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重组新城疫病毒rClone30-hDR5联合TRAIL对人肝癌细胞的协同作用及其机制探讨

药学学报 2014年第7期49卷 985-992页

作者：孙田牛泽杉刘雪莹田贵游白银白福良尹杰超于丹吴云舟李德山于庆忠李思明任桂萍东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 美国农业部美国东南家禽研究所

为研究重组新城疫病毒rClone30-hDR5联合TRAIL蛋白对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用及其机制,首先将pee12.4-hDR5转染HepG2细胞,利用流式细胞仪筛选,建立了细胞表面稳定高效表达DR5的HepG2细胞系。利用MTT法检测TRAIL对该细胞和对照HepG2... 详细信息

为研究重组新城疫病毒rClone30-hDR5联合TRAIL蛋白对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用及其机制,首先将pee12.4-hDR5转染HepG2细胞,利用流式细胞仪筛选,建立了细胞表面稳定高效表达DR5的HepG2细胞系。利用MTT法检测TRAIL对该细胞和对照HepG2细胞的抑制率,表明TRAIL对该细胞的抑制率显著高于对照HepG2细胞(P<0.01),证明了克隆的hDR5具有生物学活性;与rClone30-hDR5组和TRAIL组相比,rClone30-hDR5联合TRAIL在体外能更好地抑制HepG2细胞的生长。Annexin V-FITC/PI染色和Quantitative Real-time PCR结果表明,与其他组相比,rClone30-hDR5联合TRAIL显著提高caspase 3和caspase 8的mRNA表达水平并协同诱导细胞凋亡。以1 MOI感染HepG2细胞,流式细胞仪检测证明,与rClone30相比,rClone30-hDR5能显著诱导hDR5的表达上调,从而增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性。综上所述,rClone30-hDR5联合TRAIL在肿瘤治疗方面存在潜在的应用价值。

关键词： DR5 TRAIL 重组新城疫病毒肿瘤治疗

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重组新城疫病毒rNDV-IL15在黑色素瘤治疗中的效果

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药学学报 2014年第3期49卷 310-315页

作者：牛泽杉白福良孙田田辉尹杰超曹宏伟于丹田贵游吴云舟李德山任桂萍东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 黑龙江八一农垦大学生命科学学院黑龙江大庆163319

为了提高重组新城疫病毒抑制肿瘤的效果,本实验拯救获得了重组新城疫病毒rNDV-IL15。构建prNDV-IL15重组质粒,转染BHK21细胞后,拯救重组病毒rNDV-IL15,并测定病毒生长曲线;rNDV-IL15以0.1 MOI感染B16F10细胞,ELISA法检测细胞上清液中IL1... 详细信息

为了提高重组新城疫病毒抑制肿瘤的效果,本实验拯救获得了重组新城疫病毒rNDV-IL15。构建prNDV-IL15重组质粒,转染BHK21细胞后,拯救重组病毒rNDV-IL15,并测定病毒生长曲线;rNDV-IL15以0.1 MOI感染B16F10细胞,ELISA法检测细胞上清液中IL15的表达量;MTT法比较rNDV-IL15和rNDV在体外抑制B16F10细胞的效果,并比较了两者在黑色素瘤肿瘤模型中对荷瘤小鼠的治疗效果。结果表明,rNDV-IL15构建并成功拯救;病毒生长曲线表明,插入IL15后对病毒的生长无影响;IL15在细胞上清液中有较高的表达,达到(1 044.3±27.7)ng·mL-1;rNDV-IL15和rNDV对B16F10细胞的抑制率呈时间依赖性,但两者的抑制率无显著差异;与rNDV相比,rNDV-IL15在体内能较明显地抑制肿瘤生长。结果提示,rNDV-IL15是一种更有效的抗肿瘤制剂。

关键词：重组新城疫病毒 IL15 rNDV-IL15 黑色素瘤 B16F10 抗肿瘤制剂

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重组新城疫病毒rL-RVG抑制Nrf2-GCLC-GPX4通路诱导胃癌细胞铁死亡

