检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2023年第11期39卷 4358-4375页

作者：赵黎丽苏炳恺杜姝姝丁文婷刘熔增河南科技大学基础医学院免疫学教研室河南洛阳471023

酵母表面展示(yeastsurfacedisplay,YSD)技术是一种将外源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞,利用酵母细胞内蛋白转运机制将靶蛋白表达并定位于酵母细胞表面的技术,最常用的是α-凝集素表达系统。酵母细胞具有真核... 详细信息

酵母表面展示(yeastsurfacedisplay,YSD)技术是一种将外源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞,利用酵母细胞内蛋白转运机制将靶蛋白表达并定位于酵母细胞表面的技术,最常用的是α-凝集素表达系统。酵母细胞具有真核细胞翻译后修饰机制,能够帮助目的蛋白正确折叠,可以用来展示各种真核蛋白,包括抗体、受体、酶和抗原肽等。酵母表面展示技术已成为生物技术和生物医学领域的强大蛋白质工程工具,结合流式细胞分选可用于改善蛋白质性质,包括亲和力、特异性、酶功能和稳定性等。本文从文库构建与筛选、抗体工程、蛋白质工程、酶工程和疫苗开发等方面对酵母表面展示技术应用最新进展进行了综述。

关键词：酵母表面展示技术文库构建抗体工程蛋白质工程酶工程口服疫苗

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酵母表面展示技术应用的研究进展

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生物学通报 2009年第2期44卷 4-6页

作者：翟一凡邓宁暨南大学生命科学技术学院广东广州510632

酵母菌的蛋白表达方式与高等真核生物细胞十分相似,酵母表面展示技术是研究真核生物,尤其是人类蛋白质表达的理想方法之一。酵母菌表面标记可溶性配基,通过流式细胞技术对酵母菌展示文库进行快速、精确的筛选,其已广泛用于研究天然蛋白... 详细信息

酵母菌的蛋白表达方式与高等真核生物细胞十分相似,酵母表面展示技术是研究真核生物,尤其是人类蛋白质表达的理想方法之一。酵母菌表面标记可溶性配基,通过流式细胞技术对酵母菌展示文库进行快速、精确的筛选,其已广泛用于研究天然蛋白质-蛋白质的相互作用、抗体Fab片段的亲和力,成熟、抗体的检测与筛选,以及功能蛋白质抗原表位图谱绘制等。

关键词：酵母表面展示技术亲和力成熟表位图谱

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基于酵母表面展示技术筛选鉴定靶向HBC的多肽

基于酵母表面展示技术筛选鉴定靶向HBC的多肽

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作者：王金兰重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:乙型肝炎病毒感染仍然是一个重要的公共卫生问题,乙肝核心蛋白(HBC)作为核衣壳的组成成分,其功能的多样性,使其成为开发新型抗病毒疗法的靶标。治疗性药物中,自1920年代胰岛素疗法问世以来,肽疗法在医疗实践中发挥了重要作用。为... 详细信息

目的:乙型肝炎病毒感染仍然是一个重要的公共卫生问题,乙肝核心蛋白(HBC)作为核衣壳的组成成分,其功能的多样性,使其成为开发新型抗病毒疗法的靶标。治疗性药物中,自1920年代胰岛素疗法问世以来,肽疗法在医疗实践中发挥了重要作用。为筛选靶向HBC的多肽,我们基于酵母表面展示技术,构建酵母展示多肽文库,以重组蛋白HBC为靶标,筛选与其特异性结合的多肽,并对其进行鉴定评价。方法:构建含7个随机氨基酸的11肽,转化酿酒酵母,获得酵母转化子多肽文库。以重组蛋白HBC作为靶标,与多肽文库结合并筛选,经两轮磁珠筛选,五轮流式筛选,最后富集得到与HBC特异性结合力高的酵母,对酵母多肽展示区进行二代测序。在亲和力最高的多肽序列基础上进行延长,进一步构建包含7个随机氨基酸的24肽库,利用同样方法进行筛选,富集,测序,以及合成多肽。利用流式细胞技术,分段荧光互补实验,磁珠反向验证,等温滴定量热法(ITC)验证HBC蛋白与多肽的相互作用。结果:纯化重组蛋白HBC并用考马斯亮蓝染色鉴定,得到大小为21k D的蛋白条带。成功构建容量大小为2.5×10～8的11肽库,从中筛选出3条亲和力较高的多肽。流式细胞术,分段荧光互补实验,证实该3条多肽与HBC有相互作用,Kd分别为367.8 n M,413.0 n M,622.1 n M。以这三条多肽序列为基础,继续构建24肽库,并从中筛选出亲和力高的3条多肽。酵母表面滴定显示,这3条多肽与HBC有更高的亲和力,Kd分别为232.3 n M,69.59 n M,178.2 n M,等温滴定量热法显示三条多肽与HBC的Kd值分别为16.3μM,25.8μM,17.1μM。结论:本研究基于酵母表面展示技术,构建了4个含有7个随机氨基酸的多肽文库,用于筛选HBC结合多肽,其中构建的含有7个随机氨基酸的11肽库,文库大小为2.5×10～8,亦可用于筛选与其他蛋白的结合多肽。先后从多肽库中筛选出3条多肽,经流式分析,等温滴定量热等实验,验证这3条多肽与HBC存在较高亲和力。所筛选到的多肽序列可以作为进一步开发靶向HBC新型抗乙肝病毒活性药物或者HBC检测试剂的基础。

