为构建重组人红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)二聚体真核表达载体,应用PCR方法扩增EPO cDNA,PCR产物克隆入T载体后,经酶切、连接、转化等过程分别构建了3个EPO二聚体的真核表达载体pBT-1c、pBT-2s及pBT-3c,经测...
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为构建重组人红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)二聚体真核表达载体,应用PCR方法扩增EPO cDNA,PCR产物克隆入T载体后,经酶切、连接、转化等过程分别构建了3个EPO二聚体的真核表达载体pBT-1c、pBT-2s及pBT-3c,经测序序列完全正确。然后将3个真核表达载体分别转染于CCS-7细胞及CHO-dhfr-细胞中,用ELISA方法检测,它们在COS-7的瞬时表达量分别为4IU／ml、11.5IU／ml和7.2IU／ml。其中EPO二聚体真核表达载体pBTsv稳定转染CHO-dhfr-细胞后,用氨甲喋呤(MTX)逐渐加压的方法筛选到阳性克隆,表达量可达到4000IU／106cells／72h。
目的观察重组人红细胞生成素(recombinant human EPO,rHuEPO)对戊四氮(Pentylenetetrazol,PTZ)点燃的癫痫持续状态(status epilepticus,SE)的SD大鼠海马神经元磷酸化蛋白激酶B(p-PKB/p-Akt)和X-连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibtor of a...
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目的观察重组人红细胞生成素(recombinant human EPO,rHuEPO)对戊四氮(Pentylenetetrazol,PTZ)点燃的癫痫持续状态(status epilepticus,SE)的SD大鼠海马神经元磷酸化蛋白激酶B(p-PKB/p-Akt)和X-连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibtor of apoptosis protein,XIAP)表达的影响,应用磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyl inositol3kinase,PI3K)抑制剂LY294002进一步探讨rHuEPO作用的可能机制。方法采用PTZ制作大鼠SE模型,将点燃后的大鼠随机分为PTZ组(PTZ+NS)、rHuEPO组(PTZ+rHuEPO)、LY294002组(PTZ+LY294002+rHuEPO)、LY294002溶剂二甲基亚砜(DMSO)对照组(PTZ+DMSO+rHuEPO),正常对照组腹腔注射生理盐水(n=35)。观察大鼠行为学和脑电图的改变;TUNEL法检测海马神经细胞的凋亡情况;免疫组织化学法观察p-Akt、XIAP的表达;RT-PCR法检测各组大鼠海马XIAPmRNA的表达;Western blot法检测各组大鼠海马Akt、p-Akt蛋白的表达。结果正常对照组仅见少量凋亡细胞,p-Akt和XIAP阳性细胞、p-Akt蛋白、XIAP mRNA均有少量表达;PTZ组与rHuEPO组、LY294002组、LY294002溶剂DMSO对照组比较,p-Akt和XIAP阳性细胞数、p-Akt蛋白表达及XIAP mRNA表达均减少(P<0.05),凋亡细胞数增加(P<0.05);rHuEPO组、LY294002溶剂DMSO对照组与LY294002组比较,p-Akt和XIAP阳性细胞数、p-Akt蛋白表达及XIAP mRNA表达均增加(P<0.05),凋亡细胞数减少(P<0.05)。结论rHuEPO在SE模型中活化了PI3K/Akt,提高p-Akt蛋白的表达,进而对线粒体凋亡途径的相关调控因子XIAP的表达进行了调控,从而介导线粒体凋亡途经,发挥抗凋亡、促存活的神经保护作用。
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