检索结果-内蒙古大学图书馆

免疫学杂志 2007年第4期23卷 357-361页

作者：杨春徐蕾伊正君何永林李娜王渝伟张黎朱道银重庆医科大学免疫学与微生物学教研室重庆400016

目的评估携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染的治疗效果,及其与临床抗痨药物疗效的比较。方法结核分枝杆菌H37Rv感染Balb/c小鼠4周后分别用生理盐水、GLS/IL-12重组耻垢分枝杆... 详细信息

目的评估携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染的治疗效果,及其与临床抗痨药物疗效的比较。方法结核分枝杆菌H37Rv感染Balb/c小鼠4周后分别用生理盐水、GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌(重组M.S)I、NH+PZA和重组M.S+INH+PZA治疗,于第1次治疗后3个月,处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平、血清IL-12和IFN-γ分泌水平、肺泡灌洗液SIgA的水平和肺、脾组织中GLS表达,同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果重组***、NH+PZA和重组M.S+INH+PZA治疗组肺、脾组织荷菌量(logCFU/g)比生理盐水组显著降低。重组M.S组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于其它组。重组M.S组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于其它组。各组产生黏膜特异性SIgA明显高于未经感染组。用免疫组化检测到小鼠肺及脾组织中GLS的表达。生理盐水组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛,正常肺泡结构被破坏;其余组肺组织病变轻且局限。结论重组M.S对小鼠结核病有一定免疫治疗作用,通过增强宿主Th1型免疫应答和GLS的抗菌活性有关;重组M.S对临床常用的抗结核药有协同作用,为结核病的综合治疗打下实验基础。

关键词： GLS IL-12 重组耻垢分枝杆菌结核病

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重组耻垢分枝杆菌NY-ESO-1疫苗的制备及其免疫原性分析

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中国生物制品学杂志 2015年第12期28卷 1233-1237,1244页

作者：陈丹丹高丹瞿爱东徐帆洪上海生物制品研究所有限责任公司上海200052

目的制备重组耻垢分枝杆菌(recombinant Mycobacterium smegmatis,***)NY-ESO-1疫苗,并分析其在小鼠体内的免疫原性。方法从人睾丸m RNA中扩增NY-ESO-1基因,克隆至携带β半乳糖苷酶信号肽的表达载体,转化***,构建r ***。以***经腹腔免... 详细信息

目的制备重组耻垢分枝杆菌(recombinant Mycobacterium smegmatis,***)NY-ESO-1疫苗,并分析其在小鼠体内的免疫原性。方法从人睾丸m RNA中扩增NY-ESO-1基因,克隆至携带β半乳糖苷酶信号肽的表达载体,转化***,构建r ***。以***经腹腔免疫小鼠,200μl/只,于第12周用NY-ESO-1加强免疫1次,第3、6、9、12、13周经尾静脉采血1次,分离血清,并于第13周取小鼠脾脏,制备脾淋巴细胞,检测小鼠血清中NY-ESO-1抗体及其亚型、CD4^+、CD8^+T细胞比例、脾细胞增殖能力、IFNγ及IL-2的分泌水平及体外CTL杀伤能力。结果加强免疫后,与NY-ESO-1组比较,***-p LA71NY组小鼠血清抗体水平差异无统计学意义(P>0.05),CD4~^+及CD8^+T细胞比例、IFNγ及IL-2的分泌水平及体外CTL杀伤能力均显著升高(P<0.05),脾细胞的增殖能力显著下降(P<0.05)。结论 *** NY-ESO-1疫苗在小鼠体内具有良好的免疫原性,为该疫苗用于肿瘤的免疫治疗奠定了基础。

关键词：重组耻垢分枝杆菌 NY-ESO-1 免疫原性

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重组耻垢分枝杆菌rMS-Ag85a-IL-17a在非嗜酸性粒细胞型哮喘中的作用与机制

重组耻垢分枝杆菌rMS-Ag85a-IL-17a在非嗜酸性粒细胞型哮喘中的作...