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陆军军医大学学报 2024年第13期46卷 1485-1493页

作者：贡克文田仪督何瑛珏李洋步雪峰江苏大学附属人民医院普外科江苏镇江212000 江苏大学附属人民医院呼吸内科江苏镇江212000

目的探讨重组新城疫病毒(recombinant Newcastle disease virus,rL-RVG)是否通过Nrf2-GCLC-GPX4通路引发胃癌细胞铁死亡。方法培养人胃癌HGC-27细胞,分别用rL-RVG、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、PBS溶液(对照组)处理HGC-27细胞后,用CCK-8、Transwell侵袭、细胞划痕实验检测胃癌HGC-27细胞的增殖、侵袭、迁移能力。加入铁死亡促进剂(erastin)、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)促进剂(TBHQ)及抑制剂(ML385)作为干预组,脂质氧化试剂盒检测各组丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;DCFH-DA荧光探针及流式细胞仪检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量;Western blot、免疫荧光法检测Nrf2-GCLC-GPX4通路相关蛋白表达情况。结果与对照组比较,rL-RVG和NDV处理后,细胞的存活率均下降,呈剂量、时间依赖性,且rL-RVG处理组较为显著(P<0.05);NDV和rL-RVG处理组胃癌HGC-27细胞迁移、侵袭能力均受到抑制,后者较前者抑制更明显(P<0.05);与对照组比较,病毒组Nrf2、GCLC、SLC7A11、GPX4蛋白表达下降(P<0.05),MDA水平、ROS相对表达量上升(P<0.05),rL-RVG组上升或下降的趋势较NDV组明显,且erastin组SLC7A11、GPX4蛋白表达下降(P<0.05);与对照组比较,TBHQ组、ML385组Nrf2、GCLC、SLC7A11、GPX4蛋白表达分别上升、下降(P<0.05),MDA水平、ROS相对表达量分别下降、上升(P<0.05);与rL-RVG组比较,rL-RVG+TBHQ组、rL-RVG+ML385组Nrf2、GCLC、SLC7A11、GPX4蛋白表达分别上升、下降(P<0.05),MDA水平、ROS相对表达量分别下降、上升(P<0.05)。结论重组新城疫病毒(rL-RVG)可通过Nrf2-GCLC-GPX4通路诱导胃癌细胞铁死亡的发生,抑制肿瘤细胞的生长。

关键词：重组新城疫病毒胃癌细胞铁死亡核因子E2相关因子2 谷胱甘肽过氧化物酶4

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重组新城疫病毒对肺癌荷瘤鼠的治疗效果研究

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东北农业大学学报 2018年第11期49卷 1-8,17页

作者：李德山张旭刘云野田贵游孙田安莹陈睿东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030

新城疫病毒用于肿瘤治疗具有良好靶向性和安全性,在众多溶瘤制剂中有独特优势。试验通过反向遗传操作技术成功拯救3株重组新城疫病毒r Clone30-IL2、r Clone30-P53和r Clone30-P53-IL2。经RT-PCR鉴定,表明插入新城疫病毒基因组中IL2、P5... 详细信息

新城疫病毒用于肿瘤治疗具有良好靶向性和安全性,在众多溶瘤制剂中有独特优势。试验通过反向遗传操作技术成功拯救3株重组新城疫病毒r Clone30-IL2、r Clone30-P53和r Clone30-P53-IL2。经RT-PCR鉴定,表明插入新城疫病毒基因组中IL2、P53基因和P53-IL2双基因均插入预期位置,未发生突变。重组新城疫病毒在DF-1细胞中生长曲线表明,其与原代毒株生长特征相同。重组病毒在鸡胚中增殖稳定性试验表明,外源基因插入未影响重组病毒在鸡胚中增殖能力。体外肿瘤细胞生长抑制试验表明,与空载体r Clone30相比,r Clone30-IL2、r Clone30-P53和r Clone30-P53-IL2对LLC肺肿瘤细胞生长抑制效果更显著(P<0.01),呈剂量依赖性。体内抑瘤试验结果表明,r Clone30-IL2、r Clone30-P53和r Clone30-P53-IL2与尿囊液相比对肿瘤抑制效果差异极显著(P<0.01)。r Clone30-P53-IL2与r Clone30-IL2和rClone30-P53相比,对肿瘤抑制效果差异显著(P<0.05)。小鼠生存率结果表明,经rClone30-P53-IL-2治疗小鼠存活率最高,与其他组相比差异极显著(P <0.01)。综上所述,联合P53和IL2重组新城疫病毒对肺肿瘤治疗效果优于单一抗肿瘤相关因子。研究为筛选先导病毒治疗肺癌奠定基础。

