检索结果-内蒙古大学图书馆

复旦学报（自然科学版） 2005年第4期44卷 503-506,523页

作者：姚恒美陈浩明黄璐沈琦贾韦国薛京伦复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433

造血干细胞是基因治疗理想的靶细胞之一,尤其适用于遗传性血液病.而重组慢病毒载体能高效感染造血干细胞,成为造血干细胞途径基因治疗的理想载体.从小鼠骨髓细胞中分离出单个核细胞(MNCs)进行体外悬浮培养,并用免疫磁珠法分离得到高纯... 详细信息

造血干细胞是基因治疗理想的靶细胞之一,尤其适用于遗传性血液病.而重组慢病毒载体能高效感染造血干细胞,成为造血干细胞途径基因治疗的理想载体.从小鼠骨髓细胞中分离出单个核细胞(MNCs)进行体外悬浮培养,并用免疫磁珠法分离得到高纯度的小鼠Lin-CD117+造血干细胞(HSCs).体外悬浮培养期间,添加细胞因子的造血干细胞的细胞数和集落数逐渐增加,而未添加细胞因子的对照组的细胞数量无明显增加,细胞集落递减.用磷酸钙介导的共转染法制备了携带FⅨ基因的FUXW重组慢病毒,用慢病毒载体分别感染从ICR小鼠和C57小鼠中分离得到的MNCs,7d后测得细胞上清中hFⅨ的表达量分别为41.7±4.2和34.5±6.6ng/mL,而慢病毒感染C57小鼠造血干细胞,添加细胞因子组上清中hFⅨ的表达量为46.6±5.7ng/mL,不添加细胞因子组为33.3±4.8ng/mL.实验结果表明,重组FUXW慢病毒载体可有效感染小鼠单个核细胞和Lin-CD117+造血干细胞,添加细胞因子可提高转移基因的表达量.

关键词：单个核细胞 Lin^- CD117^+造血干细胞重组慢病毒载体人凝血因子Ⅸ

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携带人ILT-3基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2010年第12期26卷 1306-1307页

作者：葛冠群田普训贾利宁丁晨光靳占魁薛武军丁小明西安交通大学第一附属医院肾病中心肾移植科陕西西安710061

目的:构建携带人ILT3基因重组慢病毒载体并检测其生物学功能。方法:从已构建好的含ILT3的质粒pB lue-scriptR-ILT3为模板,利用聚合酶链反应(PCR)方法扩增目的基因ILT3;将该基因与慢病毒载体表达质粒pLVX-AcGFP-N1连接,得到重组的pLVX-Ac... 详细信息

目的:构建携带人ILT3基因重组慢病毒载体并检测其生物学功能。方法:从已构建好的含ILT3的质粒pB lue-scriptR-ILT3为模板,利用聚合酶链反应(PCR)方法扩增目的基因ILT3;将该基因与慢病毒载体表达质粒pLVX-AcGFP-N1连接,得到重组的pLVX-AcGFP-ILT3,通过酶切和测序分析比对验证ILT3基因后,将pLVX-AcGFP-ILT3质粒利用慢病毒转染系统转染人胚胎肾上皮细胞株Lenti-X 293T细胞获得携带ILT3慢病毒载体;转染人脐静脉血管内皮细胞,利用流式细胞仪检测目的基因ILT3的表达。结果:经PCR扩增获得1 844 bp的目的基因片段,构建的重组质粒经酶切及测序和分析比对鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒,纯化、浓缩后滴度达5×1012转导单位pfu/L;转染的HUVECs,流式细胞检测ILT3阳性率为98%,可判断目的基因ILT3在靶细胞HUVECs中表达。结论:成功构建转载质粒pLVX-AcGFP-ILT3及携带ILT3基因慢病毒载体。

关键词： ILT3 重组慢病毒载体树突状细胞

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人釉原蛋白基因重组慢病毒载体的构建及在293T细胞中的表达

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上海口腔医学 2008年第1期17卷 45-50页

作者：程岚束蓉宋忠臣张秀丽薛京伦陈金中田聆黄璐上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院牙周科上海200011 上海市口腔医学重点实验室上海市口腔医学研究所上海200011 复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433