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作者：徐婉婷上海交通大学

学位级别：博士

背景:随着对支气管哮喘临床与机制的深入研究,发现近半数的哮喘患者表现为非嗜酸性粒细胞型哮喘(non-eosinophilic asthma,NEA),其气道炎症以多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)浸润为主,往往对糖皮质激素(glucocortic... 详细信息

背景:随着对支气管哮喘临床与机制的深入研究,发现近半数的哮喘患者表现为非嗜酸性粒细胞型哮喘(non-eosinophilic asthma,NEA),其气道炎症以多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)浸润为主,往往对糖皮质激素(glucocorticoids,GC)治疗不敏感。IL-17是一种重要的前炎症因子,可刺激效应细胞表达多种PMN的趋化因子,引起PMN的聚集及炎症反应。因此,阻断IL-17A或可减轻NEA气道炎症。我们已成功构建了rMS-Ag85a-IL-17a疫苗,并证明该疫苗可诱导生成IL-17A自身抗体,在重症哮喘模型的治疗中取得了相当的疗效。本实验拟构建小鼠NEA模型,进一步研究rMS-Ag85a-IL-17a拮抗NEA气道炎症的作用与相关机制。目的:rMS-Ag85a-IL-17a免疫小鼠,诱导生成IL-17A自身抗体,体外提取纯化,探讨其抑制PMN的功能及抗NEA的气道炎症的作用与机制。方法:本实验分四部分:(1)NEA模型的复制建立及PMN的作用:以DO11.10小鼠复制建立NEA模型,观察PMN在NEA和EA模型中的作用。肺泡灌洗液(BALF)分类计数,观察PMN数目;ELISA法检测BALF中IL-4、IFN-γ、IL-17A、IL-6、CXCL-1、CXCL-2的表达水平;RT-PCR检测肺组织中ENA-78、NAP-2、NE的mRNA表达情况;测定BALF及肺组织中MPO活性。(2)rMS-Ag85a-IL-17a免疫方案的建立及提取纯化IL-17A自身抗体:rMS-Ag85a-IL-17a经鼻腔免疫小鼠,ELISA法动态检测血清IL-17A自身抗体的滴度,在表达高峰时段分次大量提取血清,蛋白质A亲和层析法纯化IL-17A自身抗体,紫外分光光度法测定纯化抗体的浓度,SDS-Page鉴定抗体的完整性和稳定性,ELISA法测定抗体的活性。(3)IL-17A自身抗体抑制PMN趋化:Transwell下室接种RAW264.7细胞,商品化IL-17A重组蛋白刺激,纯化的IL-17A自身抗体进行阻断,上室加入提取的小鼠外周血PMN,MTT法间接测量穿过小室的PMN数目,ELISA法测定细胞培养上清中CXCL-1、CXCL-2的分泌水平,结果与PBS组、IL-17A组及IL-17A自身抗体组进行比较,观察IL-17A自身抗体抑制PMN的趋化作用,Western blot检测IL-17A自身抗体对趋化因子转录途径的影响。(4)rMS-Ag85a-IL-17a抗NEA气道炎症反应的作用与机制:DO11.10小鼠分为对照组、哮喘组、ICS组、rMS-Ag85a-IL-17a组及MS组。H&E染色计数BALF中细胞总数及分类计数,ELISA法检测BALF中IL-17A、IL-6、IL-23、CXCL-1、CXCL-2的表达水平;RT-PCR检测肺组织中ENA-78、NAP-2、NE、T-bet、GATA-3、ROR-γt的mRNA表达情况;测定BALF及肺组织中MPO活性;H&E和PAS染色观察小鼠肺组织病理改变。结果:(1)DO11.10哮喘小鼠BALF中以PMN增多为主,IL-17A、IL-6、CXCL-1、CXCL-2及肺组织中ENA-78、NAP-2、NE的mRNA表达升高,MPO活性增强。(2)rMS-Ag85a-IL-17a诱导产生的血清IL-17A自身抗体可长期维持较高水平的滴度,纯化后IL-17A自身抗体具备良好的完整性、稳定性及高活性。(3)IL-17A自身抗体能通过拮抗IL-17A,减少IL-17A效应细胞分泌趋化因子从而抑制PMN的聚集。(4)rMS-Ag85a-IL-17a干预NEA小鼠,可明显减少BALF中白细胞总数及PMN数量;降低BALF中IL-17A、IL-6、IL-23、CXCL-1、CXCL-2及肺组织中ENA-78、NAP-2、NE的mRNA表达,抑制MPO的活性,其中肺组织中NE的mRNA表达明显低于ICS组;T-bet、GATA-3、ROR-γt的mRNA表达无明显差异;肺组织病理显示rMS-Ag85a-IL-17a干预组的气道炎症明显减轻,炎性细胞渗出及气道粘液分泌减少。结论:(1)PMN的数量、活性增加是引起NEA型哮喘气道炎症的主要原因。(2)rMS-Ag85a-IL-17a诱导产生长期高水平的IL-17A自身抗体,IL-17A自身抗体具良好的完整性、稳定性及高活性。(3)IL-17A自身抗体可抑制PMN的趋化作用。(4)rMS-Ag85a-IL-17a免疫后可有效减轻NEA型哮喘小鼠的气道炎症。