关键词：重组新城疫病毒反向遗传操作技术肺肿瘤

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重组新城疫病毒对肝癌肺转移鼠的治疗效果

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东北农业大学学报 2019年第5期50卷 62-70页

作者：李德山杨甲瑞苏明雪吴红松刘天艳张宇刘涵王凯东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030 哈尔滨医科大学分子影像研究中心哈尔滨150028

文章利用重组新城疫病毒(rNDA)治疗肝癌肺转移鼠,将免疫调节基因白细胞介素2(IL2)插入rNDV基因组,拯救获得rNDV-IL2。MTT法检验rNDV-IL2对肝癌HepG2细胞体外抑制效果。通过小鼠尾静脉注射H22肝癌细胞,构建肝癌细胞肺转移模型,腹腔注射r... 详细信息

文章利用重组新城疫病毒(rNDA)治疗肝癌肺转移鼠,将免疫调节基因白细胞介素2(IL2)插入rNDV基因组,拯救获得rNDV-IL2。MTT法检验rNDV-IL2对肝癌HepG2细胞体外抑制效果。通过小鼠尾静脉注射H22肝癌细胞,构建肝癌细胞肺转移模型,腹腔注射rNDV和rNDV-IL2,治疗肝癌肺转移模型小鼠。结果表明,rNDV-IL2有效感染HepG2细胞,表达外源基因IL2并抑制HepG2细胞增殖。重组新城疫病毒rNDV-IL2治疗试验动物后,体内IL2基因表达量提高,重组新城疫病毒有效控制转移灶形成,且显著促进T细胞增殖,提高试验动物存活率,未治疗组、rDNV载体治疗组和rNDV-IL2治疗组30d成活率分别为0、50%和77.8%。

关键词：重组新城疫病毒 IL2 H22 肝癌肺转移模型

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重组新城疫病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的研究

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中国预防兽医学报 2014年第12期36卷 979-981页

作者：王子龙葛金英王云鹤于桂梅孙继国步志高河北农业大学动物医学学院河北保定071000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为构建表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap)的重组新城疫病毒(NDV),本研究利用NDV La Sota弱毒疫苗株为活病毒载体,通过反向遗传操作系统构建出表达PCV2 Cap的重组病毒(r La-PCV2/Cap),以及表达删除核定位信号(NLS)的Cap(CapΔ41)的... 详细信息

为构建表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap)的重组新城疫病毒(NDV),本研究利用NDV La Sota弱毒疫苗株为活病毒载体,通过反向遗传操作系统构建出表达PCV2 Cap的重组病毒(r La-PCV2/Cap),以及表达删除核定位信号(NLS)的Cap(CapΔ41)的重组病毒(r La-PCV2/CapΔ41),并对外源蛋白的表达效果进行了检测。通过间接免疫荧光试验证明,两种重组病毒感染的BHK-21细胞中,PCV2 Cap蛋白以及删除NLS的CapΔ41蛋白均获得正确表达;其中,完整的Cap蛋白定位于核内,而删除NLS的CapΔ41蛋白则定位于胞浆中,本研究结果为研究新型PCV2疫苗奠定基础。

