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免疫学杂志 2007年第2期23卷 180-183页

作者：方希修王冬梅唐现文刘建文江苏畜牧兽医职业技术学院营养与生物技术研究室江苏泰州225300 江南大学食品学院食品营养与安全研究所教育部工业生物技术重点实验室江苏无锡214036

目的构建重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X8786/pEGFP-C3,检测增强型绿色荧光蛋白C3(EGFP-C3)在小鼠体内荧光表达。方法将质粒pEGFP-C3电转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL8786,构建重组减毒鼠伤寒沙门菌X8786(pEGFP-C3),分别灌胃饲服昆明种小鼠,流式细... 详细信息

目的构建重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X8786/pEGFP-C3,检测增强型绿色荧光蛋白C3(EGFP-C3)在小鼠体内荧光表达。方法将质粒pEGFP-C3电转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL8786,构建重组减毒鼠伤寒沙门菌X8786(pEGFP-C3),分别灌胃饲服昆明种小鼠,流式细胞仪检测脾脏细胞荧光表达,利用荧光显微镜检测小鼠组织荧光表达。结果在体外稳定试验中,重组菌经LB固体及液体培养基连续传15代后,单个菌落和菌液均呈绿色;流式细胞仪结果证实,体外情况下,减毒鼠伤寒沙门菌可以将pEGFP-C3转入小鼠腹腔灌洗巨噬细胞,并在其中表达。在体内稳定试验中,经昆明种小鼠连续传代10次,从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色,证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。用免疫剂量的重组细菌接种昆明种小鼠后,观察1个月未见有异常现象,同时剖检后也未见脏器有眼观病变。免疫一定时间后,在小鼠肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠、肌肉等组织有荧光表达。结论表达EGFP-C3的重组鼠伤寒沙门氏菌的成功构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗研制提供一个优良模型。

关键词：增强型绿色荧光蛋白C3 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌荧光表达

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以减毒沙门氏菌为载体山羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建与鉴定

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生物技术 2010年第4期20卷 3-5页

作者：殷俊磊周碧君文明樊翠华杨颖杜海燕贵州大学动物科学学院贵州省动物疫病研究室贵州贵阳550025

目的:构建以减毒沙门氏菌为载体山羊痘病毒P32基因真核表达载体。方法:以pMD-18T-P32/LD为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增出山羊痘病毒P32基因片段,定向插入真核表达载体pVAX1中,再重组表达质粒pVAX1-P32/LD。转入DH5α,再转入减毒鼠... 详细信息

目的:构建以减毒沙门氏菌为载体山羊痘病毒P32基因真核表达载体。方法:以pMD-18T-P32/LD为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增出山羊痘病毒P32基因片段,定向插入真核表达载体pVAX1中,再重组表达质粒pVAX1-P32/LD。转入DH5α,再转入减毒鼠伤寒沙门氏菌,通过双酶切、PCR及插入片段序列测序对质粒进行鉴定。结果:携带山羊痘病毒P32基因片段的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗S7207/pVAX1-P32/LD已成功构建。结论:为山羊痘基因工程疫苗的研制及诊断方法的建立奠定了基础。

关键词：山羊痘病毒 P32基因重组减毒鼠伤寒沙门氏菌真核表达载体 pVAX1

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携带pEGFPC3的减毒鼠伤寒沙门氏菌在雏鸡体内的表达

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食品与生物技术学报 2009年第3期28卷 403-407页

作者：方希修王冬梅杨晓志管军军孙进乐国伟江苏畜牧兽医职业技术学院江苏泰州225300 河南工业大学生物工程学院河南郑州450052 江南大学食品学院江苏无锡214122

构建了重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786/pEGFP-C3,检测了PEGFP-C3在雏鸡体内荧光表达。将重组减毒鼠伤寒沙门菌SL8786/pEGFP-C3分别灌胃饲服3日龄雏鸡,结果表明,在体外稳定试验中,重组菌经LB固体及液体培养基连续传20代后,单个菌落和菌液... 详细信息