关键词：中性粒细胞白介素-17A 重组耻垢分枝杆菌自身抗体支气管哮喘

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重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导的免疫应答、保护力及对感染小鼠的免疫治疗作用

重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导的免疫应答、保护力及对感染小鼠...

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作者：赵善民第四军医大学

学位级别：硕士

背景耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，MS）是一种生长快、转化效率高的非致病性分枝杆菌。研究显示其1-3小时便可繁殖一代，生长速率是卡介苗（BCG）的10倍。低剂量的耻垢分枝杆菌对人、小鼠和豚鼠均不致病，并能很快被机体清... 详细信息

背景耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，MS）是一种生长快、转化效率高的非致病性分枝杆菌。研究显示其1-3小时便可繁殖一代，生长速率是卡介苗（BCG）的10倍。低剂量的耻垢分枝杆菌对人、小鼠和豚鼠均不致病，并能很快被机体清除。耻垢分枝杆菌表达外源蛋白的水平可达结核分枝杆菌（MTB）的5-10倍，单位时间内分泌的蛋白产量比MTB高50-100倍。基于以上优势，耻垢分枝杆菌有望成为代替BCG的有效疫苗载体。已有的研究证实，MTB肝素结合血凝素（HBHA）抗原对MTB感染具有明确的治疗效果，而人白介素12（hIL-12）在针对胞内菌的细胞免疫中起着关键作用。因此，构建表达HBHA与hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌可通过融合基因表达产物有效提高单个优势抗原的免疫原性；另一方面，重组耻垢分枝杆菌能够集中靶抗原和活载体的优势，可能提高HBHA诱导机体产生免疫应答的水平和保护力，增强巨噬细胞对体内MTB的清除作用。目的采用分子生物学技术，构建了表达HBHA与hIL-12融合基因的重组耻垢分枝杆菌，并通过检测其在小鼠体内诱导的免疫应答、保护力和对感染小鼠的免疫治疗作用，以期为结核病的预防和治疗提供新的有效候选疫苗。实验方法和结果 1.重组耻垢分枝杆菌的构建及鉴定我们根据GeneBank中查找到的结核分枝杆菌肝素结合血凝素（hbha）基因及人白介素12（hil-12）基因，分别设计两段基因的引物，用分子生物学技术构建分枝杆菌穿梭表达质粒pSMT3-HBHA-hIL12，并用电穿孔法将重组质粒转入耻垢分枝杆菌中。采用免疫荧光法和蛋白质印迹（Westernblot），分别检测HBHA和hIL-12蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达，并通过检测培养物OD600的吸光度，确定重组耻垢分枝杆菌生长状态未发生明显改变。 2.重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力将表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌采用同源加强免疫的方法免疫小鼠，测定重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导产生的免疫应答水平，检测小鼠外周血中IFN-γ、IL-2和IL-12的表达水平和CD4+、CD8+T细胞在外周血中所占的比例。并用结核分枝杆菌感染免疫小鼠，通过检测小鼠肺部荷菌量和组织病理变化评价该重组耻垢分枝杆菌诱导的保护力。结果显示重组耻垢分枝杆菌诱导小鼠产生以IFN-γ、IL-2分泌量增加为主的Th1型免疫应答，能有效减少感染小鼠肺部结核分枝杆菌的荷菌量，并能有效减轻其病理损伤，诱导小鼠产生与BCG相当的保护作用，因此该重组耻垢分枝杆菌可能成为控制结核病的有效疫苗。 3.重组耻垢分枝杆菌对感染小鼠的治疗作用结核分枝杆菌感染小鼠4w后，皮下接种重组耻垢分枝杆菌，检测免疫小鼠肺部荷菌量和组织病理变化。结果显示，重组耻垢分枝杆菌虽然不及化疗药物显著降低肺部荷菌量，但可以有效控制感染小鼠肺部结核分枝杆菌的荷菌量并减轻病理损伤。结论表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌可以有效控制结核分枝杆菌在小鼠体内的增殖，并能显著减少感染小鼠肺部荷菌量，可能成为控制结核病感染的免疫治疗新策略。