关键词：乙型肝炎病毒核心蛋白酵母表面展示技术多肽文库荧光激活细胞分选

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利用酵母表面展示技术对肠炎沙门氏菌FliC蛋白在鸡体内抗原特性的研究

利用酵母表面展示技术对肠炎沙门氏菌FliC蛋白在鸡体内抗原特性的...

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作者：王高玲中国农业科学院

学位级别：硕士

肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis,SE)是一类泛嗜性沙门氏菌,其不仅是危害养禽业发展最为严重的病原之一,而且经常以污染的家禽产品为载体危害人类健康。由fliC基因编码的鞭毛蛋白是沙门氏菌重要的保护性抗原之一,可引起机体强烈的... 详细信息

肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis,SE)是一类泛嗜性沙门氏菌,其不仅是危害养禽业发展最为严重的病原之一,而且经常以污染的家禽产品为载体危害人类健康。由fliC基因编码的鞭毛蛋白是沙门氏菌重要的保护性抗原之一,可引起机体强烈的免疫应答反应。研究Fli C蛋白的优势抗原区对沙门氏菌新型疫苗的研发,进而减少人类食源性肠炎沙门氏菌的感染具有重要意义。本研究利用DNaseⅠ将SE的fliC基因随机酶切成100-500 bp的DNA小片段,将这些片段插入到酵母表面展示载体pCTCON-2中,并将其转入大肠杆菌中构建酵母随机展示文库pCTCON-fliC-Lib,其库容量大小约为2.7×105。通过基因测序确定文库p CTCON-fliC-Lib的随机性和插入片段的大小,结果显示随机挑取的50个克隆中的所有片段插入方向都是随机的,这些片段的大小在100-500 bp范围内,其分布能够覆盖整个fliC基因。将酵母展示文库pCTCON-fliC-Lib电击转入酿酒酵母EBY-100菌株中诱导表达。用SM6阳性血清染诱导表达的FliC文库p CTCON-fliC-Lib,通过流式细胞仪分选阳性酵母,经两轮分选后,提取阳性酵母的质粒进行基因测序分析。结果显示SM6的FliC蛋白的抗原区位于D1区(1-201位氨基酸)、D2区(202-352位氨基酸)和D4区(394-505位氨基酸),非抗原区位于D3区(353-393位氨基酸)。将Fli C蛋白的4个区域进行酵母表面展示表达并通过流式分析4个区域的抗原特性;同时4个区域进行原核表达并通过ELISA分析其抗原特性。流式分析和ELISA分析结果显示Fli C蛋白的4个区域中,D1区和D2区为主抗原区,D4区为次抗原区,D3区为非抗原区。通过鸡群免疫FliC蛋白的各个抗原区分析各抗原区在鸡体内的功能,结果表明FliC蛋白的D1区、D2区、D4区均能降低SM6在鸡体内的定植。本研究利用酵母表面展示技术将构建的肠炎沙门氏菌SM6菌株的Fli C蛋白抗原文库展示于酵母表面,筛选并鉴定了Fli C蛋白的主抗原区,为抗肠炎沙门氏菌新型疫苗的研发提供理论基础。

关键词：肠炎沙门氏菌 FliC蛋白酵母表面展示技术抗原区

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α-葡萄糖苷酶高效合成低聚异麦芽糖的策略分析

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食品与发酵工业 2021年第21期47卷 275-281页

