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补肾调经方对体外受精–胚胎移植技术中重复控制性卵巢刺激模型小鼠囊胚质量及凋亡的影响

北京中医药大学学报 2022年第8期45卷 815-823页

作者：于志芳左茜茜刘孟瑞张玉倩张丽王淑慧杜惠兰河北中医学院中西医结合学院石家庄050200 河北省中西医结合生殖疾病协同创新中心河北省中西医结合肝肾病证研究重点实验室

目的观察补肾调经方对重复控制性卵巢刺激(COS)模型小鼠囊胚质量及凋亡的影响。方法将160只雌性ICR小鼠按照随机数字表法分为正常组、模型组、补肾低剂量组(25.6 g/kg)和补肾高剂量组(51.2 g/kg)。除正常组外,其余3组建立重复COS模型(CO... 详细信息

目的观察补肾调经方对重复控制性卵巢刺激(COS)模型小鼠囊胚质量及凋亡的影响。方法将160只雌性ICR小鼠按照随机数字表法分为正常组、模型组、补肾低剂量组(25.6 g/kg)和补肾高剂量组(51.2 g/kg)。除正常组外,其余3组建立重复COS模型(COS 3次)。每日9时正常组及模型组雌鼠灌胃蒸馏水,补肾低、高剂量组雌鼠灌胃低、高剂量补肾调经方,连续10 d,各组均于第11天16时进行腹腔注射,除正常组注射生理盐水0.1 mL外,其余3组腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)10 IU/只,并于48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)10 IU/只。灌胃及腹腔注射连续3个周期,每次间隔4 d。各组小鼠第3次腹腔注射后立即与同品系雄鼠合笼,次日清晨检查阴栓,见栓或阴道涂片见精子的雌鼠记为妊娠。妊娠小鼠于末次腹腔注射96 h后处死,获取囊胚,倒置显微镜下观察囊胚质量并计数,计算优质囊胚率;Tunel法检测囊胚细胞凋亡率;实时荧光定量PCR检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)mRNA表达;Simple Western检测凋亡相关因子Bcl-2、Bax及活化的半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)的蛋白表达;免疫荧光法检测细胞色素C表达情况。结果与正常组比较,模型组获取囊胚数增多,优质囊胚率下降(P<0.05);囊胚内细胞总数减少,凋亡率升高(P<0.05);Bcl-2、Bcl-2/Bax mRNA及蛋白比值降低,Bax mRNA及蛋白表达升高,cleaved caspase-3蛋白表达升高(P<0.05);细胞色素C从线粒体释放,共定位系数M1、M2降低(P<0.05),差异有统计学意义。与模型组比较,补肾低、高剂量组获取囊胚数差异无统计学意义(P>0.05),优质囊胚率升高(P<0.05);囊胚内细胞总数增多,凋亡率降低(P<0.05);Bcl-2、Bcl-2/Bax mRNA及蛋白比值升高,Bax mRNA及蛋白表达降低,cleaved caspase-3蛋白表达降低(P<0.05);细胞色素C无明显释放,共定位系数M1、M2升高(P<0.05)。结论补肾调经方可抑制重复COS引起的囊胚细胞凋亡,提高早期胚胎质量,其作用机制可能与线粒体凋亡途径有关。

关键词：重复控制性卵巢刺激囊胚质量补肾调经方凋亡小鼠

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补肾法改善重复COS患者卵巢颗粒细胞氧化应激和临床妊娠结局的研究

补肾法改善重复COS患者卵巢颗粒细胞氧化应激和临床妊娠结局的研究

引用

作者：曹玉聪河北中医学院

学位级别：硕士

目的:随着女性生育年龄的推迟和生活方式的改变,不孕症呈现逐年上升的趋势,迄今为止,已经影响了全球约1/4的育龄女性。近年来随着生殖医学的不断进步,体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)技术已广泛应用... 详细信息