关键词：重组耻垢分枝杆菌免疫应答保护力免疫治疗

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构建及鉴定TACO特异性10-23DRz表达载体重组耻垢分枝杆菌

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中华微生物学和免疫学杂志 2011年第2期31卷 150-156页

作者：李俊明王娜罗清方乐黄自坤万腊根张才成南昌大学第一附属医院检验科 330006

目的构建一种可表达特异性10-23脱氧核酶（deoxyribozyme,DZ）的巨噬细胞靶向性细菌载体疫苗,并鉴定其在巨噬细胞表达10-23DZ的能力以及抑制靶基因表达的效果.方法采用亚克隆方法将分枝杆菌复制子oriM克隆入10-23DRz真核表达载体pSDE0... 详细信息

目的构建一种可表达特异性10-23脱氧核酶（deoxyribozyme,DZ）的巨噬细胞靶向性细菌载体疫苗,并鉴定其在巨噬细胞表达10-23DZ的能力以及抑制靶基因表达的效果.方法采用亚克隆方法将分枝杆菌复制子oriM克隆入10-23DRz真核表达载体pSDE01中,获取可在分枝杆菌和真核细胞中穿梭的重组质粒pSDE02.在前期研究基础上选择一有效的针对巨噬细胞taco基因的10-23DZ--DZ1,根据DZ1序列设计并制备DZ1的双链表达序列,插入pSDE02中获取重组质粒pDZM01.将pDZM01经电穿孔方法转化入耻垢分枝杆菌Ms1-2c株构建重组耻垢分枝杆菌rMS-DZ1.分别采用Ziehl-Heelson染色法和直接荧光观测法鉴定重组耻垢分枝杆菌的巨噬细胞靶向性.用rMS-DZ1感染巨噬细胞株RAW264.7,分别于感染后的24 h和48 h采用斑点杂交方法检测rMS-DZ1在巨噬细胞中表达DZ1的情况,再分别采取RT-PCR和免疫印迹方法检测巨噬细胞TACO表达的差异.结果限制性内切酶酶切、菌落PCR及测序结果显示pSDE02、pDZM01和rMS-DZ1构建成功.rMS-DZ1感染RAW264.7细胞后24 h和48 h,经点杂交方法均检测到了DZ1的表达.半定量RT-PCR和免疫印迹检测结果显示,与未感染组比较,rMS-DZ1感染后24 h和48 h时巨噬细胞TACOmRNA分别下降了67.90%和57.14%,TACO蛋白水平分别下降了53.85%和68.92%.同时,表达对照寡脱氧核糖核苷酸DZ1U的重组耻垢分枝杆菌rMS-DZ1U感染RAW264.7细胞后,其TACOmRNA和TACO蛋白水平与未感染组比较均无明显差异.结论本研究成功构建了一种可表达特异性10-23DZ的巨噬细胞靶向性重组耻垢分枝杆菌的载体,可在巨噬细胞内表达并抑制相应靶基因的表达,可作为研制治疗用疫苗的基础,这也是国内外首次报道可表达10-23DZ的细菌性载体.