关键词：猪圆环病毒2型重组新城疫病毒 Cap蛋白核定位信号

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重组新城疫病毒rL-RVG通过p53-YAP1-ACSL4通路诱导肺腺癌细胞铁死亡

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医学研究与战创伤救治 2024年第1期37卷 14-22页

作者：何瑛珏李洋田仪督贡克文严玉兰江苏大学医学院镇江212013 香港大学深圳医院呼吸内科深圳518053

目的旨在探究重组新城疫病毒rL-RVG是否通过p53-YAP1-ACSL4通路影响肺腺癌细胞铁死亡。方法体外培养人肺腺癌细胞系A549、PC9,将处于对数增殖期的细胞分为对照组(NC组)、新城疫病毒感染组(NDV组)、重组新城疫病毒感染组(rL-RVG组)、铁... 详细信息

目的旨在探究重组新城疫病毒rL-RVG是否通过p53-YAP1-ACSL4通路影响肺腺癌细胞铁死亡。方法体外培养人肺腺癌细胞系A549、PC9,将处于对数增殖期的细胞分为对照组(NC组)、新城疫病毒感染组(NDV组)、重组新城疫病毒感染组(rL-RVG组)、铁死亡诱导剂组(Erastin组)及铁死亡抑制剂组(NAC组)。在病毒感染和铁死亡诱导剂、抑制剂干预后,通过CCK-8、划痕实验和Transwell来检测细胞的功能学变化,包括细胞活力、迁移能力和侵袭能力;光学显微镜观察细胞形态改变。使用流式细胞术和荧光显微镜来测定细胞中ROS的含量,用酶标仪对MDA含量进行测定,通过Western blot和实时荧光定量PCR来检测铁死亡相关蛋白p53、YAP1及ACSL4的表达。结果与NC组相比,rL-RVG组细胞生长、迁移及侵袭能力明显下降(P<0.01);ROS及MDA水平升高且与铁死亡诱导剂组相比含量显著提高(P<0.01),铁死亡抑制剂干预后含量均减少(P<0.01);铁死亡关键蛋白p53、YAP1、ACSL4表达量明显升高(P<0.01);Si-RNA敲减YAP1和ACSL4后相应蛋白的表达量减少(P<0.01),并且ROS和MDA含量均减少(P<0.01)。结论rL-RVG可以有效地阻止肺腺癌细胞的增殖、迁移和扩散,并且能够通过p53-YAP1-ACSL4轴增加脂质过氧化物和细胞活性氧的含量,最终诱导肿瘤细胞铁死亡。

关键词：重组新城疫病毒肺腺癌铁死亡 YAP1 ACSL4

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重组新城疫病毒HN与F蛋白免疫保护作用的初步研究

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中国家禽 2005年第8期27卷 11-14页

作者：刘铀毕英佐曹永长陈绍红华南农业大学动物科学学院广东广州510642 湛江海洋大学生化中心广东湛江524088

95只1日龄SPF鸡随机分成5组,1～4组分别于10日龄接种ΦT4、ΦT4-Z1-HN、ΦT4-Z1-F、ΦT4-Z1-HN+ΦT4-Z1-F油乳剂疫苗,第5组接种ND弱毒疫苗,25日龄加强免疫一次。结果表明,重组HN和F蛋白均能诱导ND抗体产生,但抗体水平显著低于用弱毒疫... 详细信息

95只1日龄SPF鸡随机分成5组,1～4组分别于10日龄接种ΦT4、ΦT4-Z1-HN、ΦT4-Z1-F、ΦT4-Z1-HN+ΦT4-Z1-F油乳剂疫苗,第5组接种ND弱毒疫苗,25日龄加强免疫一次。结果表明,重组HN和F蛋白均能诱导ND抗体产生,但抗体水平显著低于用弱毒疫苗免疫的第5组。60日龄时用100LD50NDV强毒株攻毒,第1组鸡100%发病和死亡,ΦT4-Z1-HN和ΦT4-Z1-F免疫组的死亡率分别为50%和15.8%;用ΦT4-Z1-HN+ΦT4-Z1-F和ND弱毒疫苗免疫的第4、5组鸡无一死亡。

