检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：朱亚青上海第二医科大学上海交通大学

学位级别：博士

临床资料和方法:选用瑞金医院外科手术切除的并经病理组织学证实的50例原发性胃癌标本及其对应的正常胃切端粘膜组织,以酚-氯仿-异戊醇法抽提基因组DNA,对肿瘤成分不足70﹪时采用显微微切割方法.应用CGH检测其中23例原发性胃癌的DNA拷... 详细信息

临床资料和方法:选用瑞金医院外科手术切除的并经病理组织学证实的50例原发性胃癌标本及其对应的正常胃切端粘膜组织,以酚-氯仿-异戊醇法抽提基因组DNA,对肿瘤成分不足70﹪时采用显微微切割方法.应用CGH检测其中23例原发性胃癌的DNA拷贝数变化情况.用六个高度多态性的微卫星位点分析了50例胃癌组织在18q21上的杂合性丢失,同时以单链构象多态性方法(single-strand conformation polymorphism,SSCP)并经直接测序检测了18q21上SMAD2、DPC4和DCC三个抑癌基因的突变情况.此外,采用半定量PCR和实时荧光定量PCR方法检测了20q上ZNF217、BTAK和CAS三个癌基因DNA拷贝数变化情况.结论:原发性胃癌中有多处染色体区域发生DNA拷贝数畸变,这些区域中可能存在着与胃癌发生发展相关的癌基因和抑癌基因,是定位克隆胃癌相关基因的候选区域.18q21在胃癌中存在着高频的LOH,在D 18S450和D18S474之间存在着一个最小共同丢失区;SMAD2、DPC4和DCC可促进胃癌的进展和转移,是胃癌发展的后期事件.胃癌中SMAD2和DPC4的失活主要通过杂合性丢失,很少发生基因突变;而DCC基因既可通过杂合性丢失也可通过基因突变而失活.20q上的ZNF217、BTAK和CAS癌基因可能在部分胃癌中发挥作用.

关键词：胃肿瘤比较基因组杂交遗传不稳定性杂合性丢失 DNA拷贝数畸变基因突变

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

非达霉素高效生物合成及其生产菌遗传稳定性的分子机制

非达霉素高效生物合成及其生产菌遗传稳定性的分子机制

引用

作者：郦月萍浙江大学

学位级别：博士

非达霉素是（fidaxomicin）一种18元大环内酯类聚酮化合物,对革兰氏阳性致病菌具有明显的抑制作用。2011年6月,非达霉素被美国FDA批准上市用于治疗艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection,CDI）。目前,对于非达霉素的生物合成... 详细信息

