检索结果-内蒙古大学图书馆

黑龙江畜牧兽医 2018年第17期 10-12+230页

作者：杜文敬梁洋朴善花王春生安铁洙东北林业大学生命科学学院

为了建立通过转基因动物获得蜘蛛拖丝蛋白的方法,试验利用前期构建的蜘蛛拖丝蛋白基因(2S)逆转录病毒载体侵染小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),通过嵌合体法制备转基因小鼠,并用PCR技术进行鉴定。结果表明:成功获得嵌合体小鼠;... 详细信息

为了建立通过转基因动物获得蜘蛛拖丝蛋白的方法,试验利用前期构建的蜘蛛拖丝蛋白基因(2S)逆转录病毒载体侵染小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),通过嵌合体法制备转基因小鼠,并用PCR技术进行鉴定。结果表明:成功获得嵌合体小鼠;目的基因2S-IRES-EGFP已整合入F0代及F1代嵌合体小鼠的鼠尾基因组中。说明利用逆转录病毒可成功获得表达蜘蛛拖丝蛋白基因(2S)的转基因小鼠。

关键词：蜘蛛拖丝蛋白基因逆转录病毒载体小鼠胚胎干细胞嵌合体转基因显微注射

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逆转录病毒载体介导双靶区乙型肝炎病毒反义RNA模型的构建

逆转录病毒载体介导双靶区乙型肝炎病毒反义RNA模型的构建

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作者：彭炤源兰州大学

学位级别：硕士

目的:构建在真核细胞内转录表达乙型肝炎病毒(HBV)双靶区反义核酸重组载体用以抗HBV基因治疗研究。方法:合成互补于HBV(ayw亚型)X区核苷酸X片段以及互补于HBV P区的P片段，X片段两端分别含有SpeⅠ和BamHⅠ酶切后粘性末端。P片段两... 详细信息

目的:构建在真核细胞内转录表达乙型肝炎病毒(HBV)双靶区反义核酸重组载体用以抗HBV基因治疗研究。方法:合成互补于HBV(ayw亚型)X区核苷酸X片段以及互补于HBV P区的P片段，X片段两端分别含有SpeⅠ和BamHⅠ酶切后粘性末端。P片段两端分别含有AvrⅡ和BclⅠ酶切后粘性末端。逆转录病毒载体pLXSN用相同的限制性内切酶酶切后，利用基因重组技术将X、P片段分别正向、反向插入逆转录病毒载体pLXSN的相应酶切位点构建成单靶区重组载体质粒。在构建单靶区载体质粒的基础上，类似方法再构建双靶区重组载体质粒。结果:经酶切电泳、PCR扩增和DNA测序鉴定成功构建了HBV双靶区反义核酸重组载体。结论:为下一步观察双靶区反义RNA对HBV转基因鼠HBV DNA复制和表达的抑制作用作出了基础。为探索在真核细胞内转录表达HBV反义RNA的方法及研究多基因区抗病毒治疗和抗变异病毒打下基础。

关键词：乙型肝炎病毒反义RNA 逆转录病毒载体基因治疗

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逆转录病毒载体MFG-IX的构建及其体外表达的研究

逆转录病毒载体MFG-IX的构建及其体外表达的研究

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作者：杨建民第二军医大学

学位级别：硕士

该研究所构建的逆转录病毒载体MFG-IX系国内外首次构建成功,且在体外获得较好表达,免疫细胞化学法和免疫荧光法用于检测转基因细胞人因子IX的表达,在国内外尚未见报道.通过研究发现:造血细胞的基因转移效率尚有待进一步提高,有必要进一... 详细信息

该研究所构建的逆转录病毒载体MFG-IX系国内外首次构建成功,且在体外获得较好表达,免疫细胞化学法和免疫荧光法用于检测转基因细胞人因子IX的表达,在国内外尚未见报道.通过研究发现:造血细胞的基因转移效率尚有待进一步提高,有必要进一步松建不同种类的载体,以提高外源基因在靶细胞中的表达水平,延长表示时间.

