检索结果-内蒙古大学图书馆

生物技术 2015年第5期25卷 451-457,462页

作者：王晓云雷志强王邵华王鹏良江西中医药大学江西南昌330004 江西民族传统药现代科技与产业发展协同创新中心江西南昌330004 江西省中药种质资源工程技术研究中心江西南昌330004 广西钦州学院海洋学院广西钦州535000

[目的]糖基转移酶UGT94E5和UGT75L6催化栀子果实中西红花总苷生物合成途径的末端步骤。该研究利用重叠延伸pcr法,合成编码这两个酶的基因序列。[方法]首先将基因分段,每段两端均加上p UC57载体的多克隆位点作为接头,拼接成800 bp以下的... 详细信息

[目的]糖基转移酶UGT94E5和UGT75L6催化栀子果实中西红花总苷生物合成途径的末端步骤。该研究利用重叠延伸pcr法,合成编码这两个酶的基因序列。[方法]首先将基因分段,每段两端均加上p UC57载体的多克隆位点作为接头,拼接成800 bp以下的片段,再输入到DNAWorks软件中,获得最优寡核苷酸片段组合;将合成的寡核苷酸片段混合,用作模板,进行两次pcr扩增,获得加了接头的各段序列,亚克隆到自制的p UC57 T载体上。酶切后回收插入片段,混合,用作模板,扩增全长基因,产物克隆到自制的p UC57 T载体上。[结果]成功合成了栀子Gj UGT9(编码UGT94E5)和Gj UGT1(编码UGT75L6)基因,分别长1 496 bp和1 583 bp。[结论]重叠延伸pcr法能够有效地合成栀子两个糖基转移酶基因序列,为遗传操作奠定了基础。

关键词：基因合成栀子糖基转移酶重叠延伸pcr法

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人脂联素基因的重叠延伸pcr法克隆及其在毕赤酵母中的诱导表达

人脂联素基因的重叠延伸PCR法克隆及其在毕赤酵母中的诱导表达

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作者：张变玲西北大学

学位级别：硕士

本研究利用重叠延伸pcr法克隆出人脂联素（ADPN）基因cDNA序列,构建了其克隆载体pGEM-T-ADPN。通过测序对其进行序列分析后,进一步构建其毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-ADPN,然后利用电击法转化毕赤酵母GS115,经甲醇诱导重组酵母表达,并对... 详细信息

本研究利用重叠延伸pcr法克隆出人脂联素（ADPN）基因cDNA序列,构建了其克隆载体pGEM-T-ADPN。通过测序对其进行序列分析后,进一步构建其毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-ADPN,然后利用电击法转化毕赤酵母GS115,经甲醇诱导重组酵母表达,并对表达产物进行分析和研究,取得了如下进展: 利用重叠延伸pcr法从人血液中扩增出人脂联素基因第二外显子和第三外显子编码序列,并准确拼接,构建了克隆载体pGEM-T-ADPN。通过pcr和酶切初步鉴定正确后,对其进行测序,测序结果和NCBI中登陆号为NM004797.2的人脂联素cDNA序列比对,结果完全一致,同源性为100%。表明人脂联素基因已经成功克隆并连接至克隆载体pGEM-T中。设计分别带有BamH I和EcoR I两个酶切位点的人脂联素基因引物,以pGEM-T-ADPN为模板,扩增出5′端和3′端分别带有BamH I和EcoR I两酶切位点的ADPN基因,然后用这两种酶切后连接至毕赤酵母表达载体pPIC3.5K中。重组表达载体pPIC3.5K-ADPN转化大肠杆菌DH5α并利用其上携带的氨苄青霉素抗性基因筛选出抗性菌株,然后做pcr及双酶切鉴定。经鉴定人脂联素基因已经准确地连接到毕赤酵母表达载体pPIC3.5K中。用电转化法将重组酵母表达载体pPIC3.5K-ADPN导入甲醇型酵母（***）菌株GS115中,获得转化子。将转化子采用营养缺陷、遗传霉素、pcr、Soutern杂交筛选后,得到多株重组酵母菌株。在以甲醇为唯一碳源的培养基上培养,对重组酵母菌株进行了诱导表达。经SDS-PAGE和Western杂交检测人脂联素蛋白表达情况,结果表明:经1%甲醇诱导后,在28 kDa处有目的蛋白条带出现,且甲醇诱导48 h后目的蛋白表达量最高。说明***成功表达了人脂联素蛋白且表达的蛋白具有抗原性。

关键词：毕赤酵母人脂联素重叠延伸pcr法 Southern杂交 Western杂交

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RNAi抑制牛朊病毒基因表达的相关试验研究

RNAi抑制牛朊病毒基因表达的相关试验研究

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作者：宋少康青岛农业大学

学位级别：硕士

牛海绵状脑病俗称疯牛病，其主要症状是患牛精神状态失常、共济失调、感觉过敏和中枢神经系统灰质空泡化等。疯牛病给世界的畜牧业以及人们的生活带来极大危害，经济损失惨重。疯牛病的病原是朊病毒(PrPsc),它是由机体正常的朊蛋白(PrPc... 详细信息

