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1 篇 学位论文

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1 篇 电子文献
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1 篇 理学
- 1 篇 生物学

主题

1 篇 对映归一性
1 篇 绿豆
1 篇 生物催化
1 篇 底物谱
1 篇 重组环氧水解酶
1 篇 化学-酶法组合催化...
1 篇 分子改造

机构

1 篇 华东理工大学

作者

1 篇 吴燕雯

语言

1 篇 中文

检索条件"主题词=重组环氧水解酶"

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详细简洁

排序：

绿豆环氧水解酶VrEH2催化性质研究及分子改造的初步探索

绿豆环氧水解酶VrEH2催化性质研究及分子改造的初步探索

引用

作者：吴燕雯华东理工大学

学位级别：硕士

环氧水解酶(epoxide hydrolase, EH)能够立体选择性催化一分子水加成到环氧底物分子上,促使环氧底物开环水解生成其相应的二醇产物。由于环氧水解酶催化水解时无需辅因子的参与,且具有高立体和位置选择性的特点,因此,近年来环氧水解酶... 详细信息

环氧水解酶(epoxide hydrolase, EH)能够立体选择性催化一分子水加成到环氧底物分子上,促使环氧底物开环水解生成其相应的二醇产物。由于环氧水解酶催化水解时无需辅因子的参与,且具有高立体和位置选择性的特点,因此,近年来环氧水解酶作为一种有效的生物催化剂被广泛应用于环氧化物及二醇的手性合成。绿豆(Vigna radiata)环氧水解酶能对映归一性地催化外消旋的对硝基苯乙烯氧化物(rac-pNSO)水解生成单一构型R-邻位二醇((R)-pNPG),故备受关注。本课题组早前己从绿豆(Vigna r adiata)中克隆得到两种环氧水解酶VrrEH1和VrEH2。而本论文利用发酵罐获得了大量VrEH2。的粗酶粉；在进一步考察VrEH2酶学性质的基础上,建立了化学-酶法偶联制备光学纯(R)-pNPG的新工艺；拓展了VrEH2的底物谱,优化了VrEH2催化制备光学纯(R)-2,3-二甲基苯基缩水甘油醚的条件；结合同源建模与分子改造,改善了VrH2的可溶性表达,筛选出影响VrEH2活力的关键氨基酸,为后续VrEH2的分子改造和应用奠定了基础。具体内容包括：1、用3-L发酵罐培养获得了14 g的VrEH2粗酶冻干粉(44 U/g)；经一步Ni柱亲和层析,所得纯酶对rac-pNSO的比活力为1.95 U/mg,提高了44倍,活力回收率为31.9%；重组VrEH2的最适反应条件分别为pH6.5和30-C,优先催化水解(R)-pNSO; VrEH2可以同时亲核攻击rac-pNSO环氧环上的两个碳原子,对(S)-pNSO (87.2% to Cα)和(R)-pNSO (98.4% to Cβ)有相反的位置选择性,以对映体汇聚的方式催化水解rac-pNSO并形成单一构型的产物(R)-pNPG。2、考虑到VrEH2对(S)-pNSO Cα的位置选择性为87.2%,而酸催化水解(S)-pNSO比起酶水解有更好的位置选择性(91.5% to Cα)和催化速率,因此设计建立了化学-酶法组合催化rac-pNSO对映归一性水解的新工艺。与单独酶催化相比,不仅产物(R)-pNPG的光学纯度由84.8% ee提高到89.4% ee,还显著加快了反应进程,时间缩短到原来的四分之一。利用化学-酶法工艺扩大制备了(R)-pNPG,所得产品的对映体过量值(eep)为89.9%,分离得率为91.1%；经氯仿重结晶精制之后,终产品的ee值达到99%,产率为71.5%。3、选择2种苯乙烯环氧化物衍生物和10种苯基缩水甘油醚类底物测定了VrEH1和VrEH2的底物谱；两种酶对苯基缩水甘油醚类底物的活力均高于苯乙烯氧化物衍生物,但除2,3-二甲基苯基缩水甘油醚(8a)之外,对其它苯基缩水甘油醚类底物的立体选择性较差；吐温-80的存在能提高VrEH2的立体选择性；反应条件优化后,在100 ml反应体系中利用VrEH2催化制备了光学纯(R)-2,3-二甲基苯基缩水甘油醚(8a),终产品产率为27.5%,ee值达到98%。4、结合同源建模与定点突变实验,获得可溶性表达改善的VrEH2突变体Ml(G3E/V4I);突变体酶M1的最适pH、最适温度、底物选择性、活力等与VrEH2母本差别不大,但热稳定性有所提高；以催化三联体中Asp101为中心,选择了活性中心周围12个氨基酸位点进行了丙氨酸扫描,确定了对蛋白活力影响较大的3个位点P185,L261和F298,为后续的蛋白的分子改造奠定基础。

关键词：绿豆重组环氧水解酶对映归一性底物谱生物催化化学-酶法组合催化分子改造

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