非达霉素是（fidaxomicin）一种18元大环内酯类聚酮化合物,对革兰氏阳性致病菌具有明显的抑制作用。2011年6月,非达霉素被美国FDA批准上市用于治疗艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection,CDI）。目前,对于非达霉素的生物合成机制已有了较深入的研究,但对其生物合成中的调控机制还知之甚少;且非达霉素生产菌株Actinoplanes deccanensis YP-1在发酵过程中存在发酵水平低、产生副产物（橙红色素）以及遗传不稳定性等问题,极大地限制了非达霉素的生产和应用。本论文以*** YP-1为研究材料,揭示了途径特异性调控因子FadR1对非达霉素生物合成的转录调控机制,初步解析了与***菌株遗传不稳定性相关的机制;同时,利用组合工程策略对菌株进行改造,构建了非达霉素高效合成生物体系,所获得菌株具有较好的遗传稳定性,为非达霉素工业化生产奠定了基础;另外,本文提出的组合工程策略也可广泛应用于其它工业放线菌的改造,有望推动微生物制药工业的发展。首先,我们通过生物信息学分析发现,非达霉素生物合成基因簇中存在一个潜在的LAL家族途径特异性调控基因fad R1。对fad R1基因进行敲除、回补、高表达等基因操作后发现,fad R1基因敲除株（Δfad R1）几乎丧失了合成非达霉素的能力,回补fad R1基因可基本恢复其生产能力;而fad R1基因高表达株（OE-R1/WT）中非达霉素的产量是野生型菌株的4.5倍。EMSA实验表明,FadR1调控因子能与fad M、fad A1-fad P2、fad S2-fad C和fad E-fad F的基因间隔区域发生特异性结合;结合转录单位分析结果可知,这四个基因间区域的启动子控制了非达霉素生物合成途径中大部分关键基因的转录。此外,DNase I footprinting实验显示,FadR1蛋白与上述四个区域的具体结合位点中都含有5′-CCCTNxAGGG-3′或者5′-AGGG-3′的序列,表明这些结合位点之间具有高度的保守性。上述结果证实了FadR1对非达霉素的生物合成具有正调控作用;同时,我们总结了FadR1对非达霉素生物合成的调控模式,即FadR1蛋白通过结合在fad M、fad A1-fad P2、fad S2-fad C和fad E-fad F的基因间隔区域,进而直接或间接地正调控非达霉素合成基因簇中近30个基因的表达,最终调控非达霉素的产量,为后续非达霉素工业高产菌株的构建奠定了理论基础。本研究分析了*** YP-1基因组中与菌株遗传不稳定性相关的元件,并使用CRISPR/Cpf1介导的基因组编辑系统删除了8个遗传不稳定元件,包括6个最大的基因组岛（GIs）、一个内源性CRISPR/Cas系统以及一个非同源末端连接途径（NHEJ）,从而构建了一株遗传稳定性显著提升的突变株*** YP-D8。通过进一步的生物信息学分析和基因敲除实验,我们发现基因组中的一个噬菌体来源的核酸内切酶VII是引起菌株遗传不稳定性的关键因素。这不但加强了我们对放线菌内遗传不稳定性分子机制的理解,还可以指导我们如何通过合理地改造来提高工业放线菌的遗传稳定性,有助于我们应对工业化生产过程中菌株频繁退化的挑战。本研究还利用转座子随机突变技术确定了*** YP-D8中橙红色素的生物合成基因簇（opt）,敲除该基因簇可以阻断副产物橙红色素的合成,最终获得突变株*** YP-D11。与野生型菌株YP-1相比,YP-D11在各方面表现出更好的性能,例如外源质粒转化效率更高、胞内能量（ATP）和还原力（NADPH/NADP+）水平提高、外源蛋白表达能力增强以及遗传稳定性提高等,因此,YP-D11可作为进一步提高非达霉素产量的优良底盘。此外,我们还在*** YP-1中建立了CRISPR/Cas9胶内酶切偶联ExoCET克隆系统,并利用该系统成功克隆到完整的非达霉素生物合成基因簇（fad）。将该基因簇导入底盘菌株YP-D11后获得基因簇多拷贝菌株*** YP-M6,该菌株中非达霉素产量可达到72.5 mg/L,是野生型菌株YP-1的3.2倍。在这基础上过表达途径特异性正调控基因fad R1构建非达霉素高效合成生物体系,最终筛选得到的高产菌株*** YP-M7在YEME基础培养基和Y4工业培养基中非达霉素产量分别为331.1 mg/L和619.2 mg/L,较野生型菌株YP-1分别提高了13.5倍和26.0倍。同时,YP-M7菌株表现出较好的遗传稳定性,其非达霉素产量在连续传代10次后仍然保持相对稳定,因此该菌