关键词：重组新城疫病毒 HN蛋白 F蛋白免疫保护作用基因工程疫苗 T4噬菌体展示系统

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重组新城疫病毒rL-hIFN-λ1诱导THP-1细胞M1型极化研究

重组新城疫病毒rL-hIFN-λ1诱导THP-1细胞M1型极化研究

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作者：张日婷江苏大学

学位级别：硕士

目的　　肿瘤相关巨噬细胞具有可塑性和异质性，可向不同免疫表型的巨噬细胞极化，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。本研究旨在探讨表达IFN-λ1的的重组新城疫病毒rL-hIFN-λ1对THP-1源巨噬细胞极化的影响，THP-1-rL-hIFN-λ1对A549... 详细信息

目的　　肿瘤相关巨噬细胞具有可塑性和异质性，可向不同免疫表型的巨噬细胞极化，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。本研究旨在探讨表达IFN-λ1的的重组新城疫病毒rL-hIFN-λ1对THP-1源巨噬细胞极化的影响，THP-1-rL-hIFN-λ1对A549肺腺癌细胞增殖及迁移的作用，以及巨噬细胞浸润表型与肺腺癌临床分期之间的关系。　　方法　　1、THP-1-M0、THP-1-M1、THP-1-M2型巨噬细胞诱导：首先用PMA150nM干预THP-1细胞24h，使THP-1细胞极化为M0型巨噬细胞（未激活型）。再分别使用LPS10pg/mL/IFN-γ20ng/mL和IL-420ng/mL干预M0型巨噬细胞24h，得到THP-1-M1和THP-1-M2型巨噬细胞。倒置相差显微镜下观察THP-1-M0、THP-1-M1、THP-1-M2三组巨噬细胞的形态特点。实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)鉴定M1、M2型巨噬细胞表型。　　2、实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)、免疫荧光、ELISA法检测rL-hIFN-λ1诱导巨噬细胞极化：用MOI=1.0的rL-hIFN-λ1病毒悬液干预THP-1-M0型巨噬细胞24h，得到THP-1-rL-hIFN-λ1型巨噬细胞。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测THP-1-M1、THP-1-M2、THP-1-rL-hIFN-λ1型巨噬细胞标志物CD86、CD163mRNA表达;免疫荧光检测CD86、CD163蛋白表达;ELISA法检测IL-2、IL-13、IL-10及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等分泌因子含量。　　