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miR-520c-3p对糖尿病肾脏病患者近端肾小管上皮细胞焦亡的影响及机制研究

中华糖尿病杂志 2022年第6期14卷 592-602页

作者：宋怡郭丰甘甜邵明玮范迅捷徐亚楠张薇卫芳祎秦贵军郑州大学第一附属医院内分泌与代谢病科郑州450052

目的探讨miR-520c-3p对糖尿病肾脏病患者近端肾小管上皮细胞焦亡的影响及其分子机制。方法收集2019年6月至2020年12月在郑州大学第一附属医院就诊的糖尿病肾脏病患者(DKD组,4例)和糖耐量正常肾脏肿瘤手术者(正常对照组,4例)的肾脏组织... 详细信息

目的探讨miR-520c-3p对糖尿病肾脏病患者近端肾小管上皮细胞焦亡的影响及其分子机制。方法收集2019年6月至2020年12月在郑州大学第一附属医院就诊的糖尿病肾脏病患者(DKD组,4例)和糖耐量正常肾脏肿瘤手术者(正常对照组,4例)的肾脏组织。HE染色、过碘酸-希夫染色(PAS)和透射电镜观察肾脏组织病理学变化。取生长状态良好的人近端肾小管上皮(HK-2)细胞传代至培养板内,并分成如下8组:正常葡萄糖组(NG,5.6 mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG,30.0 mmol/L葡萄糖)、抑制物组(正常葡萄糖+转染miR-520c-3p抑制物)、抑制物对照组(正常葡萄糖+转染miR-520c-3p抑制物阴性对照物)、模拟物组(高糖+转染miR-520c-3p模拟物)、模拟物对照组(高糖+转染miR-520c-3p模拟物阴性对照物)、模拟物+TXNIP共转染组(高糖+共转染miR-520c-3p模拟物+TXNIP)、共转染阴性对照组(高糖+共转染miR-520c-3p模拟物+TXNIP阴性对照物)。活细胞动态实时监测细胞活性,碘化丙啶(PI)染色检测细胞焦亡情况;免疫荧光染色、荧光原位杂交、实时定量PCR和Western blotting法检测miR-520c-3p、硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)和细胞焦亡分子NOD样受体蛋白3(NLRP3)、活化半胱氨酸蛋白酶-1(cl-caspase-1)、消皮素D(GSDMD)的mRNA和蛋白表达水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞上清液白细胞介素-1β(IL-1β)含量;双荧光素酶报告基因实验明确miR-520c-3p和TXNIP之间的相互作用。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果与对照组相比,DKD组肾脏组织肾小管炎性细胞增多,伴随miR-520c-3p表达水平下降,TXNIP表达升高(均P<0.05);肾小管特异性标志物水通道蛋白1(AQP1)与NLRP3和GSDMD焦亡蛋白共定位均增加。在HK-2细胞中,与NG组相比,HG组焦亡细胞增多,伴随miR-520c-3p表达水平下降,TXNIP、NLRP3、cl-caspase-1、GSDMD的蛋白水平和细胞上清液IL-1β浓度升高(均P<0.05);与模拟物对照组相比,模拟物组中miR-520c-3p表达量更高,TXNIP mRNA表达量更低,TXNIP、NLRP3、cl-caspase-1、GSDMD的蛋白水平和IL-1β浓度更低(均P<0.01),TXNIP和NLRP3共表达定位减少(P<0.05);与抑制物对照组相比,抑制物组中miR-520c-3p表达量更低,TXNIP mRNA表达量更高,TXNIP、NLRP3、cl-caspase-1、GSDMD的蛋白水平和IL-1β浓度更高(均P<0.01)。与共转染阴性对照组相比,模拟物+TXNIP共转染组的TXNIP和NLRP3共表达定位增加,TXNIP、NLRP3、cl-caspase-1、GSDMD的蛋白水平更高(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验表明,TXNIP是miR-520c-3p直接作用靶点,miR-520c-3p通过靶向调节TXNIP表达,抑制高糖诱导的细胞焦亡。结论miR-520c-3p通过抑制TXNIP/NLRP3途径减轻高糖诱导的近端肾小管上皮细胞焦亡。

关键词：糖尿病糖尿病肾病近端肾小管上皮细胞细胞焦亡 miR-520c-3p 硫氧还蛋白相互作用蛋白

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高胰岛素对近端肾小管上皮细胞利用β-羟丁酸供能的影响

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中华糖尿病杂志 2022年第2期14卷 179-185页