构建了重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786/pEGFP-C3,检测了PEGFP-C3在雏鸡体内荧光表达。将重组减毒鼠伤寒沙门菌SL8786/pEGFP-C3分别灌胃饲服3日龄雏鸡,结果表明,在体外稳定试验中,重组菌经LB固体及液体培养基连续传20代后,单个菌落和菌液均呈淡绿色。流式细胞仪结果证实,减毒鼠伤寒沙门菌可以将pEGFP-C3转入脾脏细胞,并在其中表达。在体内稳定试验中,经雏鸡连续传代12次,从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色,证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。用免疫剂量的重组细菌接种雏鸡后,观察1个月未见有异常现象,同时剖检后也未见脏器有眼观病变。免疫一定时间后,在雏鸡肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠、肌肉等组织有荧光表达。表达PEGFP-C3的重组鼠伤寒沙门氏菌在鸡体产生荧光表达,为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗研制提供一个优良模型。

关键词：增强型绿色荧光蛋白C3(EGFP—C3) 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌荧光表达

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以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的重组HBsAg口服疫苗构建与鉴定

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食品与生物技术学报 2006年第5期25卷 98-102页

作者：方希修乐国伟王冬梅刘建文施用辉江南大学营养与生物技术研究室江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214036 江苏畜牧兽医职业技术学院营养与饲料研究所江苏泰州225300

采用大量培养含有pcDNA3s的大肠杆菌,提取pcDNA3s质粒,利用电转化方法将pcD-NA3s质粒转化到感受态减毒鼠伤寒沙门氏菌,SDS-PAPG检测到930 bp大小的条带,基因序列分析到重组菌含有乙肝表面抗原(HBsAg)基因序列;观察重组菌体外传代培养的... 详细信息

采用大量培养含有pcDNA3s的大肠杆菌,提取pcDNA3s质粒,利用电转化方法将pcD-NA3s质粒转化到感受态减毒鼠伤寒沙门氏菌,SDS-PAPG检测到930 bp大小的条带,基因序列分析到重组菌含有乙肝表面抗原(HBsAg)基因序列;观察重组菌体外传代培养的稳定性,该重组菌株在体外能稳定地繁殖、生长和传代。试验结果表明,携带HBsAg的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗X8786/pcDNA3s已成功构建,为研究和应用人和动物治疗用乙型肝炎病毒口服基因工程活疫苗奠定了基础。

关键词：重组减毒鼠伤寒沙门氏菌电转化乙肝表面抗原 SDS—PAPG 基因序列分析

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表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌感染动力学

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中国兽医学报 2003年第6期23卷 557-559页

作者：王芳焦新安刘文博孟书霞张如宽刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

用表达绿色荧光蛋白 ( green fluorescentprotein,GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 X4 5 5 0 ( p YAGFP)给 BAL B/c小鼠尾静脉注射和口服 ,对小鼠脏器进行细菌计数 ,并用间接 EL ISA法测定血清中抗细菌的抗体。结果表明 ,静脉注射重组菌... 详细信息

用表达绿色荧光蛋白 ( green fluorescentprotein,GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 X4 5 5 0 ( p YAGFP)给 BAL B/c小鼠尾静脉注射和口服 ,对小鼠脏器进行细菌计数 ,并用间接 EL ISA法测定血清中抗细菌的抗体。结果表明 ,静脉注射重组菌的小鼠在肝脏、脾脏中重组菌数量有 2个峰值 ,总的趋势是越来越少 ,而血清中抗体效价越来越高 ,可以初步推断 ,肝脏、脾脏中的细菌数量与血清中的抗体水平呈一定的相关性 ;口服重组菌的小鼠 ,在各脏器中重组菌的数量呈现正态分布的变化趋势 ,其中派伊尔结 ( Peyer′s patches,PPs)中细菌数量与血清中的抗体水平呈一定的相关性 ,而脾脏、肝脏及肠系膜淋巴结中细菌数量与血清中的抗体滴度无关。

关键词：重组减毒鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光蛋白动力学间接ELISA法抗体检测

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重组乙肝疫苗免疫原性、IgY制备及被动免疫机制研究

重组乙肝疫苗免疫原性、IgY制备及被动免疫机制研究

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作者：方希修江南大学

学位级别：博士

本研究采用电转化方法分别将质粒pcDNA3s与pEGFPC3转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786、SL8132，构建成功重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786/pcDNA3s、SL8132/pcDNA3s、SL8786/EGFPC3；研究了外源质粒pcDNA3s被重组减毒鼠伤寒沙门氏菌承载后在... 详细信息