目的:构建含人釉原蛋白(human Amelogenin,hAm)成熟肽编码区基因的慢病毒载体FUAmW,并观察在重组慢病毒感染的293T细胞中釉原蛋白的表达。方法:以构建好的重组质粒PQE30-Am为模板,采用PCR技术体外扩增hAm成熟肽编码区。将扩增产物与慢... 详细信息

目的:构建含人釉原蛋白(human Amelogenin,hAm)成熟肽编码区基因的慢病毒载体FUAmW,并观察在重组慢病毒感染的293T细胞中釉原蛋白的表达。方法:以构建好的重组质粒PQE30-Am为模板,采用PCR技术体外扩增hAm成熟肽编码区。将扩增产物与慢病毒载体转移质粒FUGW分别用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后连接,构建重组慢病毒载体,转移质粒FUAmW,并进行酶切及测序鉴定。通过聚乙烯亚胺(polytheylenimine,PEI)法将三质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒FUGW和FUAmW,然后分别离体感染293T细胞,培养72h后,经荧光显微镜下观察和流式细胞计数检测感染效率,采用RT-RCR及Western印迹法检测釉原蛋白基因的表达。结果:重组质粒经测序证实,插入片段与人釉原蛋白成熟肽基因序列完全一致。流式细胞仪测得重组病毒感染293T细胞绿色荧光蛋白(green fluoresence protein,GFP)的阳性率为67.38%。RT-RCR和Western印迹均证实,重组慢病毒FUAmW感染的293T细胞能够表达人釉原蛋白。结论:成功构建携带人釉原蛋白成熟肽基因的重组慢病毒载体质粒,以293T细胞包装得到的重组人釉原蛋白病毒能感染真核细胞并获得表达。

关键词：釉原蛋白重组慢病毒载体转染感染

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重组慢病毒载体和293T-CD3细胞系及其构建方法与应用

重组慢病毒载体和293T-CD3细胞系及其构建方法与应用

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作者：蒋栋谢兴旺史云强王雪艳王江华王淼 102200 北京市昌平区沙河镇能源东路1号院1号楼3层317-2

本发明提供一种重组慢病毒载体和293T‑CD3细胞系及其构建方法与应用。该重组慢病毒载体包含CD3D、CD3G、CD3E和CD247表达盒；其中，CD3D、CD3G、CD3E和CD247各分子间以2A肽编码核酸分子相连，并在3′端连接真核抗性基因；且CD3D、CD3G、... 详细信息

标准号: CN115948470B

本发明提供一种重组慢病毒载体和293T‑CD3细胞系及其构建方法与应用。该重组慢病毒载体包含CD3D、CD3G、CD3E和CD247表达盒；其中，CD3D、CD3G、CD3E和CD247各分子间以2A肽编码核酸分子相连，并在3′端连接真核抗性基因；且CD3D、CD3G、CD3E、CD247和真核抗性基因位于同一表达盒内。本发明还提供一种基因改造的293T‑CD3细胞株，该细胞株可稳定表达CD3。该基因改造的293T‑CD3细胞株用于测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，TCR和CD3同时表达于细胞表面，为流式检测TCR的表达进而快速简便地判断TCR‑慢病毒的滴度奠定了基础。

关键词：细胞株重组慢病毒载体真核抗性基因基因改造表达盒慢病毒病毒滴度核酸分子稳定表达细胞表面肽编码滴度构建流式检测应用

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猪SBP1基因过表达与干扰重组慢病毒载体的构建及鉴定

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南方农业学报 2023年第7期54卷 2146-2154页

作者：胡荣斌洪兴潘志洪吴兴凤李莉何逸懿徐娥贵州大学动物科学学院/高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州大学动物营养与饲料研究所贵州贵阳550025

【目的】构建硒结合蛋白1基因(SBP1)过表达与干扰重组慢病毒载体,并通过感染猪骨骼肌卫星细胞验证SBP1基因的过表达和沉默效果,为后续揭示SBP1基因调控肌纤维类型转化及猪肉品质的分子机理打下基础。【方法】在对猪SBP1蛋白进行生物信... 详细信息