关键词： 10-23脱氧核酶重组耻垢分枝杆菌巨噬细胞

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表达结核杆菌ESAT-6基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其功能研究

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南方医科大学学报 2006年第7期26卷 923-926页

作者：李岩鲍朗张会东李娅莎朱海龙四川大学华西医学中心基础与法医学院感染免疫研究室四川成都610041

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV-ESAT6,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,用电穿孔法将... 详细信息

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究。方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV-ESAT6,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc2155中。以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组(P<0.05)。结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础。

关键词： ESAT-6 大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒重组耻垢分枝杆菌巨噬细胞

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结核分枝杆菌Rv0901基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其细胞作用

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中华微生物学和免疫学杂志 2007年第2期27卷 151-154页

作者：钟琪鲍朗吴悦涵李岩王晓樱商正玲张会东四川大学华西医学院感染免疫研究室成都610041

目的对结核分枝杆菌Rv0901基因的功能进行研究。方法以PCR扩增Rv0901基因编码序列，定向克隆人穿梭表达质粒pMV261获得重组穿梭表达质粒，将重组质粒电穿孔进入耻垢分枝杆菌，构建重组Rv0901基因的耻垢分枝杆菌，对重组耻垢分枝杆菌... 详细信息

目的对结核分枝杆菌Rv0901基因的功能进行研究。方法以PCR扩增Rv0901基因编码序列，定向克隆人穿梭表达质粒pMV261获得重组穿梭表达质粒，将重组质粒电穿孔进入耻垢分枝杆菌，构建重组Rv0901基因的耻垢分枝杆菌，对重组耻垢分枝杆菌进行诱导表达，用SDS-PAGE检测表达结果。比较耻垢分枝杆菌和重组耻垢分枝杆菌对THP-1细胞的不同作用。结果成功构建重组穿梭表达质粒及重组Rv0901基因的耻垢分枝杆菌，重组菌诱导THP-1细胞的凋亡率高于耻垢分枝杆菌，其感染THP-1细胞后细胞的存活率低于耻垢分枝杆菌的感染，重组菌感染THP-1细胞后细胞培养液中NO（一氧化氮）的产生高于耻垢分枝杆菌的感染。结论 Rv0901基因可能与结核毒力存在一定关系。

关键词：结核分枝杆菌 Rv0901基因重组耻垢分枝杆菌

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结核Rv1246c-Rv1247c基因重组耻垢分枝杆菌及其编码蛋白功能的初步研究

结核Rv1246c-Rv1247c基因重组耻垢分枝杆菌及其编码蛋白功能的初...

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作者：商正玲四川大学

学位级别：博士

结核病是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一种慢性传染病，已困扰人类数千年。尽管目前的正规联合治疗方案（DOTS）取得良好的效果，但与其他感染性疾病相比，该病的治疗存在病程迁延、易复发的问题。资料表... 详细信息