作者：李林波王宝石张明霞杨天佑李志刚河南科技学院生命科技学院现代生物育种河南省协同创新中心河南新乡453003

α-葡萄糖苷酶作为工业化生产低聚异麦芽糖(isomaltooligosaccharides,IMOs)的关键酶制剂,因其发挥的提高催化效率和降低生产成本的重要作用,而受到学者的广泛关注。文章综述了α-葡萄糖苷酶的来源、性质、分类和催化机制,分析了α-葡... 详细信息

α-葡萄糖苷酶作为工业化生产低聚异麦芽糖(isomaltooligosaccharides,IMOs)的关键酶制剂,因其发挥的提高催化效率和降低生产成本的重要作用,而受到学者的广泛关注。文章综述了α-葡萄糖苷酶的来源、性质、分类和催化机制,分析了α-葡萄糖苷酶高效合成IMOs的策略,并对工业化高效生产IMOs进行了展望,旨在为高效清洁生产IMOs提供参考。

关键词： α-葡萄糖苷酶低聚异麦芽糖异源表达高效合成酵母表面展示技术

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解脂耶氏酵母细胞表面展示乳糖水解酶高效水解乳糖

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中国生物工程杂志 2018年第8期38卷 41-49页

作者：王艺颖程海荣上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室

乳糖是婴幼儿获取能量的重要碳源之一,但乳糖需要在乳糖酶的作用下水解成半乳糖与葡萄糖后才能被吸收。缺少乳糖分解酶的婴幼儿在摄入含乳糖的食品后,未被消化的乳糖会直接进入大肠,刺激大肠蠕动加快,造成一系列不适应症状即乳糖不耐症... 详细信息

乳糖是婴幼儿获取能量的重要碳源之一,但乳糖需要在乳糖酶的作用下水解成半乳糖与葡萄糖后才能被吸收。缺少乳糖分解酶的婴幼儿在摄入含乳糖的食品后,未被消化的乳糖会直接进入大肠,刺激大肠蠕动加快,造成一系列不适应症状即乳糖不耐症,我国属于乳糖不耐症高发国家。因此,解决乳糖的体外水解问题对减轻该症状有重要的意义。研究通过将β-半乳糖苷酶（也称为乳糖水解酶）表面展示在食品安全微生物解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）细胞表面,通过培养获得该酵母,然后直接利用酵母细胞来水解乳糖生成半乳糖与葡萄糖。采用该工程酵母细胞（HCY10）,能在24小时内完全水解50g/L的乳糖,生成半乳糖与葡萄糖。该方法具有高效、简便的优点,能为乳糖的高效水解提供一条新的途径。

关键词：乳糖 β-半乳糖苷酶乳糖水解酶解脂耶氏酵母酵母表面展示技术

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我国类NADC34 PRRSV流行病学调查及其抗原表位的筛选