【目的】构建硒结合蛋白1基因(SBP1)过表达与干扰重组慢病毒载体,并通过感染猪骨骼肌卫星细胞验证SBP1基因的过表达和沉默效果,为后续揭示SBP1基因调控肌纤维类型转化及猪肉品质的分子机理打下基础。【方法】在对猪SBP1蛋白进行生物信息学分析的基础上,根据GenBank中猪SBP1基因mRNA序列(XM_021089863.1)PCR扩增SBP1基因全长序列,克隆至过表达慢病毒载体pHBLV-CMV上构建SBP1基因过表达重组慢病毒载体;同时针对猪SBP1基因设计3个干扰靶点序列和1个阴性对照序列,分别克隆至干扰慢病毒载体pHBLV-U6上构建SBP1基因干扰重组慢病毒载体。以构建的重组慢病毒载体感染猪骨骼肌卫星细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞系,并采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测SBP1基因及其蛋白的表达情况。【结果】猪SBP1蛋白分子式为C_(2523)H_(3916)N_(678)O_(727)S_(24),相对分子量为56.14839 kD,理论等电点(pI)为6.40,为稳定的分泌蛋白;存在39个潜在磷酸化位点,包括20个丝氨酸磷酸化位点、6个酪氨酸磷酸化位点及13个苏氨酸磷酸化位点。以构建的SBP1基因过表达与干扰重组慢病毒载体分别感染猪骨骼肌卫星细胞,经嘌呤霉素筛选2代后,在荧光显微镜下均能观察到绿色荧光。实时荧光定量PCR检测结果表明,过表达组的SBP1基因相对表达量极显著上调32.0倍(P<0.01,下同),干扰组中以shRNA-3的沉默效果达极显著水平,对应的SBP1基因相对表达量下调58.45%;Western blotting检测结果显示,过表达组的SBP1蛋白表达量极显著上调,而shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3干扰组的SBP1蛋白表达量均极显著下调。【结论】基于猪骨骼肌卫星细胞成功构建了猪SBP1基因过表达稳定表达细胞系,同时鉴定出shRNA-3对SBP1基因的沉默效果最佳并获得稳定沉默细胞系,为后续揭示SBP1基因调控猪肉品质的分子机理打下了基础。

关键词：猪 SBP1基因骨骼肌卫星细胞过表达干扰重组慢病毒载体

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重组慢病毒载体和293T-CD3细胞系及其构建方法与应用

重组慢病毒载体和293T-CD3细胞系及其构建方法与应用

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作者：蒋栋谢兴旺史云强王雪艳王江华王淼 102200 北京市昌平区沙河镇能源东路1号院1号楼3层317-2

标准号: CN115948470A

关键词：细胞株重组慢病毒载体真核抗性基因基因改造表达盒慢病毒病毒滴度核酸分子稳定表达细胞表面肽编码滴度构建流式检测应用

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重组慢病毒载体的构建及其感染人脐带间充质干细胞的研究

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中国小儿血液与肿瘤杂志 2014年第1期19卷 14-20页

作者：刘思征赖秀蓝陈元国贺谷雨 Martín Maldonado 林丽敏谢丽春吴卫照黄天华蔡志伟刘必刚马廉汕头大学医学院第二附属医院儿科广东515041 汕头大学医学院第二附属医院转化医学中心广东515041

目的利用包装制备的重组慢病毒载体感染人脐带间充质干细胞,为后续的细胞重编程奠定基础.方法利用组织块贴壁法分离、培养、扩增出人脐带间充质干细胞（HUMSC）.携带目的基因（oct4、sox2、klf4、c-myc）及绿色荧光蛋白的质粒经验证... 详细信息

目的利用包装制备的重组慢病毒载体感染人脐带间充质干细胞,为后续的细胞重编程奠定基础.方法利用组织块贴壁法分离、培养、扩增出人脐带间充质干细胞（HUMSC）.携带目的基因（oct4、sox2、klf4、c-myc）及绿色荧光蛋白的质粒经验证、扩增后,转染HEK-293T细胞,制备携带上述基因的慢病毒上清液.荧光显微镜下梯度稀释法检测病毒滴度.慢病毒液感染3～5代生长良好的HUMSC,荧光显微镜及流式细胞术检测病毒感染力,RT-PCR及定量PCR检测目的基因mRNA水平.结果成功验证、扩增携带目的基因的质粒.制备的新鲜病毒液滴度达5×108U/mL,冻存后降为5×106 U/ml.重组慢病毒感染HUMSC的感染力高于80％,4种目的基因的表达均明显高于对照.结论重组慢病毒载体可以在体外高效的转染HUMSC,并稳定表达目的基因,是HUMSC重编程的有效基因转移载体.