结核病是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一种慢性传染病，已困扰人类数千年。尽管目前的正规联合治疗方案（DOTS）取得良好的效果，但与其他感染性疾病相比，该病的治疗存在病程迁延、易复发的问题。资料表明全球大约有1/3的人口具有结核分枝杆菌的潜伏感染，随着社会老龄化、HIV感染和耐药菌株的流行，这一问题日渐突出，成为人类防治结核病的重要“瓶颈问题”。结核分枝杆菌的持留状态或称持留菌（Mycobacterial tuberculosis persister）被认为是结核病病程迁延、复发的根本原因。因此，探索MTB长期持留的分子机制，寻找抗结核潜伏感染的有效途径将为人类战胜结核病带来新的希望。目前关于结核分枝杆菌持留状态的分子生物学机制众说纷纭。近年在原核生物染色体基因组上广泛存在被认为参与原核生物基因表达质量控制的TA系统（Toxin-antitoxin model）可能与细菌在压力因素下的长期存活密切相关。Gerdes等通过比较基因组学方法发现在结核杆菌H37Rv株中含有38个TA loci，其中包括3个relBE位点。但关于这些基因在结核分枝杆菌中的生物学意义国内外鲜见报道。因此对这些未知功能的假想蛋白基因进行研究不仅对结核分枝杆菌后基因组学的研究增添实验资料，而且可能对深入认识、理解结核杆菌持留状态的分子生物机制提供新的研究方向。本研究在文献资料和生物信息学分析的基础上以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，首次对结核分枝杆菌Rv1246c和Rv1247c基因进行克隆和融合表达，并构建了pMV-relBE（含Rv1246c-Rv1247c重叠基因）大肠杆菌—分枝杆菌重组表达穿梭质粒，用电穿孔方法将该质粒导入快速生长型非致病性耻垢分枝杆菌mc2155株，并对该重组菌在体外压力环境和巨噬细胞内的存活情况及对巨噬细胞功能影响进行实验研究，初步探索目的基因在菌体存活、繁殖速率以及抵抗体内外环境压力等方面的功能；同时利用酵母双杂交系统，在酵母细胞体内观察Rv1246c-Rv1247c基因编码假想蛋白间的相互作用，为研究该对基因是否具有TA系统抗毒素—毒素通用模式提供实验依据。以重组耻垢分枝杆菌MCBE（负载Rv1246c-Rv1247c重叠基因）和MC261（负载pMV261空质粒）为实验对象，在体外营养丰富，培养条件适宜的环境下监测细菌的生长曲线，表明二者增殖特性相似，外源基因在该条件下不影响正常耻垢分枝杆菌的生长。在与上述相同培养条件下分别施加不同时间的热压力（53℃）和酸压力（pH 4.0），通过对不同压力时间处理后细菌CFU（克隆形成单位）变化的统计分析，推测结核Rv1246c-Rv1247c基因具有在体外压力环境中使菌体增殖延缓、通过调整菌体生长代谢状态以对抗环境压力的分子功能。感染小鼠ANA-1巨噬细胞的实验表明：与对照组相比较，负载Rv1246c-Rv1247c重叠基因的重组耻垢分枝杆菌MCBE感染巨噬细胞后其胞内繁殖速度较缓慢，且表现为触发感染细胞凋亡的能力较弱及刺激细胞明显活化反应相对迟缓的现象。酵母双杂交实验表明结核Rv1246c和Rv1247c基因编码的假想蛋白在酵母细胞内可以相互作用，推测二者具有TA系统抗毒素—毒素蛋白共同的胞内天然复合体形式。综上所述，本研究从生物信息学角度推测结核分枝杆菌Rv1246c和Rv1247c基因编码的假想蛋白属于原核生物TA系统relBE家族；构建能够表达Rv1246c和Rv1247c基因编码假想保守蛋白的重组耻垢分枝杆菌能较对照组更易对抗体内外压力及抵御小鼠巨噬细胞活化、凋亡等作用，酵母双杂交系统明确二者具有胞内相互作用的功能，初步证实结核分枝杆菌Rv1246c-Rv1247c基因具有TA系统relBE家族压力反应元件的功能，在国内外尚属首次报道。本研究为研究结核分枝杆菌基因组TA系统的功能提供重要的实验资料，为探索结核杆菌菌体持留状态的分子机制提供了新的研究思路。