关键词：非达霉素途径特异性转录调控因子非达霉素生物合成基因簇遗传不稳定性组合工程策略高效合成生物体系

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

胃癌LKF6、CDX2基因遗传不稳定与甲基化及蛋白表达的关系

胃癌LKF6、CDX2基因遗传不稳定与甲基化及蛋白表达的关系

引用

作者：于宁杭州师范大学

学位级别：硕士

研究目的: 　　研究KLF6基因KLF6M1、KLF6M2、KLF6M4、D10S1716位点和CDX2基因D13S220位点的微卫星不稳定性(microsatelliteinstablility，MSI)和杂合性缺失(lossofheterozygosity，LOH)、KLF6基因在胃癌组织和SGC-7901细胞系中启动子区域甲基化水平对其蛋白表达的影响，阐明KLF6基因遗传不稳定性、启动子区域甲基化与胃癌肿瘤进展的关系，为揭示抑癌基因作用机制和肿瘤发生发展机制，提供实验依据。 　　研究方法: 　　 (1)苯酚-氯仿抽提法，提取冰冻的胃癌组织和SGC-7901细胞系基因组DNA。 　　 (2)PCR-单链构象多态性(Single-StrandConformationPolymorphism，SSCP)、常规银染检测位点的遗传不稳定性。(3)WesternBlot检测蛋白表达。(4)甲基化特异性PCR检测启动子区域甲基化水平。(5)SPSS16.0软件统计分析相关性。 　　研究结果: 　　 (1)胃癌KLF6基因微卫星位点LOH的检出率为24.49％(12/49)，与胃癌分化程度、浆膜浸润和临床TNM分期无相关性，但与淋巴转移密切相关(P＜0.05)，LOH在胃癌淋巴结转移组检出率为30.77％(12/39)明显高于无淋巴结转移组的0.00％(0/10)。MSI检出率为16.32％(8/49)，MSI与胃癌的分化程度、浆膜浸润程度、淋巴转移和临床TNM分期均无相关性。在胃癌组织中，KLF6的表达缺失率分别为47.83％(22/46)，在癌旁组织中的表达缺失率仅为4.35％(2/46)。KLF6在91.30％(42/46)的胃癌组织中表达较对应正常组织下降，且下降50％以上。49例胃癌组织甲基化频率为81.63％，癌旁正常对照组织甲基化频率为75.51％，无统计学差异(P＞0.05)。SGC-7901细胞株中KLF6启动子处于异常高甲基化状态，经过5'-Aza-CdR处理96h后高甲基化的启动子呈去甲基化状态。经过5'-Aza-CdR处理24h后，KLF6蛋白表达增加，且表达强度呈时间依赖关系。 　　 (2)胃癌CDX2基因D13S220位点MSI发生率为8.00％，LOH发生率为18.00％，而LOH的检出率与胃癌分化程度负相关，与淋巴转移正相关，且随着肿瘤TNM分期的增加而降低，但与浆膜浸润、TNM分期无相关性。 　　结论: 　　 KLF6基因LOH的发生率与与淋巴转移正相关。KLF6基因LOH多发生于有淋巴结转移的胃癌，可作为胃癌组织恶变、预后转归的的判断指标之一。在胃癌组织中存在KLF6的明显缺失，5'-Aza-CdR能较好地逆转胃癌细胞SGC-7901的DNA高甲基化，诱导该基因的表达。在胃癌组织中KLF6基因启动子区域存在高甲基化，提示CpG岛高甲基化在胃癌的早期阶段已存在，可能是胃癌发生的因素之一。所以KLF6可能是胃癌发生的重要相关抑癌基因。 　　 CDX2基因D13S220位点LOH的发生率与分化程度负相关，与淋巴转移正相关。D13S220位点LOH多发生于中低分化程度和有淋巴结转移的胃癌，可作为胃癌组织恶变、预后转归的的判断指标之一。D13S220位点的LOH可以调控胃癌的发生、进展，LOH可能是CDX2基因失活的重要机制。

关键词：胃癌 KLF6基因 CDX2基因遗传不稳定性甲基化蛋白表达

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

微卫星不稳定性与脊柱裂发生的关联性研究

引用

现代生物医学进展 2011年第24期11卷 4861-4863,4848页

作者：王志刚李媛媛刘卓欧阳胜荣常会波吴建新北京协和医学院研究生院北京100730 首都儿科研究所生化研究室北京100020

目的:通过对脊柱裂(spina bifida)胚胎脑组织中微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)的分析,探讨遗传不稳定性是否为此疾病的特征之一,进而研究错配修复系统(mismatch repair,MMR)与脊柱裂发病的分子机制。方法:19例脊柱裂... 详细信息

目的:通过对脊柱裂(spina bifida)胚胎脑组织中微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)的分析,探讨遗传不稳定性是否为此疾病的特征之一,进而研究错配修复系统(mismatch repair,MMR)与脊柱裂发病的分子机制。方法:19例脊柱裂和19例非神经管畸形对照脑组织中提取DNA;尿素变性凝胶电泳法检测标本中MSI发生情况。结果:在19例脊柱裂脑组织中9例MSI阳性,阳性率47.4%。其中2例为高度微卫星不稳定(high frequency microsatellite instability,MSI-H),7例为低度微卫星不稳定(lowfrequency microsatellite instability,MSI-L),其余10例为微卫星稳定(microsatellite stable,MSS),对照组中未出现MSI。选择的5个微卫星位点MSI的阳性率分别为Bat34C4(10.5%)、Bat26(26.5%)、D2S123(10.5%)、D3S1611(5.3%),D2S119(5.3%)。结论:脊柱裂中存在MSI现象,提示MSI、错配修复系统可能与脊柱裂的发生有一定关系。