关键词：重组慢病毒载体基因转染人脐带间充质干细胞绿色荧光蛋白浓度梯度稀释法细胞重编程

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重组慢病毒载体的纯化制备方法

重组慢病毒载体的纯化制备方法

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作者：方春钱季鹏宇张琳谭本芳谢尚坤 201100 上海市闵行区都会路1699号17幢B单元301、302、303、304室

本发明公开了一种重组慢病毒载体的纯化制备方法；包括粗病毒液收获、第一次核酸酶消化、深层过滤、TFF浓缩换液、第二次核酸酶消化和层析纯化步骤；TFF浓缩换液步骤中，采用中空纤维膜将深层过滤后的粗病毒液浓缩，使用缓冲液将浓缩粗... 详细信息

标准号: CN116240241A

本发明公开了一种重组慢病毒载体的纯化制备方法；包括粗病毒液收获、第一次核酸酶消化、深层过滤、TFF浓缩换液、第二次核酸酶消化和层析纯化步骤；TFF浓缩换液步骤中，采用中空纤维膜将深层过滤后的粗病毒液浓缩，使用缓冲液将浓缩粗病毒液洗滤至原始粗毒液的1/10‑1/20，使用病毒液对管路及中空纤维束膜柱进行反向循环清洗，收集，得到超滤浓缩换液后的病毒液。本发明更新了TFF浓缩换液工序，新的TFF工艺关键步骤在于，浓缩结束后改变系统管路内的液体流动方向，将原本的正向循环清洗变更为反向的循环清洗，且反向的循环清洗必须满足30min以上，使目前的慢病毒纯化回收率提高至40％以上。

关键词：病毒液换液浓缩循环清洗核酸酶消化深层过滤重组慢病毒载体毒液层析纯化步骤病毒液浓缩中空纤维膜中空纤维束超滤浓缩改变系统工艺关键液体流动正向循环缓冲液慢病毒膜柱洗滤制备回收率清洗变更收获更新

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大鼠paralemmin-3基因重组慢病毒载体构建及其在肺泡巨噬细胞中的表达

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天津医药 2019年第7期47卷 673-677页

作者：唐俭陈旭昕樊重阳韩志海南方医科大学第二临床医学院 510515 中国人民解放军总医院第六医学中心呼吸与危重症医学科

目的构建大鼠paralemmin-3(PALM3)基因重组慢病毒载体,探讨转染大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383细胞的最佳感染复数(M OI)值及目的基因PALM3的表达情况。方法采用聚合酶链反应技术(PCR)扩增鼠PALM3基因片段,并将其克隆到pCV186-Cherry载体上;... 详细信息

目的构建大鼠paralemmin-3(PALM3)基因重组慢病毒载体,探讨转染大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383细胞的最佳感染复数(M OI)值及目的基因PALM3的表达情况。方法采用聚合酶链反应技术(PCR)扩增鼠PALM3基因片段,并将其克隆到pCV186-Cherry载体上;经PCR及DNA测序鉴定后,将重组质粒pCV186-Cherry-PALM3、辅助包装质粒pHelper1.0与pHelper2.0共转染至293T细胞进行重组慢病毒lenti-CV186-Cherry-PALM3的包装,并用荧光标记法行滴度的测定。将不同MOI值(0、 1、 10、 20、 50)的 lenti-CV186-Cherry-PALM3转染NR8383细胞,依据转染效率得到最佳MOI值,以此MOI值感染NR8383细胞,采用Westernblot法检测目的基因的表达情况。结果通过PCR扩增获得了大小约2246bp的目的基因片段,并成功连接到pCV186-Cherry重组质粒上。PCR及DNA测序结果证实重组质粒pCV186-cherry-PALM3携带正确的鼠PALM3基因并成功包装重组慢病毒颗粒。重组慢病毒lenti-CV186-Cherry-PALM3的滴度测定为3×10^8TU/mL,感染NR8383的最佳MOI为20,慢病毒lenti-CV186-Cherry-PALM3感染后NR8383细胞中PALM3的蛋白表达水平显著上调(P<0.05)。结论本实验成功构建了含大鼠PALM3基因的重组慢病毒载体lenti-CV186-Cherry-PALM3,并能在NR8383细胞中高效表达,为进一步研究PALM3对肺泡巨噬细胞极化的影响奠定了基础。

