检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：蒋春艳南京医科大学

学位级别：硕士

2006年,Yamanaka等系统研究小鼠和人胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ES)多能性相关因子时发现4个转录因子:Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc(OSKM)可以成功将成纤维细胞重编程为ES样细胞,称之为诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem cells, iPS细胞),该细胞在形态、多能性维持和分化潜能上与胚胎干细胞一致,且避免了伦理学争议和异体细胞移植排斥等问题[1, 2]。因此,iPS细胞已代替ES细胞在疾病模型、毒理学研究、药物敏感性筛选、替代治疗等方面发挥重要作用。本文目的之一是借鉴国内外通行的技术,在本学科的干细胞中心建立人真皮成纤维细胞的iPS细胞,并对方法进行优化。其次,对于iPS冷冻保存,同ES一样,目前还没有非常有效或者标准化的冷冻保存技术。当前广泛采用的“慢冻-快融法”冷冻保存技术,在应用于iPS细胞时存在着复苏效率低下、解冻后大量克隆团块死亡或自发分化的问题。因此,本文第二部分的工作是研究一种简单、经济、实用、有效的冷冻保存及复苏方法,以满足iPS的冷冻保存和研究的需要。目的: 1)建立两种类型的人成体细胞系:真皮成纤维细胞和毛囊细胞细胞系,借助逆转录病毒载体法将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种基因导入成纤维细胞,进而将其重编程为iPS细胞。建立该技术平台,为本学科开展iPS细胞相关研究及应用奠定了基础。 2)建立和研究麦管玻璃化法冷冻保存人诱导多能干细胞的方法,并进行可行性评估。方法: 一、逆转录病毒介导的人诱导多能干细胞建系方法的相关研究 1.获得两种人成体细胞签署知情同意后,采用标准消化法从外科手术时切除的患者皮肤中获得人皮肤成纤维细胞和拔取的含完整根鞘的毛囊在神经干细胞培养液贴壁生长获得毛囊细胞。 2.逆转录病毒质粒鉴定? 逆转录病毒质粒pMX-hOCT4,pMX-hSOX2,pMX-hKLF4,pMX-hc-Myc, pMX-GFP系统经过转化扩增酶切鉴定,OCT4经Xho I、pMX-hSOX2,pMX-hKLF4,及pMX-hc-Myc经Not I进行酶切,产物用2%的琼脂糖凝胶电泳。? 3. pMX逆转录病毒系统生产及感染能力鉴定按脂质体介导的瞬时转染标准方法,用PLAT A细胞包装pMX-GFP病毒,48h后观察绿色荧光;用病毒上清感染成纤维细胞,24～48h后荧光显微镜下观察绿色荧光,并以流式细胞仪检测感染效率。 4.逆转录病毒载体法重编程成体细胞为iPS细胞用1:1:1:1的OSKM混合逆转录病毒感染提前24h准备的细胞总数为1x105的人成纤维细胞,同时采用pMX-GFP病毒感染相同数目的体细胞作用感染效果指示,并选用10ng/ml聚凝胺增加感染效率;24小时后重复一次,可重复3次。最后一次重复24小时后转移感染后细胞到饲养层细胞上,24小时后换成ES培养液,之后每天更换培养液,观察细胞形态变化并记录第一个克隆出现时间,直到第二十天克隆足够大时挑克隆扩大培养。 5.人iPS的特性鉴定原代克隆行AKP染色和TRA-1-81活细胞染色鉴定;iPS细胞系传代培养至第10代后,进行核型分析;通过RT-PCR法和间接免疫荧光法检测人ES细胞标志性基因表达;检测OCT4启动子在诱导前后的甲基化表达变化;悬浮培养观察拟胚体形成及分化情况;iPS细胞接种至SCID小鼠皮下,观察畸胎瘤形成情况。二、麦管玻璃化法冷冻人iPS细胞将机械法切割的HDF-iPS细胞团块,依次在10%玻璃化冷冻液和20%玻璃化冷冻液中处理后保存于20%的冷冻液中,封装于0.25mL麦管并快速置于液氮中保存。解冻时将iPS团块依次置入0.2M蔗糖溶液和0.1M蔗糖溶液后,接种至饲养层上培养。检测复苏效率,并对解冻后长期培养的iPS细胞进行特性鉴定,包括:碱性磷酸酶染色、OCT4等多能因子免疫荧光染色、RT-PCR法检测内源性干细胞因子Oct4和Sox2的表达、拟胚体分化、神经细胞分化和畸胎瘤分化能力检测等。结果: 一、人诱导多能干细胞系的建立 1.获得两种人成体细胞:采用标准消化法从外科手术时切除皮肤中获得人皮肤成纤维细胞,成长梭状,生长迅速,可稳定传代及冷冻保存;直接拔取的含完整根鞘的毛囊在神经干细胞培养液中贴壁生长获得呈椭圆形,聚集生长的毛囊细胞。 2.逆转录病毒质粒成功转化后酶切,产物经2%琼脂糖凝胶电泳均可见预期大小的条带。 ***逆转录病毒包装及鉴定:由于PMX-OSKM无GFP指示,以携带EGFP基因的pMX-GFP作为阳性参照,将pMX-G

关键词：逆转录病毒载体法诱导性多潜能干细胞玻璃化冷冻保存麦管

来源：评论

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