作者：解金兰常宝成郭振红王靖宇高忠爱钟菲菲杨菊红天津医科大学朱宪彝纪念医院内分泌研究所天津市内分泌研究所国家卫健委激素与发育重点实验室天津市代谢性疾病重点实验室天津300134

目的研究高胰岛素对低糖环境下近端肾小管上皮(HK2)细胞利用β-羟丁酸(BHB)供能的影响及其机制。方法在无糖及低糖环境下,用不同浓度BHB(0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L)干预HK2细胞24 h,检测BHB对HK2细胞增殖能力的影响。在不同时... 详细信息

目的研究高胰岛素对低糖环境下近端肾小管上皮(HK2)细胞利用β-羟丁酸(BHB)供能的影响及其机制。方法在无糖及低糖环境下,用不同浓度BHB(0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L)干预HK2细胞24 h,检测BHB对HK2细胞增殖能力的影响。在不同时间(0、6、12、24、48 h)下,检测2.0 mmol/L BHB对HK2细胞三磷酸腺苷(ATP)产生的影响。将HK2细胞分为正常对照(NC)组、低糖(LG)组、BHB干预(LG+BHB)组和高胰岛素(LG+BHB+HI)组,检测HK2细胞促凋亡基因Bax mRNA表达水平,抗凋亡基因Bcl2 mRNA、细胞凋亡数量、回吸收白蛋白、ATP产生、线粒体数量以及过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子-1α(PGC1α)、线粒体融合蛋白1(Mfn1)、线粒体动力相关蛋白1(DRP1)蛋白及mRNA表达水平变化。采用不同浓度的胰岛素(5、50 ng/ml)干预HK2细胞,检测Na+偶联单羧酸转运蛋白1(SMCT1)蛋白及mRNA表达水平。两组间比较采用t检验,多组之间比较采用单因素方差分析。结果在无糖环境下,与0 mmol/L BHB组相比,2.0 mmol/L BHB组HK2细胞增殖能力增加(P<0.05);在低糖环境下,与0 mmol/L BHB组相比,2.0 mmol/L BHB组细胞增殖能力无明显变化(P>0.05)。与2.0 mmol/L BHB干预0 h组相比,2.0 mmol/L BHB干预24 h组HK2细胞ATP产生明显增加(P<0.05)。与NC组相比,LG组HK2细胞Bax mRNA表达、细胞凋亡数量、DRP1 mRNA表达均增加(P<0.05),Bcl2 mRNA表达水平、细胞回吸收白蛋白、ATP产生、PGC1α、Mfn1蛋白表达均降低(P<0.05);与LG组相比,LG+BHB组HK2细胞Bax mRNA、细胞凋亡数量、DRP1 mRNA表达均降低(P<0.05),Bcl2 mRNA表达、细胞回吸收白蛋白、ATP产生、PGC1α、Mfn1 mRNA及蛋白表达均增加(P<0.05);与LG+BHB组相比,LG+BHB+HI组HK2细胞Bax mRNA、细胞凋亡数量和DRP1 mRNA表达均增加(P<0.05),Bcl2 mRNA、细胞回吸收白蛋白、ATP产生、PGC1α、Mfn1 mRNA及蛋白表达均降低(P<0.05)。与5 ng/ml胰岛素干预组相比,50 ng/ml胰岛素组细胞SMCT1蛋白及mRNA表达均降低(P<0.05)。结论高胰岛素可抑制近端肾小管上皮细胞对酮体的利用,机制可能与其抑制酮体回吸收蛋白SMCT1的表达有关。

关键词：高胰岛素血症 β-羟丁酸线粒体近端肾小管上皮细胞

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大黄酸对高糖和血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞肥大的影响

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中药材 2010年第4期33卷 570-574页

作者：余德芊高原刘晓红遵义医学院生理学教研室贵州遵义563003 遵义医学院珠海校区生理学教研室广东珠海519041

目的:探讨大黄酸(Rhein)对高糖和血管紧张素Ⅱ(angiotensin,AngⅡ)诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞肥大的影响。方法:麻醉下,无菌分离大鼠单根近球小管并培养,以免疫细胞化学方法鉴定体外培养的肾小管上皮细胞。在高糖(30 mmol/L)环境下用... 详细信息