关键词：巨噬细胞,肺泡 paralemmin-3 重组慢病毒载体急性肺损伤急性呼吸窘迫综合征

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SD大鼠骨髓造血干细胞体外定向诱导扩增DC和携带FasL基因的重组慢病毒载体感染SD大鼠DC的研究

SD大鼠骨髓造血干细胞体外定向诱导扩增DC和携带FasL基因的重组慢...

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作者：乐克平徐州医学院

学位级别：硕士

目的:研究SD大鼠骨髓造血干细胞体外定向诱导扩增为树突状细胞(DC)的稳定可靠的培养方法，并探讨携带FasL基因的重组慢病毒载体感染该DC的效率和FasL蛋白的表达情况，为进一步研究转FasL基因在同种异体器官移植中诱导免疫耐受和保护移... 详细信息

目的:研究SD大鼠骨髓造血干细胞体外定向诱导扩增为树突状细胞(DC)的稳定可靠的培养方法，并探讨携带FasL基因的重组慢病毒载体感染该DC的效率和FasL蛋白的表达情况，为进一步研究转FasL基因在同种异体器官移植中诱导免疫耐受和保护移植物奠定基础。方法: ***大鼠骨髓造血干细胞体外定向诱导扩增培养DC：无菌手术取出双侧股骨和胫骨的骨髓，大鼠淋巴细胞分离液密度梯度分离出界面单核细胞，用RPMI-1640完全培养基调整细胞浓度在1.5×10<'9>/L左右，于50ml的培养瓶中加入10ml的细胞悬液，加入rr-GM-CSF和rr-IL-4于37.0℃、5％的CO<,2>培养箱中培养，每隔一天半量换液并加rr-GM-CSF和rr-IL-4，培养两周收集细胞鉴定。 2.携带FasL基因的重组慢病毒载体感染DC：使用不含抗生素，含10％FBS的DMEM培养基，将培养一周的细胞重铺于六孔板中，每孔细胞数量为5×10<'5>，24小时后观察，细胞适合感染，按照MOI=10感染细胞，使用GFP阳性对照质粒作对照实验，感染24小时后，培养皿中添加1ml新鲜培养基，每隔一天加细胞因子继续培养，荧光显微镜观察荧光强度和数量，添加病毒液后10天收集细胞进行实时定量检测和WB检测。结果: ***大鼠骨髓分离出的单核细胞培养两周后，流式细胞仪(FCM)检测细胞表面分子的阳性率MHC-Ⅱ为88.02％、CD86为62.82％、OX62为85.66％，经TNF-a刺激，阳性率MHC-Ⅱ为93.41％、CD86为93.94％、OX62为94.10％；倒置显微镜及电镜可见典型的DC形态；同种混合淋巴细胞反应(MLR)中能刺激初始T细胞进行增殖。 2. 携带FasL基因的重组慢病毒载体感染DC192小时(8d)后，细胞开始出现荧光，240小时(10d)感染效率为100％；实时定量PCR检测瞬时转染后目的基因的表达显示以Cell的1.00％为参照，Cell+FasL Plasmid为167.03％：免疫印迹检测转染后FasL蛋白的表达显示以Cell的1.00％为参照，Cell+FasLPlasmid为34.15％。结论:成功建立了SD大鼠骨髓造血干细胞体外定向诱导扩增DC的培养方法，通过形态学、分子表面标志和MIR等鉴定得到证实；携带FasL基因的重组慢病毒载体成功感染DC，实时定量PCR及Western blot证实感染的DC表达FasL明显提高。为进一步研究转FasL基因在同种异体器官移植中诱导免疫耐受和保护移植物奠定了理论和实验基础。

关键词：造血干细胞树突状细胞 FasL基因异体器官移植定向诱导扩增重组慢病毒载体

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