关键词：血友病逆转录病毒载体免疫细胞化学造血细胞基因转移

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逆转录病毒载体介导的RNAi抑制MCF-7细胞E2F1、TS表达的研究

逆转录病毒载体介导的RNAi抑制MCF-7细胞E2F1、TS表达的研究

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作者：黄慧敏郑州大学

学位级别：硕士

转录因子E2F1(transcription factor E2F1)在细胞G1-S期生长调控中起着重要的作用,许多编码DNA复制和细胞生长所需蛋白的基因都具有E2F1识别位点,受E2F1调控,因而E2F1在调控细胞周期进展和细胞增生过程中起着关键性的作用。E2F1在肿瘤... 详细信息

转录因子E2F1(transcription factor E2F1)在细胞G1-S期生长调控中起着重要的作用,许多编码DNA复制和细胞生长所需蛋白的基因都具有E2F1识别位点,受E2F1调控,因而E2F1在调控细胞周期进展和细胞增生过程中起着关键性的作用。E2F1在肿瘤发展过程中的作用非常复杂,至今未完全清楚。目前研究表明,E2F1高表达可能是大多数人类肿瘤发生、发展过程中的一个重要因素。E2F1表达失控会导致细胞增殖失控,促进肿瘤形成、发展和转移。在乳腺癌中,E2F1表达升高与乳腺癌的浸润性有关,是乳腺癌的预后因子。胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase,TS)是合成胸苷酸的关键酶,在DNA合成与修复过程中起着重要作用,与细胞分裂和增生关系密切。TS还是抗癌药物5-氟尿嘧啶(5-FU)的作用靶点。5-FU通过抑制TS活性阻断DNA合成而发挥抗肿瘤的作用。有证据表明肿瘤组织中TS高表达能够促进肿瘤的形成和发展,并且对5-FU产生耐受性。目前研究认为TS表达与E2F1关系密切,TS具有E2F1识别位点,TS表达受E2F1调控,E2F1的高表达将促进TS的表达。研究显示,一些高表达E2F1、TS的肿瘤组织对传统的化疗方法敏感性下降,疗效不佳,易引起肿瘤复发和转移。乳腺癌是严重危害人类生命健康的常见的恶性肿瘤之一,我国乳腺癌的流行病学特点是发病率逐年升高并呈年轻化的趋势。随着治疗方法的改进,化疗已逐步成为乳腺癌综合治疗的重要组成部分。然而,化疗耐药是化疗药物疗效不佳的主要原因,是当今肿瘤治疗的一大难题。自基因治疗研究开展以来,人们把基

关键词： E2F1 TS 逆转录病毒载体 RNAi RT-PCR Western Blot

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mIL-12重组逆转录病毒载体的构建及包装细胞系的建立

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吉林大学学报（医学版） 2006年第2期32卷 254-256页

作者：李菁华陈东刘颖吉林大学基础医学院病原生物学教研室吉林长春130021 吉林大学基础医学院组织学与胚胎学教研室吉林长春130021

目的:构建mIL-12重组逆转录病毒载体。方法:将mIL-12 DNA克隆到载体pLEGFP,用该重组质粒转染PA317包装细胞获得重组逆转录病毒。结果:重组质粒pLEGFP-mIL12酶切及PCR产物在2 290 bp区域见强荧光条带与mIL-12基因大小相符;转染PA317细胞... 详细信息

目的:构建mIL-12重组逆转录病毒载体。方法:将mIL-12 DNA克隆到载体pLEGFP,用该重组质粒转染PA317包装细胞获得重组逆转录病毒。结果:重组质粒pLEGFP-mIL12酶切及PCR产物在2 290 bp区域见强荧光条带与mIL-12基因大小相符;转染PA317细胞后的上清感染NIH3T3细胞后,经共聚焦显微镜能观察到融合蛋白的表达。结论:包装细胞上清中有含mIL-12 DNA的重组逆转录病毒,mIL-12重组逆转录病毒可感染NIH3T3细胞并在细胞中进行有效的复制。

关键词： mIL-12基因逆转录病毒载体包装细胞

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逆转录病毒载体介导的hLIF基因真核稳定表达体系的建立

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苏州大学学报（医学版） 2008年第3期28卷 353-356,F0002页

