检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：李丹丹湖南农业大学

学位级别：硕士

本研究以籼稻湘晚籼17号、R299成熟胚作为试验材料,建立、优化遗传转化体系。主要结果如下：1.结果表明：湘晚籼17号、R299在恒温光照(12h)愈伤组织诱导率高,质量佳。同时,不同的水稻品种对恒温光照(12h)诱导条件表现不一样。经过3d预... 详细信息

本研究以籼稻湘晚籼17号、R299成熟胚作为试验材料,建立、优化遗传转化体系。主要结果如下： 1.结果表明：湘晚籼17号、R299在恒温光照(12h)愈伤组织诱导率高,质量佳。同时,不同的水稻品种对恒温光照(12h)诱导条件表现不一样。经过3d预培养瞬间表达率达到79.4%、83.5%,是最适合的预培养时间。 2.湘晚籼17号、R299采用抽真空的侵染方式,瞬间表达率达到75.3%、83.2%,明显高于浸泡法,是最适宜的侵染方式。 3.将湘晚籼17号、R299愈伤组织用农杆菌浓度OD600=0.5,15min抽真空为最佳侵染方式和时间。 4.在诱导愈伤组织过程中,湘晚籼17号在2,4—D浓度为,2.5mg/L时,R299在2,4—D浓度为2.0mg/L,在选择再生阶段,将2,4—D浓度增加到2.5mg/L时,明显改变愈伤组织停止生长不前或无再生愈伤组织的状况. 5.蔗糖浓度增大至35g/L时,湘晚籼17号、R299愈伤组织愈伤组织质量佳,分化率高,是最佳浓度。 6.湘晚籼17号、R299在羧苄青霉素浓度400mg/L时,抑菌效果最佳。 7.将湘晚籼17号、R299愈伤组织随着卡那霉素浓度增加,愈伤组织再生率下降,且白化苗数量也增加,卡那霉素对愈伤组织毒害作用强,因此卡那霉素并不适合做湘晚籼17号、R299选择剂。 8.经过上述遗传转化体系进行优化,最终湘晚籼17号、R299的遗传转化体系为：将成熟胚放置在2,4—D2.5mg/L MS诱导培养基放在恒温光照(12h)条件下诱导7d,切愈伤后,进过3d的预培养后,用OD600=0.5的农杆菌菌液抽真空15min侵染愈伤组织,经过3d共培养,转移到含卡那霉素浓度50mg/L、羧苄青霉素400mg/L,2,4—D2.5mg/L,蔗糖35g/L的MS选择培养基上,选择三次后,进行生根、成苗、移栽。通过重新建立、优化遗传转化体系,获得21棵湘晚籼17号转化苗,24棵R299转化苗。

关键词：籼稻遗传转化体系优化农杆菌转化

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梅花PmhCBFs基因功能分析及子叶遗传转化体系的优化

梅花PmhCBFs基因功能分析及子叶遗传转化体系的优化

引用

作者：郑亚霞华中农业大学

学位级别：硕士

梅花（Prunusmume）是中国十大传统花卉之一，起源于中国，已有7000多年的应用史和3000多年的栽培历史，是一种花果兼具观赏和经济价值的重要园艺植物。在我国传统文化中梅花一直有耐寒的著称，但能在三北地区栽培的耐寒梅花品种却很少... 详细信息