3、克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验检测THP-1-rL-hIFN-λ1对A549肺腺癌细胞增殖及迁移的影响：　　A549与不同极化类型巨噬细上清液（CM）共培养，待肉眼看见细胞生长成团，洗涤细胞，使用浓度为4%的多聚甲醛低温条件下对细胞进行固定，浓度为0.2%的结晶紫溶液对细胞进行染色，待染色充分，统计细胞克隆形成数量，计算A549细胞克隆形成率，细胞克隆形成率=（克隆细胞数/接种细胞数）（实验重复3次）。　　取对数生长期A549细胞，接种至无菌细胞培养板，当细胞密度达80%～90%左右，PBS洗涤A549细胞，随后用上述不同极化类型巨噬细胞CM分别处理A549细胞，每组设置3个复孔，并在每孔正中位置划痕，0h、24h分别拍照。　　将不同组CM分别添加到Transwell培养体系的下层小室中，A549细胞悬浮于上层小室，共培养24h，无菌PBS洗涤聚碳酸酯膜，4%的多聚甲醛溶液固定聚碳酸酯膜上的A549细胞，0.2%的结晶紫溶液对细胞进行染色，无菌PBS充分漂洗小室染液，用无菌的细胞刮棒刮去上层小室内壁细胞，PBS洗涤液漂洗，10min/3次，并在倒置相差显微镜下拍照记录。　　4、免疫组化实验检测临床肺腺癌标本中巨噬细胞浸润表型：　　取临床肺腺癌组织18例，按照TNM分期标准进行分期，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期各6例。使用免疫组化检测各组不同分期临床标本及胸腔积液中CD86和CD163蛋白表达程度。　　结果　　1、倒置相差显微镜下可见，THP-1-M0、THP-1-M1、THP-1-M2各组细胞形态之间存在显著差异，THP-1-M0型巨噬细胞形态呈透明规则圆形，细胞体积大小一致，散落生长，分布较均匀。THP-1-M1型巨噬细胞多可伸出伪足，呈长梭形，细胞体积较THP-1-M0偏大，呈形态不规则，复杂多样，广泛聚集贴壁生长。THP-1-M2型巨噬细胞，同样呈现贴壁生长状态少量可伸出细胞伪足，但长梭形形态细胞较THP-1-M1偏少，部分细胞亦表现出聚集生长趋势。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)显示，与THP-1-M0相比，THP-1-M1高表达M1型巨噬细胞标志物CD86mRNA(t=10.51，P＜0.01)，THP-1-M2高表达M2型巨噬细胞标志物CD163mRNA(t=3.44，P＜0.05)。　　2、qRT-PCR结果显示，与THP-1-M0相比，THP-1-rL-hIFN-λ1组高表达M1型巨噬细胞标志物CD86的mRNA(t=4.58，P＜0.05)，低表达M2型巨噬细胞标志物CD163的mRNA，有统计学意义。免疫荧光结果提示THP-1-M1型巨噬细的CD86阳性率最高，THP-1-rL-hIFN-λ1型巨噬细胞次之，THP-1-M2型巨噬细胞最低。而CD163阳性率在THP-1-M2型巨噬细胞中最高，THP-1-rL-hIFN-λ1型巨噬细胞次之，THP-1-M1型巨噬细最低;ELISA实验结果显示，与THP-1-M0组相比，THP-1-rL-hIFN-λ1组TNF-α和IL-2表达水平明显升高(t=24.74，7.14，P均＜0.01)，而IL-10和