我国类NADC34 PRRSV流行病学调查及其抗原表位的筛选

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作者：许浒东北农业大学

学位级别：博士

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的以仔猪呼吸障碍和母猪繁殖障碍为主要临床症状的重要传染病。PRRSV于1996年在我国首次报道,对我国养猪业造成巨大经济损失。2012年美国报道了1-7-4毒株（NADC34-like PRRSV）大流行事件,被描述为一场母猪群中的“流产风暴”。2020年美国又报道了RFLP 1-4-4 Lineage1C PRRSV变异株疫情。我国于2017年首次发现NADC34-like PRRSV,并在2019年被认为是中国潜在的流行毒株。了解NADC34-like PRRSV毒株在我国的最新流行情况,鉴定其致病性具有重要意义。抗原表位一直是PRRSV研究的热点,鉴定国内最新流行毒株的抗原表位可以为抗体试剂盒和DIVA疫苗研制提供基础。本研究对2020～2021年间,来自全国14个省、市、自治区的828份疑似感染PRRSV的临床病料进行RT-PCR检测。检测结果显示,PRRSV阳性样品数量为433份,阳性率约为52.29%,其中NADC34-like PRRSV样品数量为82份,近年来该类毒株迅速传播,2021年,NADC34-like PRRSV在阳性总数的占比已经达到28.6%,已经成为中国部分地区的主要流行毒株之一。基于ORF5基因遗传演化分析发现,所有新发NADC34-like PRRSV均属于sublineage 1.5。为了更好的了解我国新发NADC34-like PRRSV与全球sublineage 1.5毒株的关系,本研究收集全球所有sublineage 1.5毒株ORF5基因序列作为参考构建进化树,结果表明流行于我国的NADC34-like PRRSV未形成独立分支,而是嵌入到美国sublineage 1.5分支中。因此,现阶段流行于中国的NADC34-like PRRSV不仅来自于较早毒株的传播,同时存在持续输入和独立进化的情况。本研究选择15份NADC34-like PRRSV阳性样品进一步完成了全基因组测序。基于全基因组序列遗传演化分析发现,新发NADC34-like PRRSV属于sublineage 1.5或sublineage 1.8,这预示着新发重组毒株的出现。重组分析结果显示15个获得全基因组序列的毒株中有6个发生了重组,重组模式复杂多样,没有发现明显的重组热点,BLAST分析发现NADC34-like PRRSV已经与中国本地流行的HP-PRRSV-like PRRSV和NADC30-like PRRSV发生了重组,并且新发重组毒株出现的时间与NADC34-like PRRSV阳性比例迅速上升的时间相吻合,因此新发重组毒株的出现可能是NADC34-like PRRSV快速流行的原因。推导氨基酸序列比对发现多数新发NADC34-like PRRSV在Nsp2区域具有与IA/2014/NADC34一致的100 aa连续缺失,部分毒株与NADC30株的缺失模式一致,这与重组分析结果相符,同时新发NADC34-like PRRSV在GP5线性抗原区域内存在大量氨基酸突变。未重组的NADC34-like PRRSV毒株同源性比对发现该类毒株的基因组同源性下降,NADC34-like PRRSV正在快速变异。在2020年10月以及次年4月,RFLP 1-4-4 lineage 1C PRRSV变异株引起了两次大范围的PRRS疫情,对美国当地养猪业造成严重危害。为了解该类毒株与中国当前流行PRRSV的关系,本研究通过序列分析发现,美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与我国NADC34-like PRRSV属于同一亚型分支（sublineage 1.5）,它们在Nsp2区域均具有相同的100个氨基酸连续缺失的分子特征。美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株是以NADC34-like毒株IA14737-2016为母本毒株,IA/2014/NADC34和NADC30病毒株提供重组片段的重组病毒。同时发现中国NADC34-like毒株HLJZD22-1812与美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株具有类似的重组模式、相同的Nsp2缺失特征、相同的1-4-4 ORF5 RFLP模式。但二者的同源性不足90%,这与美国从业者描述的谱系内高同源性不符,它们并不是由同一毒株演化而来。因此我国目前还未发现1-4-4 lineage1C PRRSV变异株,但时刻警惕RFLP 1-4-4 Lineage 1C PRRS

关键词：分子流行病学 NADC34-like PRRSV 毒株致病性酵母表面展示技术抗原表位

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以Vif-CBFβ相互作用为靶点的抗HIV-1抑制剂的筛选

以Vif-CBFβ相互作用为靶点的抗HIV-1抑制剂的筛选

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作者：段斯竹吉林大学

学位级别：博士

艾滋病（Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS）即获得性免疫缺陷综合征,是由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）特异性感染和杀伤人体主要淋巴细胞所导致的传染性疾病,自上世纪80年代被报导来在全球迅速蔓延... 详细信息