关键词：脊柱裂微卫星不稳定性遗传不稳定性

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

规范我国骨髓增生异常综合征的实验室检查和诊断

引用

中华血液学杂志 2008年第1期29卷 1-2页

作者：肖志坚郝玉书中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院实验血液学国家重点实验室

骨髓增生异常综合征（MDS）是一组以髓系（粒系、红系、巨核系）细胞发育异常而致骨髓衰竭为特征的髓系肿瘤，表现为粒系、红系、巨核细胞系一系或多系形态学异常和外周血细胞减少。由于遗传不稳定性而向急性髓系白血病（AML）转化的危... 详细信息

骨髓增生异常综合征（MDS）是一组以髓系（粒系、红系、巨核系）细胞发育异常而致骨髓衰竭为特征的髓系肿瘤，表现为粒系、红系、巨核细胞系一系或多系形态学异常和外周血细胞减少。由于遗传不稳定性而向急性髓系白血病（AML）转化的危险性很高。

关键词：骨髓增生异常综合征实验室检查外周血细胞减少急性髓系白血病诊断遗传不稳定性髓系肿瘤形态学异常

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

原发性胃癌分子细胞遗传学变化的研究

原发性胃癌分子细胞遗传学变化的研究

引用

第三届中国肿瘤学术大会

目的:探讨原发性胃癌分子细胞遗传学的变化。方法:用比较基因组杂交（comparative genomic hybridazion,CGH）检测原发性胃癌DNA拷贝数变化;用六个微卫星位点分析胃癌18q21杂合性丢失（loss of heterozygosity,LOH）,用单链构象多态性（... 详细信息

目的:探讨原发性胃癌分子细胞遗传学的变化。方法:用比较基因组杂交（comparative genomic hybridazion,CGH）检测原发性胃癌DNA拷贝数变化;用六个微卫星位点分析胃癌18q21杂合性丢失（loss of heterozygosity,LOH）,用单链构象多态性（PCR-SSCP）和直接测序检测18q上SMAD2、DPC4和DCC三个抑癌基因的突变;用半定量和实时荧光定量PCR检测20q上ZNF217、BTAK和CAS三个癌基因扩增情况。结果:CGH发现胃癌常见扩增区域（＞20%）有8q,20q,17q,3q,7q,11q,13q,1q和20p,高水平扩增区域有8q,1q21-25,3q26-29和16q11-13。常见丢失区域（＞20%）有17p,18q,5q,8p和9p。18q21上六个位点中至少一个位点出现LOH的频率为78%（39/50）。D18S450 LOH发生率最高,达48.9%,最小共同丢失区位于D18S450和D18474间。18q21 LOH多见于淋巴结转移和TNM Ⅲ期和Ⅳ期胃癌病人。胃癌中SMAD2和DPC4无突变,DCC突变率为24.49%（12/49）。胃窦部癌DCC突变率高于胃体和贲门部癌,TNMⅢ期和Ⅳ期胃癌突变率高于TNM Ⅰ期和Ⅱ期。ZNF217扩增率为11.36%,多见于直径≥5 cm和肠型胃癌。胃癌中BTAK和CAS基因相对拷贝数显著高于正常胃粘膜,扩增率分别为16.67%和29.73%。CAS扩增多见于淋巴结转移者。结论:原发性胃癌中有多处染色体区域发生DNA拷贝数畸变,这些区域中可能存在与胃癌发生发展相关的癌基因和抑癌基因,是定位克隆胃癌相关基因的候选区域。胃癌中18q21存在高频LOH,在D18S450和D18S474间有一最小共同丢失区;胃癌中SMAD2和DPC4很少发生突变;DCC可通过突变而失活。20q上ZNF217、BTAK和CAS癌基因可能在部分胃癌中发挥作用。

关键词：胃肿瘤比较基因组杂交遗传不稳定性杂合性丢失DNA拷贝数畸变基因突变基因扩增

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

α粒子诱发癌变细胞的纺锤体损伤凋亡机理研究

引用

中华放射医学与防护杂志 2005年第1期25卷 6-8页

作者：周平坤隋建丽吴德昌北京放射医学研究所 100850

目的　从纺锤体损伤诱导的凋亡反应 ,探讨α粒子诱发癌变细胞的遗传不稳定性机理。方法　用噻氨酯哒唑破坏纺锤体微管蛋白诱发细胞凋亡 ,Giemsa染色以及 3种荧光染料 (FDA、Hoechster 332 5 8和PI )复合染色检测凋亡 ;松胞素B阻止细胞分... 详细信息