作者：苗莉郁心谢宇锋盛伟华杨吉成刘铁连单云波井莹莹胡志清缪竞诚连云港市第一人民医院江苏连云港222000 无锡市中心血站江苏无锡214000 苏州大学医学部细胞分子生物学教研室江苏苏州215123

目的构建逆转录病毒载体介导的人白血病抑制因子(human leukemia inhibitory factor,hLIF)基因真核稳定表达细胞株。方法采用DNA重组技术,构建并鉴定重组逆转录病毒载体pEGZ/MCS-HA-hLIF;以脂质体转染法,将重组逆转录病毒载体与辅助质粒... 详细信息

目的构建逆转录病毒载体介导的人白血病抑制因子(human leukemia inhibitory factor,hLIF)基因真核稳定表达细胞株。方法采用DNA重组技术,构建并鉴定重组逆转录病毒载体pEGZ/MCS-HA-hLIF;以脂质体转染法,将重组逆转录病毒载体与辅助质粒HIT456、HIT60共转染入包装细胞系293T包装逆转录病毒,感染人胚肾成纤维细胞系,经zeocin筛选获得真核稳定表达细胞株;采用RT-PCR法和ELISA法鉴定hLIF基因的转录和翻译,并检测表达上清中hLIF因子对人白血病细胞HL-60的生物学活性。结果PCR产物电泳后于609 bp处见特异性条带。双酶切出现两条带,其中位于609 bp处可见相应条带。核酸测序结果与GenBank中所报道的hLIF基因的CDS序列完全一致。RT-PCR结果显示表达细胞中存在hLIF基因转录,ELISA结果测定表达上清中hLIF的浓度为110.134 pg/ml。结论携带hLIF基因的重组逆转录病毒载体pEGZ/MCS-HA-hLIF构建成功,并且获得了稳定表达hLIF基因的人胚肾成纤维细胞株,这为此基因的临床应用和实验研究打下了基础。

关键词：人白血病抑制因子逆转录病毒载体基因重组真核表达

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逆转录病毒载体介导shRNA抑制猪瘟病毒在PK-15细胞中增殖的研究

逆转录病毒载体介导shRNA抑制猪瘟病毒在PK-15细胞中增殖的研究

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作者：李江南吉林大学

学位级别：硕士

本研究用逆转录病毒载体成功介导了特异性shRNA在PK-15细胞中抑制猪瘟病毒shimen株的增殖,干扰基因N1和N2针对猪瘟病毒Npro基因,S10和S11分别针对猪瘟病毒NS3基因和NS4A基因。首先构建了含H1启动子表达猪瘟病毒特异性shRNA的重组质粒pLN... 详细信息

本研究用逆转录病毒载体成功介导了特异性shRNA在PK-15细胞中抑制猪瘟病毒shimen株的增殖,干扰基因N1和N2针对猪瘟病毒Npro基因,S10和S11分别针对猪瘟病毒NS3基因和NS4A基因。首先构建了含H1启动子表达猪瘟病毒特异性shRNA的重组质粒pLN-N1、pLN-N2、pLN-S10、pLN-S11。构建的重组质粒分别与pVSV-G共转染GP2-293细胞,包装出复制缺陷型重组逆转录病毒rMLV-N1、rMLV-N2、rMLV-S10和rMLV-S11,电镜观察和病毒滴度测定证明了复制缺陷型重组逆转录病毒包装成功。利用所构建的重组逆转录病毒分别感染PK-15细胞,IFA筛选出稳定表达猪瘟病毒特异shRNA抑制猪瘟病毒增殖的细胞克隆PK-15-N1、PK-15-N2、PK-15-S10和PK-15-S11。然后采用间接免疫荧光、荧光定量PCR和病毒感染滴度测定三种方法进行了细胞表达的shRNA抑制猪瘟病毒增殖的动态检测,三种方法得到的结果相互吻合,稳定表达猪瘟病毒特异shRNA的细胞接毒后12-60h,猪瘟病毒增殖保持较低的水平,接毒后48h病毒基因拷贝数抑制倍数达149.3倍、病毒感染滴度抑制倍数达143.54倍,72h以后抑制效率降低,直到接毒后120h病毒基因仍然保持4-16倍的抑制作用,结果表明稳定表达猪瘟病毒特异干扰基因的PK-15细胞对猪瘟病毒增殖有高效的抑制作用。最后进行了表达猪瘟病毒特异shRNA细胞遗传稳定性检测,表明干扰基因稳定整合到细胞的基因组中,并表达猪瘟病毒特异性shRNA,能抑制猪瘟病毒的增殖。