目的:探讨大黄酸(Rhein)对高糖和血管紧张素Ⅱ(angiotensin,AngⅡ)诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞肥大的影响。方法:麻醉下,无菌分离大鼠单根近球小管并培养,以免疫细胞化学方法鉴定体外培养的肾小管上皮细胞。在高糖(30 mmol/L)环境下用AngⅡ(10-7mol/L)刺激肾小管上皮细胞肥大。与此同时,加入不同浓度的大黄酸(30、15、5 mg/L),作用72 h后检测细胞体积、3H-亮氨酸掺入量以及蛋白质含量以观察细胞肥大的变化。结果:高糖(30 mmol/L)+AngⅡ(10-7mol/L)培养72 h导致细胞体积显著增大,3H-亮氨酸掺入量及细胞内蛋白质含量显著增加。加入大黄酸处理72 h后,大黄酸30 mg/L可显著降低高糖和AngⅡ所致的细胞体积增大、3H-亮氨酸掺入量及细胞内蛋白质含量的升高。大黄酸15 mg/L降低了3H-亮氨酸掺入量及细胞内蛋白质含量,而对细胞体积无显著抑制作用。大黄酸5 mg/L可降低细胞内蛋白质含量,而对细胞体积及3H-亮氨酸掺入量无显著抑制作用。结论:大黄酸能抑制高糖和AngⅡ诱导的肾小管上皮细胞肥大。

关键词：大黄酸高糖血管紧张素Ⅱ 近端肾小管上皮细胞细胞肥大

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高糖刺激对大鼠近端肾小管上皮细胞脂联素受体表达的影响

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武汉大学学报（医学版） 2013年第5期34卷 641-645页

作者：吴少林吴小燕李维为李晓宁高苹武汉大学中南医院肾内科湖北武汉430071

目的:观察体外高糖环境下大鼠近端肾小管上皮细胞脂联素受体基因及其蛋白表达变化。方法:正常大鼠近端肾小管上皮细胞细胞株(NRK-52E)常规培养于含10%灭活新生胎牛血清的低糖DMEM培养液传代培养,待细胞生长至亚融合状态时,更换为无胎牛... 详细信息

目的:观察体外高糖环境下大鼠近端肾小管上皮细胞脂联素受体基因及其蛋白表达变化。方法:正常大鼠近端肾小管上皮细胞细胞株(NRK-52E)常规培养于含10%灭活新生胎牛血清的低糖DMEM培养液传代培养,待细胞生长至亚融合状态时,更换为无胎牛血清低糖DMEM培养基培养24h使其同步化,将NRK-52E细胞分为5组:A组为正常对照组,低糖DMEM完全培养液(含D-葡萄糖5.5mmol/L);B组为高糖刺激12h组:高糖DMEM完全培养液(含D-葡萄糖25mmol/L)刺激12h;C组为高糖刺激24h组:高糖DMEM完全培养液刺激24h;D组为高糖刺激48h组:高糖DMEM完全培养液刺激48h;E组为高糖刺激72h组:高糖DMEM完全培养液刺激72h。然后分别提取各组总RNA和总蛋白,分别用RT-PCR检测各组目的基因AdipoR 1/2mRNA的表达,Western印迹法检测各组目的蛋白AdipoR 1/2蛋白的表达。结果:脂联素受体1(AdipoR1)和脂联素受体2(AdipoR2)在NRK-52E细胞中均有表达;在高糖刺激情况下,随着刺激时间的延长,目的基因AdipoR 1/2mRNA的表达均有先增高后降低的趋势,在刺激24h时升高到最高点,和对照组相比有统计学意义(P<0.05);与正常对照组相比,高糖刺激后各时间点AdipoR 1/2蛋白的表达有上升的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:NRK-52E细胞AdipoR1/2蛋白的表达不受高糖刺激的影响;高糖影响NRK-52E细胞AdipoR1/2mRNA的表达,并随着刺激时间的延长表现出先增高后降低。高糖通过影响脂联素受体基因的表达从而影响脂联素发挥其生物学作用,以致影响大鼠近端肾小管上皮细胞的功能。

关键词：大鼠近端肾小管上皮细胞脂联素脂联素受体高糖

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大鼠近端肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定

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中国老年学杂志 2010年第3期30卷 334-336页

作者：王光兰陈爽张丽红范颖石英爱孙华君刘晓会吴珊吉林大学白求恩医学院病理生物学教育部重点实验室吉林长春130021

目的建立较好的大鼠近端肾小管上皮细胞原代培养模型。方法无菌取Wistar大鼠肾脏,取皮质剪碎,经Ⅰ型胶原酶消化和45%Percoll连续密度梯度离心进行纯化,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基原代培养并传代,观察细胞形态并以免疫细胞化学染... 详细信息