本研究采用电转化方法分别将质粒pcDNA3s与pEGFPC3转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786、SL8132，构建成功重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786/pcDNA3s、SL8132/pcDNA3s、SL8786/EGFPC3；研究了外源质粒pcDNA3s被重组减毒鼠伤寒沙门氏菌承载后在小鼠体内的组织分布、代谢以及SL8786/pcDNA3s在动物体内的细胞免疫与体液免疫应答；检测了增强型绿色荧光蛋白C3(EGFPC3)在小鼠与雏鸡体内荧光表达；利用重组减毒鼠伤寒沙门氏菌乙肝疫苗与重组乙肝酵母疫苗制备了卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin Yolk，IgY)，进行了IgY的分离提纯、理化性质与重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗诱导HBV转基因小鼠的细胞免疫与体液免疫应答研究。以基因芯片为技术平台，研究了特异性IgY诱导的转基因小鼠肝脏基因的表达，为重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗与特异性IgY在动物疾病防治中的应用研究提供了基础。\n 应用 SDS-PAPG 检测到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786/pcDNA3s、SL8132/pcDNA3s中含有930bp大小的条带，经过基因序列分析，该重组菌含有乙肝表面抗原(HBsAg)基因序列。在体外稳定试验中，重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786/EGFPC3经LB固体及液体培养基连续传15代后，单个菌落和菌液均呈绿色；减毒鼠伤寒沙门氏菌口服后，流式细胞仪检测到EGFPC3在小鼠腹腔灌洗巨噬细胞中表达。在体内稳定试验中，经小鼠连续传代10次，从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色，证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。免疫后，在小鼠肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠、肌肉等组织有荧光表达。表达EGFPC3的重组鼠伤寒沙门氏菌的成功构建为减毒鼠伤寒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗研制提供一个优良模型。\n 减毒鼠伤寒沙门氏菌原菌SL8132、SL8786接种后连续观察雏鸡10天，不同剂量组的感染均未引起死亡，1日龄高剂量(10<\'9> CFU/只)接种组对平均增重有明显的抑制作用(P<0.01)，其它免疫组的平均增重与对照组差异不显著。接种后7周，肝脏、脾脏中已没有菌落；粪便中仅有极少量的菌落，口服减毒鼠伤寒沙门氏菌在完成抗原呈递后即被鸡体免疫系统所清除，未发现口服疫苗菌的任何长期副作用。\n 将重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗SL8786/pcDNA3s，分别灌胃饲服小鼠，用流式细胞术检测贴壁培养的小鼠脾细胞中SL8786/EGFPC3阳性率分别为19.20％和17.36％，而SL8786/pcDNA3口服的小鼠脾细胞中EGFP阳性率分别仅为1.95％和1.63％；口服免疫SL8786/pcDNA3s诱导产生了较强的特异性CTL应答。首次免疫后第2、5、8、11周分别用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)测定血清中抗-HBs，口服免疫小鼠第11周的抗-HBs含量最高。口服免疫SL8786/pcDNA3s口服转基因(Tg)小鼠，抗-HBs含量在第12周达到高峰，而pcDNA3.0质粒免疫的转基因小鼠，其血清中抗-HBs抗体始终为阴性。Tg小鼠口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌免疫后第5周起至观察结束(第12周)，未检测到HBsAg和HBeAg；而pcDNA3.0免疫的Tg小鼠在此期间可检测到HBsAg和HBeAg。\n 利用重组减毒鼠伤寒沙门氏菌与重组酵母乙肝疫苗免疫蛋鸡，取免疫后45天的产蛋鸡，颈动脉放血致死，无菌采取血清，分离卵巢上的各级卵泡，即原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、小生长卵泡、大生长卵泡、成熟卵泡，分别取卵黄，提取IgY并测定。重组沙门氏菌与酵母重组疫苗免疫得到的IgY，随免疫次数的增加，IgY抗体的含量增加，免疫后特异性抗体占总IgY的含量逐步升高。研究结果表明，IgY动态变化规律与血清抗体动态变化规律基本一致。随着卵泡的生长，卵泡细胞分泌的液体聚集到卵泡，卵泡中IgY的含量随卵泡发育阶段逐级增加，说明随卵泡的生长，血液中的血清抗体逐渐通过卵泡上的血管转运到卵泡中。\n 应用平板式膜超滤技术与DEAE离子交换层析法对卵黄免疫球蛋白(IgY)进行分离纯化，确定分子截留量为100 kDa，操作压力差为0.12 MPa、进料温度为30℃，pH 5.2，截留液抗体回收率达到91.89％，纯度为86％；最后经DEAE离子交换层析得到高纯度的IgY。在小于75℃下抗HBV IgY有良好的热稳定性。对酸碱具有一定的耐受力，在pH 4.0～10.