关键词：逆转录病毒载体猪瘟病毒干扰RNA 短发卡RNA 增殖抑制

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逆转录病毒载体介导的端粒酶抑制基因对肝癌增殖凋亡的作用

逆转录病毒载体介导的端粒酶抑制基因对肝癌增殖凋亡的作用

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作者：马进财山东大学

学位级别：硕士

目的：以逆转录病毒作为载体，将端粒酶抑制基因导入肝癌细胞，研究其对肝癌体内外生长的抑制作用，为肝癌的基因治疗提供新途径。方法：使用逆转录病毒质粒载体pLXSN构建的真核表达重组质粒pLXSN-hTR，携带反义端粒酶RNA基因，将... 详细信息

目的：以逆转录病毒作为载体，将端粒酶抑制基因导入肝癌细胞，研究其对肝癌体内外生长的抑制作用，为肝癌的基因治疗提供新途径。方法：使用逆转录病毒质粒载体pLXSN构建的真核表达重组质粒pLXSN-hTR，携带反义端粒酶RNA基因，将其用电穿孔的方法转染包装细胞PT67细胞，G418筛选抗性细胞，获取阳性细胞克隆株，即稳定表达病毒的产病毒细胞株，收集细胞上清液，浓缩得到重组逆转录病毒，用NIH3T3细胞测定病毒滴度。将浓缩后的病毒直接感染人肝癌细胞株Bel-7402，PCR检测目的基因的插入，端粒酶反义RNA组分整合入肝癌细胞基因组中，通过其在细胞内与hTR结合而抑制肝癌细胞端粒酶活性，从而抑制肝癌细胞的生长，并促进癌细胞的凋亡。本实验通过细胞生长曲线、MTT法与流式细胞检测细胞生长抑制率和凋亡情况。采用Bel-7402细胞株建立裸鼠人肝癌皮下移植瘤模型。待肿瘤长至约5mm时采用随机数字法将裸鼠分为A、B、C、D、E、F 6组，分别给每组裸鼠腹腔注射5-Fu、生理盐水、5-Fu、5-Fu、生理盐水、生理盐水，同时分别局部注射质粒BamHl、质粒BamHl、生理盐水、质粒EcoRl、质粒EcoRl、生理盐水。隔日注药一次，共三次。测量肿瘤体积，绘制各组肿瘤的生长曲线，计算抑瘤率。实验结束后处死动物，对移植瘤组织进行HE染色，光镜下观察瘤组织的形态学改变，TUNEL法检测瘤组织内肿瘤细胞的凋亡指数。结果：反义端粒酶RNA基因和5-Fu均能抑制Bel-7402的体外、体内生长，两者联合应用能明显增加疗效。从细胞生长曲线，细胞生长抑制率，MTT均可以看出A组抑制最明显。反义端粒酶RNA基因和5-Fu能不同程度引起Bel-7402细胞的体内、体外凋亡坏死。流式细胞显示A组(71-71±2.53)％，B组(61.32±2.24)％，

关键词：端粒酶电穿孔包装细胞逆转录病毒载体 PT67 Bel-7402 凋亡肝癌动物模型裸鼠

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逆转录病毒载体介导的HCV囊膜蛋白基因的表达及动物免疫试验

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中国病毒学 2004年第6期19卷 563-567页

作者：许信刚胡建和张彦明邓宏魁北京大学生命科学学院西北农林科技大学动物科技学院北京大学生命科学学院北京100871 北京大学生命科学学院

利用 DNA 重组技术将丙型肝炎病毒(HCV)H77 株 E1E2 囊膜蛋白基因插入逆转录病毒载体 pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体 pBABE-puro-E1E2,该重组逆转录病毒载体与 pVSVg 质粒经磷酸钙共转染法将其转入 293T 细胞中包装逆转录病毒... 详细信息