关键词：结核分枝杆菌持留状态 TA系统重组耻垢分枝杆菌巨噬细胞

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表达Ag85A-IL-17A重组耻垢分枝杆菌构建及抗气道炎症反应机制

表达Ag85A-IL-17A重组耻垢分枝杆菌构建及抗气道炎症反应机制

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作者：陈凌上海交通大学

学位级别：博士

气道炎症反应是多种呼吸系统疾病的共同病理特征,主要包括感染性气道炎症反应和过敏性气道炎症反应。肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是呼吸系统最常见的感染病原体,其感染后气道炎症反应以中性粒细胞浸润为主。哮喘则是以气道炎... 详细信息

气道炎症反应是多种呼吸系统疾病的共同病理特征,主要包括感染性气道炎症反应和过敏性气道炎症反应。肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是呼吸系统最常见的感染病原体,其感染后气道炎症反应以中性粒细胞浸润为主。哮喘则是以气道炎性细胞浸润、气道高反应性和气道黏液分泌增加等为特征的过敏性疾病,中性粒细胞在其病理过程中也发挥重要作用。目前研究发现,Th17细胞及其分泌的细胞因子IL-17A、IL-17F等在以中性粒细胞浸润为特征的气道炎症反应中发挥关键作用。因此,拮抗IL-17A和IL-17F的功能成为抑制气道炎症反应的重要途径。我们对IL-17A和IL-17F与肺炎链球菌感染所致气道炎症反应的关系进行了实验研究,并在此基础上进一步研究IL-17A和IL-17F与过敏性气道炎症反应的相互关系。根据Lanre Delavallée的理论,当自身蛋白与外源性蛋白结合,通过外源性蛋白提供Th细胞抗原表位,可激活T-B细胞反应,活化B细胞,产生抗自身蛋白的抗体。因此,我们设想若在体内诱导产生抗IL-17A和IL-17F的自身抗体,抑制IL-17A和IL-17F的功能,可望有效减轻气道炎症反应。耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)无致病性,且具有免疫调节功能,是基因工程疫苗的常用载体。Ag85A是卡介苗(BCG)免疫原性较强的分泌蛋白复合体Ag85的组分之一,能够促进Th1型免疫反应。本实验拟构建重组耻垢分枝杆菌疫苗,以Ag85A为外源性蛋白提供Th细胞抗原表位,在小鼠体内诱导产生抗IL-17A和IL-17F自身抗体,研究其抗气道炎症反应的相关机制。目的:构建表达Ag85A-IL-17A/F重组耻垢分枝杆菌r MS-Ag85a-IL-17a/f,体内诱导产生抗IL-17A和IL-17F自身抗体,并探讨其抗气道炎症反应相关机制。方法:本实验拟分三步进行:(1)r MS-Ag85a-IL-17a/f的构建及体内诱导自身抗体产生:利用分子克隆技术,将Ag85a-IL-17a/f基因片段克隆至穿梭表达载体p MFA42S中,构建获得重组质粒p MFA42S-Ag85a-IL-17a/f,并电转化至耻垢分枝杆菌中,获得r MS-Ag85a-IL-17a/f。经Western blot鉴定蛋白表达。以重组耻垢分枝杆菌鼻腔黏膜免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清中抗IL-17A和IL-17F自身抗体的滴度以及肺组织匀浆中IL-5、IL-12和IL-17A等细胞因子的浓度;RT-PCR法检测肺组织中转录因子T-bet和GATA3的m RNA表达情况。HE染色观察小鼠肺组织病理改变。(2)r MS-Ag85a-IL-17a的体外功能研究:r MS-Ag85a-IL-17a体外感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,以MS为对照组,观察r MS-Ag85a-IL-17a对巨噬细胞凋亡、吞噬功能的影响,Griess法检测细胞培养上清中NO的分泌情况,ELISA法检测细胞培养上清中IL-6、MIP-1α、TNF-α、IL-10的分泌水平,RT-PCR法检测细胞内IL-6、IL-10、Defb-2及i NOS的m RNA表达情况。(3)r MS-Ag85a-IL-17a抗哮喘小鼠气道炎症反应机制的研究:构建小鼠哮喘模型,以r MS-Ag85a-IL-17a鼻腔黏膜免疫干预。实验动物分为PBS组,哮喘组,重症哮喘组,重症哮喘+MS组和重症哮喘+r MS-Ag85a-IL-17a组。瑞吉染色计数小鼠肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数及细胞分类计数,并测定BALF中髓过氧化物酶(MPO)活力,HE及PAS染色观察小鼠肺组织病理改变,ELISA法测定BALF及脾细胞培养上清中细胞因子IL-5、IL-6、IL-12、IL-10、IL-13和IL-17A的浓度,流式细胞术检测脾脏INF-γ+Th1细胞及IL-4+Th2细胞的含量,RT-PCR法检测肺组织中IL-6、IL-10、IL-23、Eotaxin-1、MIP-2、TGF-β、T-bet、GATA3和RORγt的m RNA表达情况。结果:(1)重组质粒p MFA42S-Ag85a-IL-17a经测序及酶切鉴定正确,质粒电转化耻垢分枝杆菌获得r MS-Ag85a-IL-17a,Western blot鉴定其表达融合蛋白Ag85A-IL-17A,该融合蛋白与抗IL-17A抗体特异性结合。r MS-Ag85a-IL-17a鼻腔黏膜免疫小鼠,可诱导产生抗IL-17A自身抗体,免疫后第1周血清中开始出现自身抗体,第3周到达峰值,有效滴度可维持4周以上。r MS-Ag85a-IL-17a降低小鼠肺组织匀浆中IL-5和IL-17A的水平,提高IL-12的水平;上调肺组织T-bet的表达。r MS-Ag8