牛海绵状脑病俗称疯牛病，其主要症状是患牛精神状态失常、共济失调、感觉过敏和中枢神经系统灰质空泡化等。疯牛病给世界的畜牧业以及人们的生活带来极大危害，经济损失惨重。疯牛病的病原是朊病毒(PrPsc),它是由机体正常的朊蛋白(PrPc)转化而来，而PrPc是由朊蛋白基因（PRNP）编码而来，有试验证明PrPc的存在是朊病毒感染的基础。一方面由于机体正常的朊蛋白是固定在细胞膜上的，提取纯化较为困难，为了进一步在细胞水平上研究牛朊蛋白的生理生化作用和朊蛋白疾病的发病机制，本实验在体外构建了表达PRNP基因的真核表达载体;另一方面由于RNAi能够在细胞中高效特异的降解与其序列同源的mRNA，诱导特定靶基因的沉默，从而达到实现基因敲除或敲低的目的，因此，我们可以利用RNAi来敲低牛PrPc的量，从而使牛因缺乏转化的底物而可能具有抵抗朊病毒病的能力。\n 采用重叠延伸pcr法(SOE-pcr)全基因合成牛PRNP基因的cDNA，并克隆到真核表达载体pDsRED2-N1中，得到牛PRNP基因真核表达载体，转染牛骨髓间充质干细胞(BMSC)，并用800μg/mLG418对转染的细胞进行药物筛选。结果显示通过SOE-pcr成功扩增了牛PRNP基因的cDNA，并构建成真核表达载体，得到稳定表达目的蛋白的BMSC细胞。\n 利用RNAi技术，根据牛源PRNP基因cDNA设计3段siRNA序列和1个阴性对照序列，分别将其连接到RNA干扰载体pRNAT-U6.1/Neo上构建成shRNA载体，并将shRNA载体转染牛骨髓间充质干细胞(BMSC);通过Real-timepcr和Westernblotting筛选抑制效果最佳的载体，并用800μg/mLG418对转染最佳载体的细胞进行药物筛选。结果显示成功构建了3个靶向shRNA载体和1个阴性对照shRNA载体;3个靶向shRNA载体在不同时间段均在一定程度上下调了PRNPmRNA的表达，抑制了朊蛋白PrPc的生成，得到了一个最佳干扰载体sh3;通过药物筛选出了稳定转染sh3载体的细胞单克隆。\n 本研究获得了牛PRNP基因真核表达载体和有效抑制朊蛋白基因表达的sh3载体，筛选出稳定表达PRNP基因和sh3载体的细胞单克隆，上述结果可为抗疯牛病的进一步研究奠定基础。

关键词：疯牛病 RNAi技术牛朊病毒基因重叠延伸pcr法

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高羊茅叶绿体表达载体构建及绿色荧光蛋白基因瞬时表达检测

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中国农业科学 2009年第3期42卷 1116-1122页

作者：赵彤于荣黄丛林王永勤张秀海吴忠义北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心首都师范大学生命科学学院

【目的】验证高羊茅叶绿体表达载体在高羊茅叶绿体中的瞬时表达情况,为今后在高羊茅叶绿体中稳定表达该载体,获得耐旱高羊茅的叶绿体转基因株系奠定基础。【方法】首先从高羊茅草叶绿体基因组中克隆16S/trnI-trnA/23S片段,作为定点整合... 详细信息

【目的】验证高羊茅叶绿体表达载体在高羊茅叶绿体中的瞬时表达情况,为今后在高羊茅叶绿体中稳定表达该载体,获得耐旱高羊茅的叶绿体转基因株系奠定基础。【方法】首先从高羊茅草叶绿体基因组中克隆16S/trnI-trnA/23S片段,作为定点整合同源片段。然后将耐旱相关基因酵母海藻糖合酶基因tps1与水稻叶绿体16SrRNA基因的强启动子Prrn、烟草叶绿体基因psbA的终止子构建表达盒(Prrn-tps1-TpsbA-ter),连同草丁膦抗性基因bar表达盒、卡那霉素抗性基因nptII和绿色荧光蛋白基因gfp构建的融和基因表达盒一起克隆到定点整合同源片段之间,构建高羊茅叶绿体的稳定表达载体gTKGB。通过基因枪轰击法将gTKGB转化到高羊茅幼嫩叶片中,用激光共聚焦扫描显微镜对GFP的表达情况进行检测分析。【结果】克隆的高羊茅叶绿体基因16S-trnI-trnA-23S在NCBI登录号为:DQ490947-DQ490950。构建的叶绿体表达载体gTKGB转化高羊茅幼嫩叶片,在叶绿体中有很好的GFP表达。【结论】高羊茅叶绿体表达载体gTKGB可用于高羊茅叶绿体转化。

关键词：高羊茅叶绿体表达载体定点整合重叠延伸pcr法瞬时表达 GFP荧光

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抗人红细胞单链抗体与猪伪狂犬gE蛋白双功能融合蛋白的构建及生物学活性检测

抗人红细胞单链抗体与猪伪狂犬gE蛋白双功能融合蛋白的构建及生物...