目的建立较好的大鼠近端肾小管上皮细胞原代培养模型。方法无菌取Wistar大鼠肾脏,取皮质剪碎,经Ⅰ型胶原酶消化和45%Percoll连续密度梯度离心进行纯化,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基原代培养并传代,观察细胞形态并以免疫细胞化学染色及酶化学染色鉴定。结果培养4～5d细胞融合成单层,呈典型的鹅卵石样,细胞角蛋白18及碱性磷酸酶染色均呈阳性,细胞可传2～3代。结论此法可在短期获得数量较多、重复性好的近端肾小管上皮细胞,为体外研究肾小管细胞的病变提供了实验平台。

关键词：近端肾小管上皮细胞原代培养大鼠

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狼疮肾炎患者尿蛋白通过p38丝裂素活化蛋白激酶信号途径刺激近端肾小管上皮细胞上调表达骨调素

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中华肾脏病杂志 2005年第6期21卷 351-355页

作者：刘冠贤邓安国刘建社段文娟文琼骆宁李晓艳余学清华中科技大学同济医学院附属协和医院肾内科武汉430022 广州中山大学附属第一医院肾内科

目的探讨p38丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在狼疮肾炎(LN)尿蛋白介导近端肾小管上皮细胞(HK-2)表达骨调素(OPN)中的作用。方法收集狼疮肾炎患者24 h的尿液提纯总蛋白,体外刺激HK-2细胞,分别用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和Wester... 详细信息

目的探讨p38丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在狼疮肾炎(LN)尿蛋白介导近端肾小管上皮细胞(HK-2)表达骨调素(OPN)中的作用。方法收集狼疮肾炎患者24 h的尿液提纯总蛋白,体外刺激HK-2细胞,分别用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western印迹法观察应用p38 MAPK特异性阻断剂SB203580对HK-2细胞表达OPN mRNA及蛋白的影响;免疫荧光法检测OPN及其受体CD44在细胞中的表达。结果狼疮肾炎患者尿蛋白可刺激HK-2 细胞OPN mRNA及蛋白上调表达,并呈时间和浓度依赖性,而SB203580可明显抑制这一作用。结论狼疮肾炎尿蛋白可通过p38 MAPK途径刺激HK-2细胞OPN mRNA和蛋白上调表达。

关键词：近端肾小管上皮细胞狼疮肾炎上调表达蛋白激酶信号途径骨调素患者 p38丝裂素活化蛋白激酶逆转录-聚合酶链式反应 SB203580 Western印迹法 HK-2细胞 p38MAPK 白通 mRNA MAPK途径免疫荧光法浓度依赖性 OPN 尿蛋白

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中介素对大鼠近端肾小管上皮细胞缺氧复氧模型的保护作用

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中华肾脏病杂志 2010年第5期26卷 388-389页

作者：周芸李荣山乔晞崔晓燕白波邵珊山西医科大学第一医院综合科太原030001 山西医科大学第二医院肾内科

中介素（IMD）是2004年发现的降钙素基因相关肽（CGRP）超家族成员，在肾脏有很高的表达和分泌，可增加肾血流量、尿量，降低肾血管阻力。IMD可通过环磷酸腺苷（cAMP）蛋白激酶A（PKA）途径减轻心脏缺血再灌注（I／R）损伤。本研究以大... 详细信息

中介素（IMD）是2004年发现的降钙素基因相关肽（CGRP）超家族成员，在肾脏有很高的表达和分泌，可增加肾血流量、尿量，降低肾血管阻力。IMD可通过环磷酸腺苷（cAMP）蛋白激酶A（PKA）途径减轻心脏缺血再灌注（I／R）损伤。本研究以大鼠近端肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧复氧（H／R）模型模拟在体I／R，探讨1MD对肾脏I／R损伤的作用。

关键词：近端肾小管上皮细胞细胞缺氧复氧模型模拟中介素保护作用大鼠降钙素基因相关肽心脏缺血再灌注

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不同病理类型肾病患者尿蛋白成分对人近端肾小管上皮细胞的作用研究

不同病理类型肾病患者尿蛋白成分对人近端肾小管上皮细胞的作用研...