梅花（Prunusmume）是中国十大传统花卉之一，起源于中国，已有7000多年的应用史和3000多年的栽培历史，是一种花果兼具观赏和经济价值的重要园艺植物。在我国传统文化中梅花一直有耐寒的著称，但能在三北地区栽培的耐寒梅花品种却很少，且梅花花期相对较短，传统杂交育种周期长，在一定程度上限制了梅花的抗寒品种选育及在北方的推广应用。梅花属于再生诱导困难的顽拗性木本花卉，遗传转化效率低，有关转基因梅花植株的报道很少。　　本研究以‘雪梅’×‘粉皮宫粉’的杂交后代为材料，在课题组前期研究基础上，构建pK7WG2D-PmhCBFs超量表达载体，采用农杆菌介导法瞬时转化梅花实生苗叶片，检测低温胁迫前后叶片的生理指标和基因表达量变化，以分析基因功能。从延迟培养时间、农杆菌侵染方式、抗性芽伸长继代过程等方面，提高子叶不定芽再生率和抗性芽诱导率，增加抗性芽的伸长量，进一步提高梅花遗传转化效率;利用此遗传转化体系，将PmhCBFs基因转入梅花未成熟/成熟胚子叶，获得PCR鉴定为阳性的生根苗和嫁接苗。以梅花无菌实生苗的茎段为材料，从苗龄、植物生长调节剂、基本培养基等方面优化梅花茎段快繁体系。主要研究结果如下：　　***基因功能分析　　通过烟草叶片注射实验，观察亚细胞定位融合载体的GFP蛋白表达部位，发现PmhCBFs蛋白定位于细胞核。采用农杆菌介导法瞬时转化梅花实生苗叶片，4℃低温处理12h后，瞬转叶片的相对电导率及MDA水平低，POD、SOD酶活性仍维持在较高水平。低温处理后，对照组中CBFa表达量上升，CBFb表达量下降，CBFc无明显变化，而瞬转叶片中PmhCBFa与PmhCBFb表达量远高于PmhCBFc。PmhCBFs单个基因和多个基因共转，导致低温胁迫应答基因的表达水平存在差异，其中单个PmhCBFs基因瞬时超量表达，上调下游靶基因PmADF5、PmCOR47和PmKIN1的表达量幅度最高。　　2.梅花子叶遗传转化体系的优化　　通过筛选最佳侵染方式、延迟培养时间等优化梅花未成熟/成熟胚子叶遗传转化体系，结果表明：真空渗透和超声波辅助侵染均可提高梅花子叶抗性芽诱导率。基因型为6-8、10-5的成熟胚种子活力较强，适宜作为遗传转化的外植体材料。真空度为0.02MPa、真空渗入10min时梅花子叶抗性芽诱导率最高，为65.00%。真空渗透0-20min时间梯度处理下，转化超表PmhCBFb基因的子叶在每个时间段的抗性芽诱导率均高于超表PmhCBFa基因，且达到最高幅度时所需的渗透时间较少。超声波功率80W、超声时间为30s时梅花成熟胚子叶抗性芽诱导率最高，为63.33%。延迟培养7d和9d的再生芽数目较多，外植体状态良好，抗性芽诱导率较高，分别为45.00%、53.33%。在抗性芽的伸长阶段，可通过采用不同浓度的生长素与细胞分裂素交替使用，或在培养基中附加40mg/L间苯三酚的方法促进抗性芽快速伸长生长，减少顶芽褐化枯死及叶片黄化的现象。　　3.梅花成熟胚子叶遗传转化PmhCBFs　　将携带和无PmhCBFs基因超表载体的农杆菌分别转化梅花成熟胚子叶，经过45d的选择培养，从4764个侵染外植体中获得了196个抗性芽，共提取了126个抗性芽叶片，52个检测结果呈阳性，其中转化空载的阳性抗性芽有5个，超表PmhCBFa的抗性芽有4个，超表PmhCBFb的抗性芽21个，超表PmhCBFc的抗性芽22个。选31株进行嫩枝嫁接，成活抗性苗22株;生根移植的转化植株共16株。梅花嫁接及生根转化苗叶片荧光定量结果表明：转化嫁接苗中PmhCBFs的表达量远高于转化生根苗，通过嫁接方式保存转化苗是一种非常可靠有效的方式。　　4.梅花茎段快繁体系优化　　以梅花无菌实生苗的茎段为材料，通过筛选最佳外植体苗龄、调整不同培养阶段的激素组合等优化梅花茎段快繁体系，结果表明：基因型6-8的无菌实生苗茎段的最佳启动培养基为1/2MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LKT+0.1mg/LNAA;在QL基本培养基上增殖效果及生长状况最好，最佳增殖培养基为QL+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LKT+0.05mg/LNAA，增殖系数为2.10，腋芽伸长率为46.67%;在1/2MS+3.0mg/LIBA培养基中生根率最高，为66.67%;茎粗壮、株高2cm以上、根系发达、根长3cm以上的高质量茎段生根苗驯化移栽后的成活率较高，为95.00%;快繁生根苗驯化移栽后的生长势与基因型有关，基因型6-8比5-5生长迅速，2周内可长至30cm。

关键词：梅花 PmhCBFs 低温胁迫遗传转化体系优化茎段快繁体系优化

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优化子叶节转化法培育大豆MtDREB2A转基因植株

引用

植物学报 2018年第1期53卷 59-71页

作者：吴国栋修宇王华芳北京林业大学生物科学与技术学院林木育种国家工程实验室林木花卉遗传育种教育部重点实验室北京100083

将正交因素试验与GUS基因组织化学染色等技术相结合,优化大豆(Glycine max)品种东农50遗传转化体系,导入抗旱关键基因Mt DREB2A。结果表明,大豆种子表面消毒,NaClO溶液法与Cl_2气熏蒸法的去污染率分别达到98.67%和93.33%。子叶节法转GU... 详细信息

将正交因素试验与GUS基因组织化学染色等技术相结合,优化大豆(Glycine max)品种东农50遗传转化体系,导入抗旱关键基因Mt DREB2A。结果表明,大豆种子表面消毒,NaClO溶液法与Cl_2气熏蒸法的去污染率分别达到98.67%和93.33%。子叶节法转GUS基因组织化学染色率(68.33%)显著高于下胚轴法(14.00%)和胚尖法(0.67%)(P<0.05)。种子萌发5天,农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)培养温度25°C,OD600=0.9,共培养5天的转GUS基因子叶节最高达72.00%;恢复培养5天,草丁膦(3 mg·L^(–1))、头孢噻肟钠(200 mg·L^(–1))和羧苄青霉素(300 mg·L^(–1))筛选诱导分化的转GUS基因不定芽最多为3.33%;优化的大豆遗传转化体系转化效率为1.11%。转Mt DREB2A基因大豆东农50植株根系更加密集,主根长度和侧根数量均显著高于对照(P<0.05),证实Mt DREB2A基因具有促进大豆根系生长的作用,为利用该基因进行大豆抗旱育种奠定了坚实的基础并提供了理论依据。

关键词：大豆遗传转化体系优化 GUS基因 MtDREB2A基因根系改良

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