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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十三次学术研讨会

作者：廖丈军覃绍敏吴健敏王仰杰白安斌覃建飞广西大学动物科学技术学院南宁广西 530005 广西兽医研究所南宁广西530001 广西兽医研究所南宁广西530001 广西兽医研究所南宁广西530001 广西大学动物科学技术学院南宁广西 530005

为构建既具有凝集性又具有抗原性的双功能融合蛋白,本研究利用特异性引物从重组质粒PMD-2E8SCFv和PMD-gE中pcr扩增得2E8基因(抗人红细胞H抗原单链抗体基因)和kgE基因(PRVgE主要抗原编码区),采用重叠延伸(SOE)pcr法拼接成融合的双功能分... 详细信息

为构建既具有凝集性又具有抗原性的双功能融合蛋白,本研究利用特异性引物从重组质粒PMD-2E8SCFv和PMD-gE中pcr扩增得2E8基因(抗人红细胞H抗原单链抗体基因)和kgE基因(PRVgE主要抗原编码区),采用重叠延伸(SOE)pcr法拼接成融合的双功能分子2E8kgE,经BamHI和EcoRI双酶切处理,纯化后,克隆至BamHI和EcoRI双酶切处理的表达载体pET-Trx中,构建了原核表达载体pET-Trx-2E8kgE：将pET-Trx-2E8kgE转化至BL2lplyss中,在IPTG的诱导下表达具有双功能的融合蛋白,经过SDS-PAGE和Western-blot检测;结果表明,重组菌BL2lplyss表达出约60.1kDa的目的蛋白,与猪伪狂犬标准阳性血清发生特异性反应。红细胞凝集试验证实：2E8kgE融合蛋白既能够与人红细胞结合,又能够与PRV抗体反应,具有双功能特性。

关键词：猪伪狂犬病毒 gE基因原核表达重叠延伸pcr法 2E8kgE融合蛋白双功能特性

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用优化的OE-pcr法构建CⅡTA中间缺失突变体

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第二军医大学学报 2006年第9期27卷 1014-1017页

作者：管政沈茜第二军医大学长海医院实验诊断科上海200433

目的：以构建缺失第109～226位氨基酸密码子的MHCII类分子反式激活因子（MHCclass Ⅱ molecule transactivator，CIITA）突变体为例探索一种简便、稳定的构建中间缺失突变体的方法。方法：首先按照传统重叠延伸pcr方法的原理扩增缺失片... 详细信息

目的：以构建缺失第109～226位氨基酸密码子的MHCII类分子反式激活因子（MHCclass Ⅱ molecule transactivator，CIITA）突变体为例探索一种简便、稳定的构建中间缺失突变体的方法。方法：首先按照传统重叠延伸pcr方法的原理扩增缺失片段两端的基因片段，再将两片段混合，在不加入外围引物的情况下进行8次pcr循环以有效完成重叠延伸，然后再加入引物进行目的片段指数扩增，将扩增产物直接克隆至真核表达载体pIRES。结果：成功地构建出缺失第109～226位氨基酸密码子的CⅡTA突变体。结论：优化后的重叠延伸pcr法（OE—pcr）克服了传统方法的诸多弊端，非常适合于构建中间缺失突变体，值得推广。

关键词：重叠延伸pcr法中间缺失突变体 MHCⅡ类分子反式激活因子

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D92P点突变对扩展青霉碱性脂肪酶最适作用温度的改善

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生物技术通讯 2005年第1期16卷 31-33页

作者：陈木妹林琳福建师范大学生物工程学院福建福州350007

利用重叠延伸pcr法对扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)基因进行体外定点突变,并构建了含突变基因的重组质粒pPIC3.5K-lip-D92P。将该质粒在毕赤酵母GS115菌株中表达。与野生型表达产物PEL-GS相比较,突变体表达产物PEL-D92P-GS最适作用温度为45℃... 详细信息

利用重叠延伸pcr法对扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)基因进行体外定点突变,并构建了含突变基因的重组质粒pPIC3.5K-lip-D92P。将该质粒在毕赤酵母GS115菌株中表达。与野生型表达产物PEL-GS相比较,突变体表达产物PEL-D92P-GS最适作用温度为45℃,比野生型提高了5℃;其热稳定性与野生型相当;突变体在40℃下的表达量为109U/mL,约为野生型的29%。结果分析表明,Pro替代Asp92后,可能是由于Pro一级结构的特点,使酶结构更加稳定,在高温下更适于与底物结合。

关键词：扩展青霉碱性脂肪酶最适作用温度定点突变重叠延伸pcr法蛋白质工程

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