艾滋病（Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS）即获得性免疫缺陷综合征,是由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）特异性感染和杀伤人体主要淋巴细胞所导致的传染性疾病,自上世纪80年代被报导来在全球迅速蔓延。个体感染HIV后由于免疫系统被破坏,易发生机会性感染和恶性肿瘤,病死率较高,尚无彻底治愈的方法。高效抗逆转录病毒疗法（Highly Ac-tive Antiretroviral Therapy,HAART）是目前艾滋病临床治疗中使用的主要方法,但缺点是患者需终身服药且会产生副作用及耐药性。所以目前亟需寻找新的靶点,开发新的药物。除此之外,功能性治愈也作为一种新的治疗方法迅速发展,作为主要方法之一的基因治疗可以通过基因改造造血干细胞使病人体内持续表达抗病毒基因,有望达到一次治疗终身有效的效果。在艾滋病的药物开发中,除去传统的针对HIV复制过程中必须的逆转录酶、整合酶和蛋白水解酶等靶点,HIV-1的辅助蛋白与宿主限制因子相互作用成为了新的药物开发靶点。其主要优势在于针对宿主限制因子设计药物能够避免HIV-1基因组上的逃逸突变,降低其耐药性。在宿主限制因子中,APOBEC3家族是一类胞嘧啶脱氨酶,其中APOBEC3G（A3G）和APOBEC3F（A3F）具有显著的抑制作用,它们通过将HIV-1基因组上的G突变成A使其产生提前终止或产生功能缺失的突变,并且能够影响病毒反转录及基因组的整合。HIV-1辅助蛋白Vif通过形成Vif-CBFβ-Elo B-Elo C-Cullin5 E3泛素连接酶复合物对APOBEC3家族蛋白进行泛素化,从而诱导其降解,其中CBFβ是一种必要的分子伴侣。CBFβ具有提高Vif的生成,稳定Vif蛋白,促进APOBEC3降解的作用。目前已经有一些以E3复合物为靶点的HIV-1抑制剂,且多以Vif-A3G及Vif-EC相互作用界面为靶点,其中Vif-A3G相互作用界面为靶点的抑制剂仅能够保护A3G蛋白。选择Vif-CBFβ相互作用为靶点筛选抗HIV-1抑制剂的优点是可以释放所有APOBEC3家族蛋白及E3泛素连接酶复合物内的与正常细胞代谢功能相关的蛋白（Elo B,Elo C,和Cullin5等）。因此我们针对Vif-CBFβ靶点设计了可应用于HAART治疗和基因治疗两种方法的药物筛选。第一种是通过基于结构的虚拟筛选（structure-based virtual screening,SBVS）,以Vif-CBFβ为靶点与小分子化合物的数据库进行分子对接,筛选出能够阻断其相互作用的小分子化合物,然后对候选化合物进行抗HIV-1作用及机理的验证。2014年Vif-CBFβ-Cul5-EB-EC复合物的晶体结构被解析,且有多篇文献报导Vif的N端是与CBFβ相互作用的重要位点,其中Vif的W5和CBFβ的I55和F68能够形成三个氨基酸相互作用的疏水口袋。因此,我们在虚拟筛选过程中选择了Vif N端5到11位氨基酸与CBFβ相互作用的区域为对接靶点进行筛选。利用Discovery Studio 2.5软件与从ZINC网站中的Alfa-Aesar数据库中获得的小分子化合物3D结构数据库进行分子对接,选取打分较高的小分子,手动筛选出与CBFβ形成氢键的7个候选化合物进行后续功能评价。首先通过抑制HIV-1感染力和回复A3G蛋白表达水平的能力及细胞毒性的评价得到了候选化合物CV-3,它可以特异性地在非允许淋巴细胞内抑制HIV-1的复制(IC50约为8.16μM),证明其抗病毒作用是APOBEC3依赖的。我们在293T细胞内加入CV-3后,能够在Vif表达的情况下维持h A3G,h A3C,和h A3F的蛋白水平,促进A3G被包装进HIV-1颗粒内降低病毒感染力,并且能够在HIV-1基因组上造成G到A的突变。我们通过酵母表面展示技术（Yeast surface display,YSD）、荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）和免疫共沉淀实验（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）证明了CV-3可以有效地阻断Vif与CBFβ之间的相互作用。进一步的Co-IP实验证明CV-3阻断Vif与CBFβ相互作用还影响了E3泛素连接酶复合物中Cullin5与Vif的相互作用。为了探究CV-3的作用机制,我们分析了CV-3与CBFβ结合的方式,发现了四个可能与CV-3有相互作用的CBFβ氨基酸位点。利用FRET实验,我们证明了CV-3可能通过氢键与CBFβ的Q67,I102,和R131结合破坏了CBFβ与Vif的相互作用。以上结果表明,我们通过虚拟筛选获得的化合物CV

关键词：艾滋病 HIV-1抑制剂 Vif APOBEC3 CBFβ 虚拟筛选酵母表面展示技术

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HRV 3C蛋白酶底物特异性的定量解析及其催化机理的研究

HRV 3C蛋白酶底物特异性的定量解析及其催化机理的研究

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作者：范贤湖北大学

学位级别：硕士

人鼻病毒3C蛋白酶(HRV 3C-P)是一种人鼻病毒编码的半胱氨酸蛋白酶。针对人鼻病毒3C蛋白酶的抑制剂是预防小RNA病毒感染的重要手段之一。同时,由于人鼻病毒3C蛋白酶具有高活性和高特异性等特点,可用于蛋白表达纯化过程中去除融合标签。因... 详细信息