关键词：重组耻垢分枝杆菌白介素-17A 自身抗体气道炎症反应

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重组耻垢分枝杆菌-Sj26GST疫苗有关毒性实验研究

引用

华南预防医学 2002年第5期28卷 44-45页

作者：胡佳杰文学明肖爱清皇甫永穆湖北药检高等专科学校检验系微生物学及免疫学教研室湖北药检高等专科学校检验系微生物学及免疫学教研室430064 湖北省疾病预防控制中心华中科技大学同济医学院医学分子生物学研究室

目的初步研究重组耻垢分枝杆菌-Sj26GST疫苗对小鼠的有关毒性作用。方法用重组耻垢分枝杆菌-Sj26GST疫苗免疫雄性BALB/c小鼠,16周后,称小鼠体重,摘眼球取血,测定小鼠的淋巴细胞、血红蛋白、白细胞及血小板含量;剩余血离心得到血清,测... 详细信息

目的初步研究重组耻垢分枝杆菌-Sj26GST疫苗对小鼠的有关毒性作用。方法用重组耻垢分枝杆菌-Sj26GST疫苗免疫雄性BALB/c小鼠,16周后,称小鼠体重,摘眼球取血,测定小鼠的淋巴细胞、血红蛋白、白细胞及血小板含量;剩余血离心得到血清,测定小鼠肌酐及ALT;处死小鼠,分离出肺、肾、肝,并分别测定其重量。结果重组耻垢分枝杆菌-Sj26GST疫苗免疫的小鼠,其淋巴细胞数较对照组高(P<0.05),且在正常范围之内;小鼠体重、各脏器重量、各血象指标及血清肌酐和ALT含量与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。结论重组耻垢分枝杆菌-Sj26GST疫苗免疫小鼠后对小鼠无系统毒性作用。

关键词：重组耻垢分枝杆菌实验研究 rMc-Sj26GST疫苗毒性作用结核病

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