关键词：肺腺癌重组新城疫病毒肿瘤相关巨噬细胞浸润表型临床分期

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重组新城疫病毒rClone30-CD的构建及其抑制肿瘤效果的研究

重组新城疫病毒rClone30-CD的构建及其抑制肿瘤效果的研究

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作者：吕政东北农业大学

学位级别：硕士

恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，尽管针对肿瘤治疗的手段已有较大的改善和提高，但仍不能明显提高对肿瘤的抑制效率和增加患者的生存几率。传统的治疗手段有放射疗法和化学疗法，但二者的治疗存在很大风险，治疗过程还会给患者带来... 详细信息

恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，尽管针对肿瘤治疗的手段已有较大的改善和提高，但仍不能明显提高对肿瘤的抑制效率和增加患者的生存几率。传统的治疗手段有放射疗法和化学疗法，但二者的治疗存在很大风险，治疗过程还会给患者带来痛苦且存在副作用。手术切除肿瘤法，虽然可以去除病灶，但依然有肿瘤扩散和复发的可能性。新城疫病毒（Newcastledisease virus，NDV）为不分节段的单股负链RNA病毒，隶属于副粘病毒科禽副粘病毒属。上世纪六十年代，研究发现NDV可用于治疗人类肿瘤，其可在肿瘤细胞中进行特异性复制，同时对正常细胞并无明显的影响。反向遗传操作技术已经成熟建立，目前应用十分广泛。研究者可以利用该技术对病毒基因组加以改造，使野生型毒株的抗肿瘤效果得以提升。本研究将自杀基因CD插入到重组新城疫病毒的基因组中，并通过反向遗传操作技术拯救病毒，协同5氟胞嘧啶（5-flucytosine，5-FC），增加治疗的靶向性，达到抑制肿瘤的目的。 CD(Cytosine deaminase)为自杀基因家族的成员之一，它存在于大肠杆菌或酵母菌等基因组当中，在哺乳动物体内并不存在。CD可将相应的无毒前导药物（prodrug）5-FC转化为具有毒性的抗肿瘤药物5氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），后者可引起肿瘤细胞死亡。通过克隆技术获得大肠杆菌*** JM109菌株全基因组中的CD基因，构建成真核表达质粒pEE12.4-CD-IRES-EGFP（pEE12.4IE-CD）并转染HepG2细胞，为验证CD表达产物的体外生物学活性，以不同浓度的5-FC孵育单层细胞，采用MTT法检测细胞的死亡率，结果表明CD转化5-FC效果良好，HepG2细胞生长受到显著抑制。携带自杀基因进入细胞的常用载体有慢病毒和腺病毒，这两种载本身并不具备杀伤肿瘤的作用。而利用自身具有抗肿瘤能力的新城疫病毒作为载体，携带CD基因进入肿瘤细胞，可以增强二者的抗肿瘤能力。本研究首次利用反向遗传操作技术在重组新城疫病毒弱毒株LaSota rClone30基因组的F基因和HN基因之间插入了CD基因的开放阅读框，构建带有CD基因的NDV全长cDNA转录质粒pBrClone30-CD。将该转录质粒与表达核衣壳蛋白、磷酸化蛋白以及大聚合酶蛋白的辅助质粒，共同转染能够稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞，拯救后获得的重组新城疫病毒于SPF鸡胚中进行增殖，并收集尿囊液进行血凝和血凝抑制实验，重组病毒命名为重组新城疫病毒rClone30-CD株。通过在鸡胚中连续传代8代，确定插入CD基因的新城疫病毒可以稳定增殖。说明CD基因片段的插入并未对病毒复制能力造成影响。在体外实验中，采用MTT法检测不同MOI的重组新城疫病毒对HepG2细胞的抑制作用。结果表明，重组病毒可以有效地抑制HepG2细胞的生长，并呈现剂量依赖性。在较高的MOI条件下，rClone30-CD/5-FC抑制效果明显大于rClone30-CD，说明重组新城疫病毒与前导药物5-FC协同效果显著。在体内实验中，我们首先对5-FC的半数致死量（LD50）和最大安全剂量进行测定，保证实验小鼠的安全和药物注射剂量的最优化。建立昆明小鼠H22腹股沟皮下荷瘤模型，通过瘤内注射重组新城疫病毒，并采用瘤内或尾静脉两种不同的方式注射5-FC，达到协同治疗肿瘤的目的。实验结果表明，与rClone30-CD治疗组相比，rClone30-CD/5-FC抑制肿瘤生长的效果明显，重组新城疫病毒与前导药物5-FC协同效果显著，而且可以提高小鼠的存活率。两种不同给药方法所得到结果一致，说明瘤内注射或尾静脉注射5-FC，均能达到良好的抑制肿瘤目的。对小鼠血样中5-FU的含量进行测定，在rClone30-CD/5-FC组的样本中检测到5-FU的存在，5-FC组未检出5-FU。结果表明，插入到NDV中的外源CD基因具有生物学活性，可将5-FC转化为5-FU，并且由于5-FU的存在，使得rClone30-CD/5-FC的抗肿瘤作用显著提升。综上所述，本研究应用反向遗传操作技术，成功拯救重组NDV rClone30-CD，体外实验证实重组NDV rClone30-CD/5-FC能有效的杀伤HepG2细胞。在体内试验中，采用两种不同方法进行5-FC给药，rClone30-CD/5-FC均能达到良好的抑制肿瘤细胞效果，并且可以延长实验小鼠的存活时间。本研究为提高NDV弱毒株治疗肿瘤效果以及为重组新城疫病毒作为自杀基因的载体，应用于恶性肿瘤的靶向治疗奠定良好的基础。

关键词：重组新城疫病毒反向遗传操作技术自杀基因胞嘧啶脱氨酶肿瘤细胞荷瘤鼠模型

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