人鼻病毒3C蛋白酶(HRV 3C-P)是一种人鼻病毒编码的半胱氨酸蛋白酶。针对人鼻病毒3C蛋白酶的抑制剂是预防小RNA病毒感染的重要手段之一。同时,由于人鼻病毒3C蛋白酶具有高活性和高特异性等特点,可用于蛋白表达纯化过程中去除融合标签。因此,具有很高的工业、医用价值。病毒多肽链序列分析表明人鼻病毒3C蛋白酶可以特异性识别多肽序列LEVLFQ↓GP,并在Gln和Gly之间进行切割,然而对人鼻病毒3C蛋白酶的底物特异性缺乏深入的研究。针对这一问题,我们开发了一种基于酵母内质网滞留筛选系统(YESS)的能快速解析蛋白酶底物切割位点特异性的新方法(YESS-PSSC),来对人鼻病毒3C蛋白酶底物切割位点P1(Q)、P1’(G)、P2’(P)的特异性进行全面解析。YESS-PSSC方法省去了传统体外反应的蛋白质表达、纯化和体外反应条件探索,并且在酵母内质网滞留信号肽的帮助下能更加简捷、灵敏和精确对蛋白酶底物特异性进行解析。我们利用YESS-PSSC和传统的体外蛋白酶-底物测试方法分别对特异性不强的P2’位点的氨基酸特异性进行了解析。结果表明两种方法针对20种不同氨基酸底物的切割效率虽然有一定差异,但整体的趋势基本相符,证明了YESS-PSSC方法能有效替代传统的体外蛋白酶-底物测试方法。针对人鼻病毒3C蛋白酶底物切割位点P1(Q)、P1’(G)、P2’(P)的特异性的全面解析表明:人鼻病毒3C蛋白酶在P1位点不仅可以高效的识别原始的Gln,同样可以高效识别Glu,底物切割效率都达到96%以上;在P1’位点,人鼻病毒3C蛋白酶可以识别具有小侧链的氨基酸Gly、Ala、Cys和Ser,切割效率分别为98%、71%、76%和35%;而在P2’位点未显示出较强的氨基酸特异性。随后,我们结构模拟了人鼻病毒3C蛋白酶与各种底物突变体序列的对接结果,并结合生化分析发现蛋白酶在P1位点的识别特征主要由人鼻病毒3C蛋白酶的His160和Thr141与底物P1位点氨基酸间的相互作用决定。针对His160和Thr141两个位点的饱和突变分析表明:蛋白酶His160位点与底物P1位点氨基酸形成的氢键,是锚定底物P1位点氨基酸在S1活性口袋位置的主要作用力;而Thr141位点与底物P1位点氨基酸形成的两个氢键,稳定了底物P1位点氨基酸侧链的朝向,并维持了蛋白酶S1活性口袋的结构,对底物和酶的契合有重要作用。相比而言,人鼻病毒3C蛋白酶S1’活性口袋很小、刚性强,从而导致P1’位点只能容纳小侧链的氨基酸,并且对Gly具有最高识别效率。在我们对P2’位点的分析中发现,相对原始底物的Pro氨基酸,人鼻病毒3C蛋白酶能更有效对Met氨基酸进行切割,特别是在30℃条件下。当分别在4℃、16℃、22℃、30℃体外反应1小时后,人鼻病毒3C蛋白酶对原始底物LEVLFQ↓GP的切割效率随温度升高,从83.2%降低至47.1%,而对底物序列LEVLFQ↓GM的切割效率降低很少,仅从85.9%降低至81.5%。利用圆二色谱仪对人鼻病毒3C蛋白酶在6℃和30℃的结构进行进一步分析发现,温度的升高会导致人鼻病毒3C蛋白酶中的random coil转化为β-turn。这一结构柔和性的降低可能是导致人鼻病毒3C蛋白酶对原始底物LEVLFQ↓GP切割效率降低的原因。此外,我们也将人鼻病毒3C蛋白酶同其他典型病毒3C蛋白酶进行了底物活性口袋结构和底物特异性对比,包括口蹄疫病毒3C蛋白酶、烟草花叶病毒蛋白酶。我们初步推断,S1活性口袋的中性和酸性氨基酸决定了P1位点对Gln和Glu的高特异性,而狭小的S1’活性口袋空间是人鼻病毒3C蛋白酶区别于其他典型3C蛋白酶的主要特征。综上所述,我们的研究开发了一种简单、易行的在细胞内解析蛋白酶底物特异性的方法,并利用此方法解析了人鼻病毒3C蛋白酶的底物特异性和进一步探究了其催化机理。我们的研究为人鼻病毒3C蛋白酶的进一步研究、应用和分子改造提供了基础。

