胞及空载体感染的HepG2细胞同时进行IP，以空载体组为对照，检测出过表达组中表达水平呈现差异性的电泳条带数条，送检蛋白质谱分析；（6）蛋白质谱分析后检测出可能与ATF3存在相互结合关系的候选蛋白，经Mascot软件分析及NCBI数据库检索，得到候选蛋白肽段序列等信息，结合实验结果，Pumbed文献，从功能明确的候选蛋白质中，筛选出与ATF3最可能相关的结合蛋白Gelsolin（GSN）。（7）应用co-IP技术，验证了ATF3和GSN之间存在相互结合关系，通过IHC及WB检测出HCC组织切片中ATF3及其相互结合蛋白GSN的表达模式一致；通过功能已明确的GSN蛋白及其与ATF3之间的相关性推测出ATF3在肝癌形成过程中发挥其作用的可能分子机制。结论：（1）肝癌组织中的ATF3基因及蛋白表达水平低于远癌及正常肝组织，包膜受侵犯组织中的ATF3表达水平低于包膜无侵犯组织，推测ATF3在肝癌形成过程中扮演着抑制肿瘤发生发展的角色；（2）过表达ATF3的HepG2细胞株出现了增殖速度减慢，细胞凋亡加速及生长周期阻滞，细胞迁移能力有减弱趋势，推测ATF3通过抑制肿瘤细胞增长，加速肿瘤细胞凋亡及阻滞细胞周期进程的生物学行为发挥其抑制肝癌形成的作用；（3）筛选并验证出GSN与ATF3之间存在相互作用，且二者在肝癌组织中的表达模式一致，推测GSN蛋白可能

关键词：转录激活因子3(Activating Transcription Factor3,ATF3) 肝细胞癌基因表达过表达慢病毒载体蛋白质相互作用

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β防御素124经p38MAPK/AP1通路调控山羊附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达

β防御素124经p38MAPK/AP1通路调控山羊附睾头细胞趋化因子和细胞...

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作者：孟繁荣山西农业大学

学位级别：硕士

β防御素是一种富含阳离子的小肽,在机体免疫调节中起到重要作用。本文旨在研究高度表达在附睾头部的g BD124基因沉默和过表达后对p38MAPK/AP1通路关键蛋白及其下游趋化因子和细胞因子表达的影响。本研究将用课题组已筛选出的有效沉默... 详细信息

β防御素是一种富含阳离子的小肽,在机体免疫调节中起到重要作用。本文旨在研究高度表达在附睾头部的g BD124基因沉默和过表达后对p38MAPK/AP1通路关键蛋白及其下游趋化因子和细胞因子表达的影响。本研究将用课题组已筛选出的有效沉默载体以及过表达载体转染山羊附睾头细胞,设置了空白对照、空载体组对照,用2μg·m L-1嘌呤霉素筛选后分别收集细胞和培养液,采用qRT-PCR、Western blot和ELISA检测了g BD124、MAPK信号通路关键蛋白、细胞因子和趋化因子基因和蛋白表达情况。试验结果如下:1、LV10-gBD124-51与LV10-gBD124-161联合转染组和LV10-NC组的转染效率超过了80%,空白对照组无荧光。与NC对照组相比,g BD124沉默显著降低了山羊附睾头细胞MAPK通路中MAPK1、AP1两个亚型c-JUN和c-FOS基因表达（P<0.05）,增加了RASA1基因表达（P<0.05）;g BD124沉默显著降低了总p38MAPK、总c-JUN和总c-FOS蛋白表达,以及p38MAPK和c-JUN蛋白磷酸化（P<0.05）;g BD124沉默显著上调了MAPK通路下游IL-1β及其受体IL-1R2、IL-8和趋化因子CCL6和CCL21基因表达（P<0.05）,下调了CCL5和IL-1α基因表达（P<0.05）;g BD124沉默显著降低了细胞培养液中CCL5浓度（P<0.05）。与空白对照组相比,g BD124沉默显著增加培养液中IL-1β和IL-8,降低了IL-1α浓度（P<0.05）。2、LV5-gBD124-过表达组以及空载体对照组转染效率超过了80%,空白对照组无荧光。无论是从m RNA水平还是蛋白水平来看,过表达组的g BD124表达量都显著升高（P<0.05）。与LV5-NC组相比,gBD124过表达显著降低了TAB2、MAPK1、MAPK2、MAPK8IPHE、RASA1、RASGRP1基因的表达（P<0.05）;g BD124过表达显著升高了总p38MAPK和总c-FOS蛋白表达,以及p38MAPK蛋白磷酸化（P<0.05）;g BD124过表达显著提高了趋化因子CCL21和细胞因子受体IL-1R2基因的表达（P<0.05）,下调了趋化因子CCL5和CCL6的基因表达（P<0.05）;g BD124过表达显著增加了培养液中MAPK通路下游IL-1α的浓度（P<0.05）。结论:gBD124基因沉默通过抑制p38MAPK/AP1信号通路调控附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达;g BD124过表达通过上调p38MAPK/AP1信号通路活性相关基因和蛋白的表达调控附睾头细胞趋化因子和细胞因子的表达。