关键词：外源质粒 PcDNA3s 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光蛋白卵黄免疫球蛋白基因芯片免疫应答动物疾病防治

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表达GFP的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌体内感染抗原呈递细胞的动态变化

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细胞与分子免疫学杂志 2003年第5期19卷 425-427页

作者：王芳焦新安顾健马莉 Richard Lo-Man Claude Leclerc 刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室苏北人民医院血液科江苏扬州225009 法国巴斯德研究所法国巴黎75724

目的 :阐明重组减毒鼠伤寒沙门氏菌在体内早期感染抗原呈递细胞 (APC)的动态变化规律。方法 :用一定剂量的表达绿色荧光蛋白 (GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4 5 5 0(pYAGFP)口服接种BALB/c小鼠。 3d后 ,取腹腔巨噬细胞培养 2 4h ,用荧... 详细信息

目的 :阐明重组减毒鼠伤寒沙门氏菌在体内早期感染抗原呈递细胞 (APC)的动态变化规律。方法 :用一定剂量的表达绿色荧光蛋白 (GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4 5 5 0(pYAGFP)口服接种BALB/c小鼠。 3d后 ,取腹腔巨噬细胞培养 2 4h ,用荧光显微镜观察。另以该细菌静脉注射小鼠 ,于感染后 3、6和 12h,制备脾脏、肝脏低浮密度细胞。用流式细胞术检测巨噬细胞和树突状细胞的感染率。结果 :巨噬细胞感染X4 5 5 0 (pYAGFP)的百分率 ,腹腔中约为 5 0 % ,肝脏和脾脏中约为 2 0 %～ 4 0 %。树突状细胞感染X4 5 5 0 (pYAGFP)的百分率 ,脾脏中约为 4 %～ 10 % ,肝脏中约为 10 %～ 2 0 %。巨噬细胞的吞噬能力明显高于树突状细胞。结论 :感染早期 ,重组减毒鼠伤寒沙门氏菌在体内已被APC所摄取 ,为诱导有效的免疫应答提供了先决条件。

关键词：重组减毒鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光蛋白抗原呈递细胞动态变化

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减毒鼠伤寒沙门氏菌防龋疫苗免疫防龋效果的实验研究

减毒鼠伤寒沙门氏菌防龋疫苗免疫防龋效果的实验研究

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作者：胡晓莉中山大学

学位级别：硕士

该研究通过建立定菌鼠模型,并采用携带变形链球菌PAcA区片断的减毒伤寒沙门氏菌***(pET-17b/A)防龋疫苗经不同途径免疫定菌大鼠,观察其在大鼠肠道定居的能力、诱发的特异性免疫应答反应、以及对变形链球菌在大刀牙面粘附的影响和免疫防... 详细信息

该研究通过建立定菌鼠模型,并采用携带变形链球菌PAcA区片断的减毒伤寒沙门氏菌***(pET-17b/A)防龋疫苗经不同途径免疫定菌大鼠,观察其在大鼠肠道定居的能力、诱发的特异性免疫应答反应、以及对变形链球菌在大刀牙面粘附的影响和免疫防龋效果.

关键词：防龋疫苗免疫防龋重组减毒鼠伤寒沙门氏菌变形链球菌定菌鼠

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