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作者：彭晖中山大学

学位级别：博士

蛋白尿作为肾脏疾病的症状同时也是加重肾脏疾病进展的独立危险因素,对尿中蛋白成分及组分的改变检测在肾脏疾病的诊断和预后中具有极为重要的临床意义.尽管目前国内外有众多的研究对蛋白尿在肾间质纤维化中的作用进行了探讨,但几乎所... 详细信息

蛋白尿作为肾脏疾病的症状同时也是加重肾脏疾病进展的独立危险因素,对尿中蛋白成分及组分的改变检测在肾脏疾病的诊断和预后中具有极为重要的临床意义.尽管目前国内外有众多的研究对蛋白尿在肾间质纤维化中的作用进行了探讨,但几乎所有的体外研究都采用血清中提纯的蛋白成分进行,也没有回答为什么在某些类型肾脏疾病,即使尿蛋白的含量并不很大,却可以伴发很严重的小管间质炎症损伤,并迅速进展至肾间质纤维化,而在另外一些病理类型的肾脏疾病,尽管尿蛋白量很大、持续时间很长,而肾小管间质炎症反应却很轻微,极少发展至肾间质纤维化等问题.因而了解不同病理类型肾脏疾病的尿蛋白组成,以及不同的尿蛋白成分对肾脏固有细胞的毒性作用,对于肾脏疾病的诊断、治疗和预后有着现实的临床意义.本实验的目的在于:1.观察不同病理类型以及相同病理类型不同发展阶段的肾脏疾病患者尿蛋白总量、成分、组成比例的差异,及其与肾脏病理组织学改变的联系.2.提纯、比较不同病理类型肾脏疾病患者尿蛋白成分.3.比较不同病理类型肾脏疾病患者尿蛋白成分与人血清蛋白提纯物对人近端肾小管上皮细胞的增殖、转分化以及细胞因子表达的影响.

关键词：肾间质纤维化微小病变膜性肾病近端肾小管上皮细胞蛋白尿白蛋白 IgG 增殖转分化单核细胞趋化因子骨调素/CD44 RANTES 转化生长因子-β1

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糖化白蛋白诱导人近端肾小管上皮细胞产生损伤与炎性反应的表达

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首都医科大学学报 2017年第2期38卷 289-294页

作者：段楠刘怡李海霞焦莉莉北京大学第一医院检验科北京100034

目的探讨在糖化白蛋白(glycated albumin,GA)刺激下,人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞系)中肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1)、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)及炎性反应相关细胞因子的表达情况。方法分别采用不同浓度的GA与白蛋白(albumin,Alb)刺激HK-2细胞12 h、24 h及48 h,通过real-time PCR和酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunesorbent assay,ELISA)分别检测NGAL、KIM-1的mRNA表达与蛋白释放水平,并运用流式液相多重蛋白定量技术检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)和可溶性细胞间黏附分子-1(soluble intercellular cell adhesion molecule-1,sICAM-1)等细胞因子的浓度。结果与对照组与Alb组比较,GA刺激HK-2细胞12 h、24 h和48 h均能显著上调KIM-1和NGAL的mRNA表达(P<0.05)以及KIM-1和NGAL蛋白的释放(P<0.05);GA组sICAM-1、VEGF与IL-8水平在各时间点均高于Alb组和对照组(P<0.05)。结论 GA能上调KIM-1和NGAL mRNA的表达与蛋白的释放,并促进炎性细胞因子的分泌从而对肾小管造成损伤,提示GA可反映糖尿病肾脏受累情况。

关键词：糖化白蛋白近端肾小管上皮细胞肾损伤分子-1 中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白细胞因子

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人近端肾小管上皮细胞的原代培养

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上海第二医科大学学报 2005年第4期25卷 388-391页

作者：严玉澄钱家麒戴慧莉许雁萍上海第二医科大学仁济医院肾脏科上海200001

目的应用组织块培养法建立人近端肾小管上皮细胞的原代培养方法。方法取肾皮质组织块,应用无血清培养液进行原代培养,融合后用胰蛋白酶-EDTA消化传代。取第三代细胞检测细胞角蛋白、波形蛋白、碱性磷酸酶、结蛋白、Ⅷ因子、α-肌动蛋白... 详细信息

目的应用组织块培养法建立人近端肾小管上皮细胞的原代培养方法。方法取肾皮质组织块,应用无血清培养液进行原代培养,融合后用胰蛋白酶-EDTA消化传代。取第三代细胞检测细胞角蛋白、波形蛋白、碱性磷酸酶、结蛋白、Ⅷ因子、α-肌动蛋白的表达,应用扫描电镜和透射电镜观察细胞的超微结构。结果融合的上皮单层细胞呈铺路石样表现,伴圆顶(dome)形成。细胞角蛋白、波形蛋白和碱性磷酸酶染色阳性,α-肌动蛋白、Ⅷ因子相关抗原、纤维连接蛋白和结蛋白染色阴性。细胞存在极性,细胞尖端存在短的微绒毛,细胞之间连接紧密。结论应用组织块培养法结合无血清培养液可以成功建立原代人近端肾小管上皮细胞系。

关键词：细胞培养近端肾小管上皮细胞无血清培养液细胞角蛋白波形蛋白碱性磷酸酶

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