利用 DNA 重组技术将丙型肝炎病毒(HCV)H77 株 E1E2 囊膜蛋白基因插入逆转录病毒载体 pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体 pBABE-puro-E1E2,该重组逆转录病毒载体与 pVSVg 质粒经磷酸钙共转染法将其转入 293T 细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染 SP2/0 细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明 HCV e1e2 基因在 SP2/0 细胞膜上成功表达。将表达 E1E2 蛋白的 SP2/0 细胞腹腔免疫 BA LB/c 小鼠,经 FACS 分析免疫鼠血清,成功诱导小鼠产生了抗 HCV E1E2 蛋白的抗体,Western blot表明该抗体能与原核系统表达的 E2 蛋白结合。

关键词：丙型肝炎病毒囊膜蛋白逆转录病毒载体假病毒 FACS

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逆转录病毒载体介导的人溶菌酶基因在乳腺细胞的表达

逆转录病毒载体介导的人溶菌酶基因在乳腺细胞的表达

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作者：兰志刚西北农林科技大学

学位级别：硕士

目前大多数转染实验使用的是脂质体瞬时转染,外源基因随着细胞的传代可能丢失。近来,由于逆转录病毒载体显示出外源基因能高效、稳定地转入宿主基因组,被广泛应用于人和动物的基因治疗及转基因动物制作。本研究利用目前应用较多也更为... 详细信息

目前大多数转染实验使用的是脂质体瞬时转染,外源基因随着细胞的传代可能丢失。近来,由于逆转录病毒载体显示出外源基因能高效、稳定地转入宿主基因组,被广泛应用于人和动物的基因治疗及转基因动物制作。本研究利用目前应用较多也更为安全的LN系列载体—pLNCX2,将人溶菌酶(hLYZ)基因转入牛乳腺上皮细胞中,并在小鼠乳腺癌细胞中进行基因表达的检测的研究。一、人溶菌酶基因乳腺特异性表达载体的构建本研究所用的重组逆转录病毒载体是以莫罗尼小鼠白血病病毒和莫罗尼淑肉瘤病病毒为基础的pLNEX2载体为骨架,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因为报告基因,以pMD18-T为克隆载体进行构建的。首先,分别用BglII和XhoI双酶切含有报告基因egfp的重组质粒pMD-EGFP和逆转录病毒载体pLNCX2,将通过琼脂糖凝胶电泳回收的目的片段egfp和线性化的pLNCX2产物于4℃水浴过夜连接、转化、挑取单菌落、提取质粒,利用BglII和XhoI双酶切鉴定并将正确重组质粒命名为pLE;然后,分别用NotI和SalI双酶切含有BBC3基因重组质粒pMD-BBC3和重组质粒pLE,按照上述操作获得正确重组质粒并命名为pLEB;最后,再分别用XhoI和BamHI双酶切重组质粒pLEB和乳腺表达载体pEBH,连接、转化、提取质粒和双酶切鉴定。通过以上操作得到含有egfp、bbc5、hLYZ和bbc3基因的重组逆转录病毒质粒,并命名为pLEBH。二、牛乳腺上皮细胞的培养及转染取牛乳腺组织送实验室后,经自来水、生理盐水、含双抗的PBS多次清洗,剪碎,于培养皿中培养,纯化,传代,冻存以及细胞的解冻。将构建好的重组逆转录病毒载体pLEBH用脂质体2000转入病毒包装细胞PA317中,收集病毒液,测定病毒滴度,用高病毒滴度的病毒液来感染牛乳腺上皮细胞,G418筛选出阳性细胞。三、人溶菌酶基因在小鼠乳腺癌细胞的表达将高病毒滴度的病毒液感染小鼠乳腺癌细胞(EMT6),G418筛选出阳性细胞,通过PCR和RT-PCR进行人溶菌酶的基因组整合和转录水平的检测,确定hLYZ基因在细胞中表达的正确性。

关键词：溶菌酶基因乳腺上皮细胞基因表达逆转录病毒载体

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