目的　从纺锤体损伤诱导的凋亡反应 ,探讨α粒子诱发癌变细胞的遗传不稳定性机理。方法　用噻氨酯哒唑破坏纺锤体微管蛋白诱发细胞凋亡 ,Giemsa染色以及 3种荧光染料 (FDA、Hoechster 332 5 8和PI )复合染色检测凋亡 ;松胞素B阻止细胞分裂 ,分析凋亡与细胞周期时相的关系。结果　 0 3μg ml噻氨酯哒唑作用 6～ 4 8h ,癌变细胞BERP35T1和BERP35T4的凋亡发生率要显著低于正常BEP2D细胞 2～ 2 5倍 (P <0 0 1) ,而且正常细胞的凋亡主要是发生在细胞有丝分裂前 ,癌变细胞特别是BERP35T4细胞 ,有近 5 0 %的凋亡是发生在有丝分裂之后。结论　纺锤体损伤后凋亡机理异常 ,将导致非整倍体或多倍体的子代细胞增多 ,加剧α粒子照射细胞的遗传不稳定性。

关键词：凋亡癌变细胞诱发纺锤体损伤 α粒子遗传不稳定性细胞有丝分裂微管蛋白细胞分裂

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

运用反义策略对人的两个突变相关基因hMMS2和CROC-1功能的初步研究

引用

作者：陈建明浙江大学

学位级别：博士

细胞遗传不稳定性（genetic instability）是存在于人类遗传疾病及肿瘤中的一种重要现象，可能在其发生中起主导作用。环境致癌性理化因子可诱发细胞遗传不稳定性。我们的研究发现化学致癌物MNNG可在哺乳动物细胞中诱发以非定标性突... 详细信息

细胞遗传不稳定性（genetic instability）是存在于人类遗传疾病及肿瘤中的一种重要现象，可能在其发生中起主导作用。环境致癌性理化因子可诱发细胞遗传不稳定性。我们的研究发现化学致癌物MNNG可在哺乳动物细胞中诱发以非定标性突变（nontargeted mutation）为特征的遗传不稳定性，并且认为可能是通过DNA损伤及非DNA损伤途径激活信号转导系统而诱导细胞内众多基因的表达发生改变，致使细胞内DNA聚合酶酶谱发生变化启用了低保真度的DNA聚合酶，从而导致细胞遗传不稳定性的形成。近年来的研究发现生物体细胞内存在有DNA损伤耐受机制，并且发现其实质就是DNA跨损伤合成（translesion synthesis，TLS）。自1996年以来，已在原核及真核生物细胞中陆续发现了多种参与跨损伤DNA合成的DNA 聚合酶，这类跨损伤合成酶能以无误（error-free）和/或易误（error-prone）（致突变，mutagenic）方式跨越（bypass）模板链上的DNA损伤，且大多数成员其复制保真度低下，缺乏3’→5’校正（proofreading）功能。 MMS2基因编码产物是酿酒酵母（***）细胞内无误性跨损伤DNA 合成旁路中的一个调节因子。MMS2基因的编码产物是一泛素缀合酶样蛋白（ubiquitin-conjugating enzyme-like protein，Ubc-like protein），其氨基酸序列及二、三级结构类似于泛素缀合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，UBC，E2），但它由于缺乏关键性的一个半胱氨酸残基而不具备泛素缀合酶的泛素缀合活性。