关键词：附睾头细胞 β防御素124 shRNA慢病毒载体过表达慢病毒载体 p38MAPK/AP1通路免疫调节山羊

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微粒体前列腺素E合酶1调控EP2受体促进肝癌细胞恶性生物学行为的实验研究

微粒体前列腺素E合酶1调控EP2受体促进肝癌细胞恶性生物学行为的...

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作者：倪慕兰福建医科大学

学位级别：硕士

目的：构建并鉴定微粒体前列腺E合酶1（mPGES1）过表达慢病毒载体；观察mPGES1基因过表达后对肝癌细胞Huh-7体外增殖、迁移侵袭以及体内成瘤能力的影响；检测过表达或下调mPGES1对肝癌细胞中前列腺素E2（PGE2）及其受体EP1、EP2、EP3和... 详细信息

目的：构建并鉴定微粒体前列腺E合酶1（mPGES1）过表达慢病毒载体；观察mPGES1基因过表达后对肝癌细胞Huh-7体外增殖、迁移侵袭以及体内成瘤能力的影响；检测过表达或下调mPGES1对肝癌细胞中前列腺素E2（PGE2）及其受体EP1、EP2、EP3和EP4表达水平的影响。探讨mPGES1调控PGE2及其受体的信号途径促进肝癌细胞增殖、迁移侵袭的可能机制。方法：（1）通过PCR特异性扩增目的基因mPGES1全长。纯化、酶切后与GV287载体连接得到目的基因重组质粒，与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞，包装生产mPGES1过表达慢病毒载体（pGC-LV-mPGES1-GFP）。低温超速浓缩病毒液并检测病毒滴度。（2）使用构建的pGC-LV-mPGES1-GFP感染Huh-7细胞（过表达组），并设pGC-LV-NC-GFP（空载体组）组和未感染组。采用PCR、Western blot等方法鉴定mPGES1基因过表达后的mRNA、蛋白表达水平。采用MTT方法、基质黏附实验、Transwell迁移及侵袭实验及流式细胞技术检测mPGES1基因过表达前后Huh-7细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭以及细胞周期的变化；将三组细胞分别接种于裸鼠皮下，观察各组裸鼠移植瘤生长情况；第21d取瘤，肉眼和镜下观察移植瘤形态差别。（3）用酶联免疫吸附实验（Elisa法）检测过表达或下调mPGES1后肝癌细胞Huh-7或HepG2中PGE2表达水平变化，real-time PCR和Western blot检测过表达或下调mPGES1后肝癌细胞Huh-7或HepG2中PGE2受体EP1、EP2、EP3和EP4表达水平变化。结果：（1）成功构建过表达mPGES1的慢病毒载体（pGC-LV-mPGES1-GFP），测定病毒生物学滴度为2×108TU/mL。（2）与空载体组、未感染组相比，过表达组的mPGES1mRNA和蛋白表达明显升高。（3）与空载体组、未感染组相比，过表达mPGES1的Huh-7细胞体外增殖、黏附、侵袭和迁移能力均不同程度升高。（4）流式细胞术检测结果显示过表达mPGES1的Huh-7细胞处于S期的比例高于空载体组和未感染组。（5）裸鼠移植瘤模型建立过程中，过表达组移植瘤生长速度较其他两组快；接种后21d收获移植瘤，过表达组移植瘤体积及重量均大于其他两组。（6）与空载体组、未感染组相比，过表达mPGES1后Huh-7细胞中PGE2表达水平明显升高；PGE2的EP2表达水平明显升高，EP1、EP3和EP4表达三组中无明显差异。（7）与LV-mPGES1-NC组、control组相比，LV-mPGES1-shRNA下调mPGES1后HepG2细胞中PGE2表达水平明显下降；PGE2的EP2表达水平明显下降，EP1、EP3和EP4表达三组中无明显差异。结论: 1.成功构建过表达mPGES1的慢病毒载体（pGC-LV-mPGES1-GFP），高效转染Huh-7细胞，可稳定、显著的提高mPGES1基因的表达。 2. mPGES1基因过表达促进肝癌细胞体外的增殖、黏附及迁移侵袭能力，并且促进Huh-7细胞裸鼠体内成瘤。 3. mPGES1可能通过调控PGE2-EP2途径促进肝癌细胞的恶性生物学行为。

关键词： mPGES1 肝细胞癌过表达慢病毒载体 EP2

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