关键词：人鼻病毒3C蛋白酶底物特异性酵母表面展示技术内质网结构模拟

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伪狂犬病毒不同毒株间gC蛋白的抗原差异性研究

伪狂犬病毒不同毒株间gC蛋白的抗原差异性研究

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作者：刘春晓中国农业科学院

学位级别：硕士

伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一种对养猪业危害极大的传染病。2011年下半年,PRV变异株在我国免疫猪群中开始流行。本实验室率先分离到变异株,命名为He N1株。研究表明接种现有疫苗株不能使易感动物... 详细信息

伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一种对养猪业危害极大的传染病。2011年下半年,PRV变异株在我国免疫猪群中开始流行。本实验室率先分离到变异株,命名为He N1株。研究表明接种现有疫苗株不能使易感动物获得对变异株的完全保护,血清中和试验显示疫苗株Bartha-K61与HeN1株之间存在明显的抗原差异。gC蛋白是PRV重要的中和性抗原,其变异可能会导致疫苗株免疫猪体后产生的中和抗体不能对PRV变异株进行有效的中和。因此我们利用酵母表面展示技术获取疫苗株Bartha-K61与变异株HeN1 gC蛋白的抗原区,来探究毒株间的抗原性差异。为了解PRV变异株的流行及变异情况,2016～2017年间,对来自安徽、河北、山东等省份的大中型猪场送检的疑似PRV病料进行PCR检测,鉴定出16份PRV阳性病料,对其gC、gE基因进行序列分析,两者氨基酸序列与2012年以来的变异株的相应氨基酸序列同源性分别为98.2%100%与99.3～100%,与经典株的相应氨基酸序列同源性相对较低,分别为92.5%94.8%与95.3%99.1%。变异株的gE蛋白均在第48位和第492位各插入1个天冬氨酸,在gC蛋白的64～70位处连续插入7个氨基酸,分离株具有与变异株相同的分子标记,并且分离的16株PRV与GenBank下载的近年来国内报道的PRV变异毒株在系统进化树上处于同一分支,与经典株位于不同分支,表明HeN1株仍是目前PRV流行毒株的代表毒株。本研究利用DNase I将疫苗株Bartha-K61与变异株He N1的gC基因随机酶切成100～250 bp的小片段,然后连接到酵母展示载体pCTCON2中,将连接产物电转入大肠杆菌DH5α中构建随机的酵母展示文库。提取两个文库的质粒并电转入制备的酿酒酵母EBY-100感受态中进行培养诱导。用抗Bartha-K61与抗HeN1株的猪阳性血清分别对两个诱导表达后的酵母文库进行染色,通过流式细胞仪对阳性酵母进行经两轮分选富集,提取富集后阳性酵母的质粒进行测序分析,通过分析克隆的分布及个数来绘制抗原区图谱。结果显示,HeN1-gC蛋白的主要抗原区位于A1区（23-152位aa）、次要抗原区位于A3区（337-487位aa）、非抗原区位于A2区（153-336位aa）;Bartha-K61-gC蛋白的主要抗原区位于B1区（23-130位aa）、次要抗原区位于B2区（131-222位aa）、非抗原区位于B3区（223-480位aa）。将两毒株gC蛋白的各抗原区片段进行酵母展示表达与原核表达,进行流式分析与ELISA分析,结果验证了两毒株gC蛋白的各抗原区的抗原特性,抗原区与血清交叉分析表明两毒株gC蛋白的主抗原区的抗原性差异不大,次要抗原区的抗原性存在差异,非抗原区与血清交叉分析存在一定的抗原性,本研究推测PRV两毒株gC蛋白之间的抗原差异性可能与氨基酸的同源性关系较小,而与病毒自身的调控有关。综上所述,本研究利用酵母展示技术将构建的疫苗株Bartha-K61与变异株HeN1的gC蛋白抗原文库展示于酵母表面,筛选并鉴定了两毒株gC蛋白的主抗原区与次抗原区,以上研究为揭示PRV毒株间的变异及免疫逃避的机制提供基础。

关键词：伪狂犬病毒 gC蛋白酵母表面展示技术抗原差异性

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