目的:随着女性生育年龄的推迟和生活方式的改变,不孕症呈现逐年上升的趋势,迄今为止,已经影响了全球约1/4的育龄女性。近年来随着生殖医学的不断进步,体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)技术已广泛应用于临床不孕症的治疗。但有临床数据显示多数生殖中心首次临床妊娠率为40%-60%,其余大部分患者仍需采用重复控制性卵巢刺激(controlled ovarian stimulation,COS)来获得妊娠。有研究结果表明,随着重复COS周期数的增长,患者卵巢储备功能、卵子数量及卵子质量等指标均呈下降趋势改变。且重复COS会造成卵巢中氧化损伤产物的堆积,影响颗粒细胞和卵泡液的正常功能,进而影响患者的临床妊娠率。补肾法是中医治疗不孕症的重要方法,补肾调经方是导师临床治疗肾虚不孕的经验方。本研究目的在于通过临床研究和细胞实验来观察补肾法对重复COS患者卵泡液及颗粒细胞抗氧化应激能力的影响;通过临床病例数据来观察补肾法对重复COS患者临床妊娠结局的影响。方法:采用随机双盲设计方法,将符合纳排标准的重复COS(2-4次)患者分为安慰剂组(30例)和补肾组(30例),另外将因输卵管因素首次接受IVF-ET的患者作为对照组(30例)。安慰剂组和补肾组患者均于末次移植失败后月经第5天服用药物3个月经周期后再行控制性卵巢刺激(3-5次),治疗结束后观察患者的临床妊娠结局指标(基本情况、性激素水平、Gn用量、获卵数、受精率、优质胚胎率和临床妊娠率)。临床研究:所有重复COS(3-5次)患者均应用拮抗剂方案,注射HCG 36-38h后在阴道B超指引下进行穿刺取卵术,留取优势卵泡之卵泡液和颗粒细胞。将含有颗粒细胞的卵泡液进行分离并提取,置于-80℃冰箱保存。应用ELISA法检测卵巢颗粒细胞及卵泡液中ROS含量、氧化损伤产物AOPP、3-NT、及4-HNE的含量;抗氧化酶NQO1的活力及T-AOC。使用RT-PCR法检测抗氧化酶NQO1的m RNA表达情况。细胞实验:将因输卵管因素首次行IVF-ET患者的颗粒细胞进行收集,并分为3组培养。(1)正常组:正常培养液培养48h;(2)模型组:在正常组培养的基础上,添加0.75mmol/l浓度HO后再培养2h;(3)补肾组:正常培养液培养24h,更换含20%补肾调经方含药血清的培养液培养24h后添加0.75mmol/l浓度HO后再培养2h。应用ELISA法检测卵巢颗粒细胞中ROS含量、氧化损伤产物AOPP、3-NT及4-HNE的含量;抗氧化酶NQO1的活力及T-AOC。使用RT-PCR法检测抗氧化酶NQO1的m RNA表达情况。结果:1.对照组、安慰剂组、补肾组患者一般情况比较:三组患者的年龄、BMI、不孕年限、基础性激素水平及AMH比较均无统计学差异(P>0.05)。与对照组比较,安慰剂组和补肾组的基础窦卵泡数均明显降低(P<0.05)。2.对照组、安慰剂组、补肾组患者临床妊娠结局指标比较:三组患者Gn使用总量、受精率比较均无统计学差异(P>0.05)。与对照组比较,安慰剂组的获卵数、优质胚胎率和临床妊娠率均明显降低(P<0.05);与安慰剂组比较,补肾组的优质胚胎率和临床妊娠率均明显升高(P<0.05)。3.对照组、安慰剂组、补肾组卵巢颗粒细胞和卵泡液中ROS含量比较:与对照组比较,安慰剂组和补肾组卵巢颗粒细胞ROS含量均明显升高(P<0.05);与安慰剂组比较,补肾组卵巢颗粒细胞ROS含量明显降低(P<0.05)。与对照组比较,安慰剂组和补肾组卵泡液中ROS含量均明显升高(P<0.05)。4.对照组、安慰剂组、补肾组卵巢颗粒细胞和卵泡液中AOPP、3-NT和4-HNE含量比较:(1)与对照组比较,安慰剂组和补肾组卵巢颗粒细胞AOPP含量均明显升高(P<0.05);与安慰剂组比较,补肾组卵巢颗粒细胞AOPP含量明显降低(P<0.05)。与对照组比较,安慰剂组和补肾组卵泡液中AOPP含量均明显升高(P<0.05);与安慰剂组比较,补肾组卵泡液中AOPP含量明显降低(P<0.05)。(2)与对照组比较,安慰剂组和补肾组卵巢颗粒细胞3-NT含量均明显升高(P<0.05);与安慰剂组比较,补肾组卵巢颗粒细胞3-NT含量明显降低(P<0.05)。与对照组比较,安慰剂组卵泡液中3-NT含量明显升高(P<0.05)。(3)与对照组比较,安慰剂组卵巢颗粒细胞4-HNE含量明显升高(P<0.05)。与对照组比较,安慰剂组卵泡液中4-HNE含量明显升高(P<0.05)。5.对照组、安慰剂组、补肾组卵巢颗粒细胞和卵泡液中抗氧化酶NQO1活力和T-AOC的比较:(1)与对照组比较,安慰剂组和补肾组卵巢颗粒细胞抗氧化酶NQO1活力均明显降低(P<0.05)。与对照组

关键词：补肾法重复控制性卵巢刺激卵巢颗粒细胞氧化应激临床妊娠率

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