泛素缀合途径参与细胞的多种代谢过程，包括DNA损伤修复、细胞周期调控及应激反应等。泛素缀合酶样蛋白在体内可能以E2酶显性负变异体（dominant negative variant）的形式起作用，它可能是蛋白泛素化的新的调节因子。MMS2基因编码产物介导了酵母细胞内的二个分别以RAD5 和 RAD30为代表的无误性跨损伤 DNA合成旁路途径。研究发现酵母 mmsZ 基因无功效突变株对甲基甲磺酸及UV中度敏感，其自发突变率明显升高。 mmsZ基因突变株不影响REV3介导的易误性旁路途径，酵母mmsZ基因突变株表现为REV3依赖性增变表型。 hMMSZ、CROC－1是近年在人细胞中找到的两个与芽生酵母MMSZ基因同源的新基因，它们的编码产物也是泛素缀合酶样蛋白，与酵母MMSZ 基因编码产物分别具有约 50％和 75％的氨基酸序列相似性。已有的人体细胞研究资料提示，CROC－I基因可能通过调控细胞分化及改变细胞周期相的分布状态米参与人体细胞的癌变过程，它可能是人细胞的一个癌基因。 hMMSZ基因目前还无直接的人体细胞研究资料。但却发现hMMSZ和 CROC－1基因两者都能功能性补救酵母mmsZ基因缺陷株对烷化剂MMS及 UV的敏感性及自发性突变，并且还发现hMMSZ和酵母MMSZ基因两者都能在Rat－l细胞短暂共转染试验中转录檄活CghS－CAT报告基因。因此，推测hMMSZ、CROCI基因与酵母MMSZ基因之间功能保守。本研究是根据我们的遗传不稳定性形成机制理论结合酵母同源基因 MMSZ的功能而提出的，关键是为了研究hMMSZ、CROC．I基因与MtNNG 诱发的以非定标性突变为特征的人细胞遗传不稳定性形成之间的关系。为此，本研究运用反义策略分别构建了可诱导表达hMMSZ、CROCj基因反义RNA（antisense RNA）的真核细胞表达质粒，通过转染人羊膜FL细胞，分别建立可诱导反义阻断hMMy。CROC－1基因功能的人FL－hMMSZ－。 FL－CROC、广细胞系，以此作为实验模型，研究hMMSZ、CROC－1基因的一系列生物学功能。 hMMSZ、CROCI基因反义RNA表达质粒的构建用限制性内切酶分别从重组有hMMSZ、CROC－1基因全长C洲A序列的克隆质粒呷S十。 pBS－CIB上切出包含相应靶基因整个开放阅读框的CDNA片断，用修饰酶将切出的目的片断两端切平或补平，透析袋回收纯化目的片段。再用连接酶在已切平或补平的目的片断两端连上Sail连接于，经限制性内切酶Sal 酶切使目的片段两端生成Sail粘性末端，最后将目的片段分别克隆到改建的真核细胞地塞米松诱导表达载体pMAMneo－amp”的Sail位点上。通过限制性内切酶酶切图谱（Restriction map）分析，筛选出反向插入的重组质粒。构建好的 hMMSZ重组质粒经 Nhe、BstX双酶切后得到 553hp及 8．7 kb 2 条带，此即为反

关键词：基因 hMMS2 CROC-1 人羊膜FL细胞反义RNA 泛素缀合酶样蛋白跨损伤合成 DNA聚合酶基因克隆限制性内切酶逆转录-聚片酶链式反应定量逆转录-聚合酶链式反应序列分析穿梭质粒非定标性突变遗传不稳定性细胞分裂基因表达 DNA修复

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

石蜡包埋组织个体识别研究

石蜡包埋组织个体识别研究

引用

作者：吕晋南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景与目的从福尔马林固定、石蜡包埋组织内提取DNA一直以来都是一项困扰着众多研究人员的难题。甲醛作为常用固定液福尔马林的一个重要成分,可以引起核酸大分子之间以及核酸与蛋白质之间的广泛交联,这一反应将会导致从组织内提取DN... 详细信息

研究背景与目的从福尔马林固定、石蜡包埋组织内提取DNA一直以来都是一项困扰着众多研究人员的难题。甲醛作为常用固定液福尔马林的一个重要成分,可以引起核酸大分子之间以及核酸与蛋白质之间的广泛交联,这一反应将会导致从组织内提取DNA十分困难。不仅如此,如果固定所用的固定液不是缓冲型中性福尔马林溶液,还将出现甲醛被氧化生成甲酸后,固定液的PH值大幅降低,有时甚至会出现PH小于1的情况。这种酸性的环境将会导致DNA链的断裂。这些作用都导致无法利用PCR扩增技术得到满意的DNA片段长度和含量,从而严重影响了分子生物学研究。尽管从福尔马林固定石蜡包埋组织提取DNA十分困难,但却不能忽视这些组织可能为基因遗传学等研究提供的信息。在世界各地的医院及病理研究所都储存着大量的固定组织,它们常是唯一的致病相关基因研究重要的研究对象。正是因为如此,越来越多的学者开始研究如何从固定组织提取高质量DNA,并有一系列的相关论文逐渐发表。不容乐观的是,虽然相关性文章在不断增多,但是这些文章所提及的方法,能够达提取到高质量DNA的并不多。首先,因为研究目的不同,对目的基因要求不同,很难用同一的标准来判定提取DNA的质量；其次,虽然有些方法可以保证提取出的DNA含量,但是因为这些组织内的DNA多由于固定的原因而降解成较小的DNA片段,尽管含量可观,无法保证片段长度,这种方法仍是难以推广的。其实,影响固定组织内DNA质量的因素有很多,大体可以分为：1.固定前因素,这就包括了组织的类型和大小,固定前它的腐败程度等等；2.固定因素,包括了选取何种固定液,固定液的PH值,温度以及固定时间的长短等；3.固定后因素,例如固定后储存时间的长短和储存温度的高低等。面对如此多的影响因素,想要找到一种理想的提取方法还需进一步研究,并结合考虑样材的情况。福尔马林固定石蜡包埋组织被要求做个体识别和亲子鉴定的需求有增多趋势。而且这些组织大部分都是肿瘤组织,恶性肿瘤十分常见,恶性肿瘤组织中普遍存在着基因编码区或非编码区的变异,这种变异同样可以发生在法医学检测常用的15个STR基因座中。因此,研究常见肿瘤组织STR变异性十分必要。短串联重复序列(STR)广泛存在于真核生物的基因组中,具有高度的多态性。因为其核心序列较小通常为2-6bp,重复次数通常为15-30次,所以其片段长度较小,PCR扩增结果稳定,加上STR基因座的高度多态性在基因传递过程中遵循孟德尔遗传规律,它的这些特点使得PCR-STR复合扩增检测技术成为法医学不可缺少的一项重要的技术手段。虽然,PCR-STR符合扩增技术在组织身源认定的案件中应用广泛,但是这样的检测技术是有其假设前提的,既同一个体的任何组织的STR基因型都是完全一致的。当遇到的检材是肿瘤组织的时候,这样的假设前提便不再存在。已有研究发现,在肿瘤组织的基因组中,不论是编码区还是非编码区都有可能发生变异,这种现象在STR基因座内同样可以观察到。在肿瘤组织内的这种变异表现为杂合性丢失(loss of heterozygosity,LOH)和微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI),这些改变都可能会对PCR-STR复合扩增检测造成影响,导致肿瘤组织与正常组织STR分型结果不一致。方法 1.脱蜡方法 1.1水浴加热脱蜡将组织样本放入1.5mlEP管中,向管内加入1000ulTES(10mmol/LTris,1mmol/LEDTA,0.5%SDS, pH8.5)溶液,在接近石蜡熔点的温度(65℃)下水浴30min,然后以13000rpm离心1min,弃去液体；重复上述操作1次-2次,而后于室温下晾干备用。 1.2微波加热脱蜡向装有组织切片的1.5mlEP管中加入200u1消化缓冲液(50mmol/LTris,1mmol/LEDTA,0.5%Tween-20, pH8.5),密封后,置于微波炉中加热1min(时间视石蜡多少而定,但不宜过长),而后以13000rpm离心3min,弃去液体；如此重复4次,而后于室温下晾干备用。 1.3二甲苯脱蜡向装有组织切片的EP管中加入1000u1二甲苯溶液,密封后放入摇床慢速摇荡1h,而后取下以13000rpm离心3min,弃去液体,重复操作一次；弃去液体,向装有组织切片的EP管中加入1000ul无水乙醇,密封后放入摇床,慢速摇荡3min,而后13000rpm离心3min,弃去液体,重复操作一次,弃去液体后,打开EP管于室温下晾干备用。 2DNA提取方法 2.1Chelex-100法结合QIAquick(?)PCR Purification Kit纯化试剂盒法向脱蜡完成后的组织加入适量配置的Chelex-100溶液及蛋白酶K,56℃孵育6h、

关键词：法医物证学福尔马林固定石蜡包埋组织 DNA定量乳腺癌组织结肠癌组织遗传不稳定性 STR分型

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

遗传学

引用

中国学术期刊文摘 2008年第3期14卷 139页

黄萎病菌胁迫条件下棉花叶片的蛋白质组分析;中国人肺鳞癌nm23H1基因遗传不稳定性的研究;台湾客家汉族手肤纹学研究;烟碱脱氢酶基因的原核表达及酶学特性研究.

关键词：遗传学脱氢酶基因遗传不稳定性蛋白质组分棉花叶片胁迫条件黄萎病菌酶学特性

来源：评论

学校读者我要写书评

暂无评论

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：